Name: surgical procedures and methodology for a preclinical murine model of de novo mammary cancer metastasis
Uploaded: 2017-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
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著者たちは、組織病理学的支援のためのジョー・ヒル、手術技法指導のジョン・グリースティン博士、ビデオ撮影支援のためのテッサ・ダイエル、重要な洞察と議論のためのウォン・クーセンズ研究所の全メンバー、財政支援のためのOHSU騎士癌研究所に感謝する。著者らは、TEGGM071388-10およびT32CA106195-11からCEG、NCI / NIH、国防乳癌研究プログラム、スーザンGコメン財団、乳がん研究財団、およびスタンドアップトゥーガン - ラスガルテン財団への支援を認めている膵臓癌コンバージェンスドリームチーム翻訳研究グラント（SU2C-AACR-DT14-14）を、LWMC、女性ヘルス・サークル・オブ・ヘルス・ファンデーション・オブ・ヘルス・グラント、MHWおよびLMCに対するBrenden-Colson膵臓ヘルス・センターに寄贈しました。

以下のプロトコルで使用される動物は、動物福祉法規制および公衆衛生サービス（PHS）ポリシーに準拠するように設計された、オレゴン保健科学大学の施設内動物管理および使用委員会（IACUC）の対象となります。 滅菌条件の維持：滅菌済みの器具を使用し、マウス間で滅菌ガーゼで拭き取り、PBSですすぎ、次に消毒剤70％エタノールで少なくとも15分間滅菌する必要があります。生存手術のためには、外科用キャップ、フェイスマスク、ガウン、手袋を着用する必要があります。生存手術のための動物の手術前の準備は、以下のプロトコールに含まれる。試薬および機器のリストについては、表1を参照してください。 原発性乳腺腫瘍からの単細胞浮遊液の分離および調製<ol><li>ドナーの雌100日齢のトランスジェニックMMTV-PyMT（FVB / n）マウスに麻酔をかけ、c2％イソフルランを麻酔マスクを介して投与することにより、連続的な鎮静を行う。フットピンチ反射がない状態でマウスが正しく麻酔されていることを確認します。 </li><li>滅菌設定では、100日齢のトランスジェニック雌性MMTV-PyMT（FVB / n）マウス由来の原発性乳腺腫瘍を、無菌ハサミを用いて上皮および周囲の脂肪組織および/またはリンパ節から乳房腫瘍を分離することによって切除する。頸部脱臼により麻酔したマウスを安楽死させる。 </li><li> 滅菌はさみまたはメスを使用して、原発腫瘍を手動で小片（約1.0mm 3 ）に切ります。腫瘍片を3.0mg / mLのコラゲナーゼAおよび4.0U / mLのDNアーゼIをDMEMに溶解したものに入れる。直径1.0cmの腫瘍あたり約10mLの上記消化培地を使用する。 <ol><li> 〜125rpm、37℃で40分間無菌攪拌棒を用いて滅菌25mLボトルで消化を行います。 </li></ol></li><li>ウシ胎児血清（FBS）を最終希釈10％に加えて消化を停止し、混合物全体をwそれは維持されています。 </li><li>消化した腫瘍懸濁液を0.7μmのナイロンストレーナーで50mLコニカルチューブに濾過し、ストレーナーに残っている腫瘍を捨てる。 4℃で300 xgで上清を遠心分離する。 </li><li>ペレットを1.0cmの腫瘍あたり10mLのDMEMに再懸濁し、0.7μmのナイロンストレーナーで再濾過する。細胞濃度を数え、4℃で300 xgで遠心分離します。 </li><li>ペレットを2×10 7個/ mLの濃度で90％FBSを含む10％ジメチルスルホキシドに再懸濁する。 -80℃で全原発腫瘍の単細胞懸濁液を保存する。 </li></ol> 2.乳腺腫瘍の同所性注射<ol><li>凍結したペレットを極低温チューブから20mLのDMEMに放出し、細胞を計数するまで37℃で凍結した原発腫瘍懸濁液を部分的に解凍する。 4℃で300 xgで遠心分離し、1：1 DMEM：増殖因子で還元された基底膜調製物eで細胞を再懸濁する。Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫から1×10 7細胞/ mLの濃度で採取した（ 表の表を参照）。 </li><li>麻酔をかけたレシピエントの同系マウスの腹側を上に置き、麻酔マスクを介して2％イソフルランを投与することにより、連続鎮静下に維持する。 </li><li>エアロゾル化した70％エタノールを使用して右第4乳腺注射部位を滅菌し、ポリ（ビニルピロリドン） - ヨウ素を滅菌綿棒で塗布する。 </li><li> 29 G 0.3 mLインスリン注射器を使用して、6〜10週齢の女性のFVB / nマウスの右胸部第4乳腺に100μL（凍結原発腫瘍懸濁液から1×10 6個の生存細胞）を斜面側に注入する。 </li></ol> 3.同所性乳腺腫瘍の外科的切除<ol><li>腫瘍細胞注入の38〜60日後、172〜450mm 3の範囲の同所性腫瘍体積を示さないマウスを安楽死させる[長さx（幅2 </）/ 2]（注射したマウスの約75％）。 </li><li>麻酔マスクを介して2％イソフルランを投与することにより、連続鎮静下で適切な腫瘍サイズの腹側を上にして麻酔したマウスを配置し、マウスが不足足ピンチ反射で適切に麻酔されていることを確認する。鎮静下での乾燥を防ぐために、眼に獣医軟膏を塗布する。 </li><li>原発腫瘍を取り囲む手術領域を滅菌するために70％エタノールをスプレーし、ポリ（ビニルピロリドン） - ヨウ素を滅菌綿棒で塗布する。 注：外科部位での脱毛は〜5％のマウスの皮膚擦過傷および/または感染をもたらし、したがってこの工程から除外した（データは示していない）。 </li><li> 図1Cに示すように、腫瘍の内側尾の鈍いはさみを使用して、最初の皮膚切開を行う。 </li><li>次に、腫瘍の内側の皮膚（ 図1C ）の優れた切除を行う。任意の血管系を焼灼する必要性に注意を払う切開部を拡張する前に皮膚上に位置する腫瘍を切除する。 </li><li>横方向（腫瘍の後方）で皮膚切開を継続し、優れた皮膚切除（腫瘍に対して側方）および内側切除（腫瘍に対して優位）を行う（ 図1C ）。 </li><li>皮膚を腫瘍の周りに円周方向に切除した後（ 図1C ）、腫瘍に付着した皮膚を鉗子で持ち上げ、腹壁筋肉から腫瘍を摘出し、乳腺をそのままにする。 </li><li> 第 4および第 5乳腺を通っている大きな血管を（鈍的な切開によって）同定し、焼灼する。 </li><li>焼灼部位で4 番目と5 番目の乳腺のおよそ半分を切除して、腫瘍、上皮、および乳腺のセグメントを解放する（ 図1C ）。 </li><li>出血の場合は、積極的に出血を確認するすぐにそれらを焼灼する。 250μL以上の血液が失われた場合は、マウスを研究から除外し安楽死させる。 </li><li>創傷クリップアプライヤを用いて創傷クリップを用いて切除部位を閉じる（ 図1C ）。 注：創傷クリップ除去剤で外科手術の10日後に創傷クリップを除去する。 </li><li> 暖かい滅菌生理食塩水を皮下に投与し（動物の体重の4％）、加熱ランプで暖かい動物を保つ。麻酔からの回復の間、動物を5〜10分ごとに点検する。 注：ブピバカインまたはリドカインの投与は術後死亡率を増加させた（データは示さず）。手術後1時間で、痛みの徴候を示すマウス（鈍感、動かない、身づくろい）を安楽死させた。 <ol><li>マウスが完全に回復したら、それを他のマウスの会社に戻します。 </li></ol></li></ol>フローサイトメトリーおよび組織学のための血液および肺の単離および処理 &lt;ol&gt; <li>研究のエンドポイントでは、必要に応じて様々な組織病理学的評価のためにマウスを準備する。安楽死の90分前に、各マウスに1x PBS中6.25μg/μLの濃度のブロモデオキシウリジン（BrdU、50μg/ gマウス重量）の腹腔内注射を行う。 注：溶解したブロモデオキシウリジンの凍結ストックは、調製後1ヶ月以内に使用する。 </li><li>マウスを麻酔した後、安楽死の10分前に、ヘパリン処理された毛管を用いて眼窩後血液（&gt;500μL）を収集し、続いて氷上に保持されたEDTA二カリウムで被覆したチューブに移す。 </li><li>肺および残りの乳房組織を除去するために、胸郭および腹腔（ 図2A）を露出させ、また、乳房番目の残りの右4 番目と5を露出させるために横方向に皮膚を剥離するために口に下腹部からハサミで正中切開を行います腺。 </li><li>残りの乳腺組織を切除し、iを検査する。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色（ 補助的な 図1 ）による連続切片ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織を評価することにより、原発腫瘍再増殖を除外する。 </li><li>肺を除去するには、はさみで隔壁に隔壁を開き、肺の灌流の前に血液を排出するために腹部大動脈を切断して動物を安楽死させる（ 図2B -2C ）。 </li><li>肺と心臓を避けるように腹部アプローチから胸郭に沿って横隔膜を切る。次に、胸郭の側面を切断して胸郭を露出させます （ 図2D ）。 </li><li> 20mLシリンジで23ゲージの針を使用し、肺が完全に白くなるまで心臓の右心室を通して約5​​.0mLのDPBS（約10mL /分）で肺を灌流する（ 図2E -2F ）。メインの船からすぐに心臓を切り離す血液は肺に再灌流しません。 </li><li>肺組織を固定し、組織病理学的評価のために処理されるために、23ゲージ針（ - 2H 図2G）を使用して肺に向かって露出した気管ベベル側に4℃〜1.0mLの10％ホルマリンを注入します。肺が完全に拡張され、固定剤で満たされると注射を止める（ 図2I ）。 </li><li>標準的な組織病理学的手順に従って、その後のパラフィン包埋またはOCT凍結培地のために、中空緩衝ホルマリン中の肺組織を気管から排出し、エマルジョンで固定する。 </li><li> FFPE肺組織の連続切片化により肺における転移性負荷を定量的に評価し、H＆E染色（ 図1B ）によってミクロトーム切片（100μm、13切片）を評価する。 </li></ol>

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著者らはここに提示されたデータとの矛盾については開示していない。

変更とトラブルシューティング： 鈍的な腫瘍を腹壁から摘出するとき、腫瘍は腹壁に付着したままである可​​能性がある。これは腫瘍を注射したマウスの5％未満で観察された（データは示さず）。腹壁に付着した腫瘍を有するマウスの場合、原発腫瘍の再増殖なしには切除が困難であるため、マウスを安楽死させるべきである。 <str...

北アメリカの女性は、乳がん2を発症する生涯リスクが〜12％です。これらの個体の大多数は、手術により摘出された原発腫瘍を有し、がんサブタイプに応じて、アジュバント設定3で標的、内分泌、化学療法および/または放射線療法を受ける。何の標的療法は、トリプルネガティブ腫瘍の3のためにまだ利用できないのに対し、例としては、放射線/化学療法とHER2標的治療を受けたHER2陽性腫瘍を抗エストロゲン療法と女性を受けるホルモン受容体陽性癌と診断された女性が含まれます。外科的切除を補完する放射線、化学療法、パーソナライズされたホルモン療法の進歩にもかかわらず、病気はステージIIまたはIIIの病気と診断された女性の30〜70％で再発する4 、遠隔臓器における転移性疾患の根絶には効果がほとんどない肺、骨、b雨および/または肝臓5 。これは、転移性疾患が原発腫瘍再増殖の不在下で起こる場合、これは、播種性悪性細胞が確定手術の時点で二次臓器にすでに存在している可能性があることを意味するので、特に重要である。したがって、転移性腫瘍の根絶または緩徐化が可能な治療法が急務である。 乳腺発がんの新規のマウスモデルは、腫瘍性の進行1を制御するメカニズムを明らかに著しく有益であったが、既存のモデルにもいくつかの制限があります。これらのうちの1つは、 新規のトランスジェニックモデルが典型的には、原発腫瘍負荷が研究の期間を制限する複数の乳腺において原発腫瘍を発症するという事実である。原発腫瘍細胞の逃避および転移播種は、これらのモデルにおける新生物の進行の早期に起こる可能性が高いが、転移性腫瘍の率直な発達は遅く起こり、マウスモデルと株のバックグラウンドは、しばしば部分的に浸透している1 。これは、二次器官における転移を制御する分子の発見のための新規モデルの有用性をさらに制限し、アジュバント設定における治療薬の臨床前の有効性を評価するためにさらに制限する。 これらの制限を回避するために、我々は、肺への乳癌の転移の新たな土着モデルを開発しました。後期デノボ乳腺腫瘍を担持（FVB / N本明細書に記載の研究のための株バックグラウンドで、すなわち 、MMTV-PyMT）親トランスジェニック雌は〜100日6歳であり、それらの原発腫瘍をその時点で外科的に切除し、酵素的に解離されています単一細胞懸濁液。単一の原発性乳腺腫瘍が38〜60日の期間に亘って発生する6〜7週齢のレシピエント同系雌性マウスに懸濁液（1×10 6細胞）を順化させる3 ）で、レシピエントマウスを麻酔し、原発腫瘍を外科的切除して、外科手術部位での腫瘍再増殖を最小限に抑え、女性の手術と一致させる（ 補足図1 ）。 FVB / n株のバックグラウンドでは、マウスは手術後約115日までに45％の浸透率を有する肺で組織学的に検出可能な転移病巣を発症する（ 図1B ）。転移腫瘍増殖の延長された潜伏期間により、このモデルは、補助的治療の送達、および原発腫瘍の外科的除去後の転移性進行に影響を及ぼす基礎となる生物学の解明および評価のために独特に位置付けられる。

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td>Prescription order</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pyrex bottle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS139525</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Bio&amp;nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0.7 &amp;micro;m nylon strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor-reduced Matrigel&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td>Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma</td></tr><tr><td>Poly(vinylpyrrolidone)&amp;ndash;Iodine complex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>29 gauge 0.3 mL insulin syringe</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Small Vessel Cauterizer Kit</td><td>FST</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wound clips</td><td>Texas Scientific</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip applier&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip remover&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine</td><td>Roche</td><td>10280879</td><td></td></tr><tr><td>Heparinized capillary tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer tubes with dipotassium EDTA&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>OCT-freezing medium&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608930</td><td></td></tr><tr><td>Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)</td><td>Fisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>23g needle</td><td>Fisher</td><td>14-826-6B</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n mouse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>001800</td><td></td></tr></tbody></table>

surgical procedures and methodology for a preclinical murine model of de novo mammary cancer metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

MMTV-PyMTマウス由来の原発性乳腺腫瘍由来の1×10 6細胞を受けるレシピエントマウスの75％超が、38〜60 日以内にサイズが172〜450mm 3の単一の乳腺腺癌を発症する（データ示さず）。無作為化の可能性のあるマウスを、次に示されるように原発腫瘍の外科的切除後に研究グループに登録する（ 図1C ）。原発腫瘍の外科的切除?...

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

乳癌の転移を標的としたアジュバント療法を評価する前臨床モデルは欠けている。これに対処するために、本発明者らは、アジュバント設定（原発腫瘍の外科的切除後）で投与された治療が、以前に播種された肺転移に影響を及ぼす有効性について評価され得る、 新規な肺乳腺腺癌転移のマウスモデルを開発した。

前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論<em&gt;デ・ノヴォ</em&gt;乳がん転移

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

13.8K ビュー.  Oregon Health & Science University. 乳癌の転移を標的としたアジュバント療法を評価する前臨床モデルは欠けている。これに対処するために、本発明者らは、アジュバント設定（原発腫瘍の外科的切除後）で投与された治療が、以前に播種された肺転移に影響を及ぼす有効性について評価され得る、 新規な肺乳腺腺癌転移のマウスモデルを開発した。 

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A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

がん研究

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

マウス乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種注入

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

虚血多灌流損傷の設定における転移性肝腫瘍のマウスモデル

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

乳癌の新規トランスジェニックマウスモデル：アデノ-Creを持つ乳管上皮の標的とすることにより、転移性乳癌の開始

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

医学

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

肝転移の前臨床マウスモデル

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

自発的乳がん転移の同所性マウスモデル

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

マウス実験転移性乳癌癌モデルを生成、およびマウス乳癌根治術を実行

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論

要約

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