The authors thank Drs. Jeffrey Bloomquist and Daniel Swale for their technical comments and suggestions. This project was partially funded by the Department of Entomology and the College of Agriculture and Life Sciences at Virginia Tech.

איסוף 1. הכנת הנבדקים מבחן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את המספר המתאים של דבורים מהמושבה. הערה: המספר הדרוש תלוי לא רק את הגודל וההיקף של הניסוי, אלא גם את המיומנות של החוקר. לדוגמא, אם יש 2 קבוצות טיפול עם גודל מדגם רצוי של 10 דבורים לכל קבוצה, חוקר מיומן סביר עשוי לאסוף לפחות 30 דבורים לתת דין וחשבון על וניתוחים מוצלחים בסופו של דבר עם 20 קטעי וידאו שימושיים להבקיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יקטין את כמות הזמן שעובר בין איסוף לנתיחה. הערה: למרות דבורים ניתן שוכן במעבדה במשך ימים לפני לנתיחה, שיעור ההצלחה של וניתוחים (כלומר, הסיכוי של שמירה על קצב לב יציב בתוך כלי הגבה גזור) נצפה ירידה ביחס לכמות זמן דבורים שוכנות במרחק מהמושבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספק דבורים עם מקור מים ומזון תוך שוכן במעבדה. עבור EXAmple, לכל הפחות, לספק גישה 50% (w / v) של סוכרוז במים (זה מספיק עבור משכי זמן של פחות מ -6 שעות). לפרקי זמן ארוכים יותר, לספק דבורים לגשת לדבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבורי הבית למשך הלילה במעבדה בטמפרטורה של כ -32 מעלות צלזיוס, 60-80% לחות יחסית כדי להפחית את הלחץ ולמנוע התייבשות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לנתיחה, להרדים דבורים בקצרה כדי לסייע בטיפול. הערה: זה יכול להפחית את שיעור ההצלחה של וניתוחים ולצמצם תפוקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל הדבורים או על ידי הצבת אותם על הקרח או לתוך מקרר ובמשך מספיק זמן כדי להפחית התנועה על מנת לסייע בטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לחשוף דבורים בקצרה CO 2 על מנת לסייע בטיפול. הערה: חשיפה ממושכת לקור יכולה להפחית את השיעור וניתוחי ההצלחה. Extended או חשיפה חוזרת כדי CO 2 יכול גם להפחית את שיעור ההצלחה של וניתוחים. </li></ol></li></ol> 2. Dissectionהגבה בטן קיר הערה: דבורים צריכים להיות בחיים בזמן הניתוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים ו / או מספרי microdissection, להסיר רגליים וכנפיים כדי להקל דיסקציה של הבטן. שמור מבחנה קטנה או מכל דומה מלא מים מזוקקים הסמוכים לצורך שטיפת מכשירים בין וניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הרחקת הדבורה עם מלקחיים, לנצל את מספרי microdissection לחתוך רוחבי לאורך דופן הבטן מגבה בין tergites הראשון והשני (ראה איור 1). </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig1.jpg" /> איור 1: תצוגת הגבי של בטן דבורה. החתך הראשוני צריך להתבצע בין tergites הראשון והשני, כמו כונה על ידי הקו האדום. סרגל קנה מידה = 1 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ אותה</a>דואר כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד בקלילות ונאחזת בזיז האחורי של tergite השני עם מלקחיים, לחתוך longitudinally לאורך כל צד של הדבורה מן החתך הראשוני על העוקץ (ראה איור 2). היזהר בעת החיתוך כדי למנוע ניקוב מערכת העיכול. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig2.jpg" /> איור 2: נוף צדדי של בטן דבורה. החתכים השניים ושלישיים צריכים להיעשות משני צדי הבטן, כמו כונו על ידי הקו האדום. סרגל קנה מידה = 1 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את המספריים עבור סט שני של מלקחיים בסדר לנצל אותם כדי להפריד את דופן הבטן הגב בזהירות משאר of הבטן. הוצא בעדינות את העוקץ וכל חלק של מערכת העיכול כי נשאר מחוברת דופן בטן הגב. הימנע פקיעת במעיים, כמו תוכן יכול לצפות את דופן הבטן ואת לעכב הדמיה של כלי הגבי. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig3.jpg" /> איור 3: מראה כללי של כלי הגבה. לאחר במעיים העוקצים הוסרו, הכלי הגבה גלוי לאורך קו האמצע של דופן הבטן מגבה הגזורה. סרגל קנה מידה = 1 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדר את דופן הבטן גב בכיוון הרצוי מתחת המצלמה כך הכלי הגבה גלוי (ראה איור 3). לנצל את מספרי microdissection לקצץ משם כל עודף abקיר dominal כי מעכב להדמיה של הכלי הגבה. הצורה של דופן בטן הגב צריכה להיות דומה כוס או קערה רדודה כאשר ממוקם כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז הכלי הגבה לא להאריך לתוך קטע הבטן האחורי ביותר של הדבורה, להסיר את tergite הסופי על מנת לשפר להדמיה של הכלי הגבה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניצול micropipette נפח מתכווננת, לכסות כלי הגבה עם 10 μl של פתרון איזוטוני כדי לשמור על תנאים פיסיולוגיים להקל דופק יציב. הערה: הפתרון המומלץ הוא רבע כוח בתמיסת רינגר (0.120 g / L סידן כלורי, 0.105 g / L אשלגן כלורי, 0.050 g / L סודיום ביקרבונט, ו 2.250 g / L נתרן כלורי), אשר כבר נמצא כדי להקל על יציבות, דופק רציף. </li></ol> תצפית אפנון 3. Heart Rate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הכלי מגבה לשבת באין מפריע עד פעימה יציבה ורציפה מושגת(בדרך כלל תוך 300 שניות). הערה: Heartbeat היא דמיינה כמו התכווצויות קצובות של הכלי הגבה. בתחילה, ייתכנו נראה כי אין דופק, במיוחד אם הדבורה מורדמת, אבל הלב בדרך כלל יתחדש מכות אחרי מנוחה בתמיסה איזוטונית במשך כמה דקות והוא יכול להמשיך לפעום למשך שעות, בתנאי שהוא נשאר שטוף פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדדו את קצב הלב במונחים של מספר פעימות לדקה (BPM). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספר הצירים שנצפו במהלך תקופה של 60 שניות. השתמש מונה נקודות יד טיימר כדי להקל על תהליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מודדים את השתנות קצב הלב על ידי הקלטה והנצפה BPM לפני ואחרי הטיפול עם תרכובת cardiomodulatory. הערה: למרות הזמן נדרש במציאת השפעה על קצב לב עשוי להשתנות בהתאם למתחם נבדק, שינויים בקצב לב ניתן לבצע בדרך כלל נצפו בתוך דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את קצב לב הבסיס ערבהתוספת של כל מתחם בדיקה. הערה: קצב הלב לאחר הטיפול ניתן בדרך כלל ייקבע לאחר 90 עד 120 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן cardiomodulators פוטנציאל (למשל, octopamine) על ידי המסה במתחם באותו הפתרון איזוטוני נהג להתרחץ כלי הגבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את תרכובות בדיקה לפתרון המקיף הכלי הגבה על ידי ניצול micropipetter. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דיוק רב יותר ותפוקה גבוהה יותר, לבצע הקלטת וידאו של כל נושא בדיקה ולאחר מכן להשתמש קטעי הווידאו כדי לצבור קצב לב במועד מאוחר יותר. הערה: פעולה זו מאפשרת חוקר יחיד מתנודד וניתוחים על מנת להקל כמעט לייצור רציף של קטעי וידאו. בעת הקלטת סרטוני וידאו, אורך המינימום המומלץ הוא כ 240 שניות עם כל תרכובת מבחן להתווסף ב סימן 60 שניות. הדבר מבטיח כי החוקר יש חלון 60 שניות בקיע קצב לב מחקר ולאחר מכן עוד 60 חלון שניות בקיע קצב לב שלאחר טיפול 120 שניותאחרי טיפול. </li></ol>

<ol>
	<li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulatory+Systems.">Circulatory Systems.</a> Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 365-413 (2013).</li><li>League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structural+and+functional+analysis+of+the+larval+and+adult+dorsal+vessel+and+its+role+in+hemolymph+circulation+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae.</a> J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).</li><li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+Hemolymph+Circulation+in+the+Butterfly+Papilio-Machaon+L+Revealed+by+Contact+Thermography+and+Photocell+Measurements.">Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements.</a> J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).</li><li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+circulation+and+tracheal+ventilation+in+holometabolous+insects.">Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects.</a> Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).</li><li>Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heartbeat+Rate+Modulation+Mediated+by+the+Ventral+Nerve+Cord+in+the+Honey-Bee,+Apis-Mellifera.">Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera.</a> J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).</li><li>Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+supply+of+the+heart+and+electrocardiogram+potentials+with+reversed+polarity+in+sleeping+and+resting+honey+bees.">Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees.</a> Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).</li><li>Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine--a+single+modulator+with+double+action+on+the+heart+of+two+insect+species+(Apis+mellifera+macedonica+and+Bactrocera+oleae):+Acceleration+vs.+inhibition.">Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition.</a> J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).</li><li>Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral-Effects+of+Vehicles+-+Dmso,+Ethanol,+Tween-20,+Tween-80,+and+Emulphor-620.">Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620.</a> Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).</li><li>Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+responses+of+the+honeybee+heart+to+nanomolar+concentrations+of+amitraz.">Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz.</a> Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).</li><li>Roeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine+in+invertebrates.">Octopamine in invertebrates.</a> Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).</li><li>Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Drosophila+heartbeat+by+neurotransmitters.">Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters.</a> J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect5 or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel7, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin...

<html> המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא לאפשר לחוקר במהירות ובקלות להתבונן לכמת את ההשפעה כי סוכן תרופתי יש על קצב הלב של דבורי דבש. דבורים, כמו חרקים אחרים, יש מערכת דם פתוחה מפיצת hemolymph, מקבילת החרק של דם, בכל חלל הגוף, המכונה hemocoel. תפוצתו של hemolymph חיוני להובלת חומרים מזינים, גורמי החיסון, פסולת, כמו גם neurohormones ומולקולות איתות אחרות 1. מחזור הוא הקל על ידי כלי הגבי, המשתרע לאורך קו האמצע הגבי של חרקים, כמו גם איברים pulsatile אביזר. הכלי הגבה מחולק לשני חלקים נפרדים מבחינה תפקודית, המיועד בלב בבטן ואת אבי העורקים בבית החזה והראש. התכווצויות מופצות ב hemolymph משאבת הלב לכיוון החזה והראש, בעוד איברים pulsatile אביזר להבטיח זרימת hemolymph בגפיים. ניתן לצפות class = &quot;jove_content&quot;&gt; תפקוד לב חרקים באמצעות מגוון של שיטות, בהתאם לשלב הגודל, פיזיולוגיה, או חיים של החרק. גישה משותפת התבוננות קצב לב זחלים או חרקים קטנים היא השימוש הדמית intravital 2. שיטה זו היא פחות שימושית דבורים בוגרים, אולם, כפי שהוא יכול להיות קשה כדי להציג כלי הגבה בבירור דרך דופן הבטן. גישה הוקמה להקלטת קצב לב במגוון חרקים, דבורים כלל, היא השימוש של תרמוגרפיה קשר, אשר מנצלת תרמיסטורים להחיל את החלק החיצוני של החרקים כדי לזהות פעימות לב 3,4. קצב לב דבורים בוגרות גם נרשם באמצעות טכניקה אלקטרו למדוד 4,5 אות עכבה חשמלית. טכניקה זו דורשת החדרה של אלקטרודות לתוך החיה ליד הלב ושימוש ממיר עכבה להקליט פעימות 4. באופן דומה, אק&quot;ג שמש detect אותות חשמליים המיוצרים על ידי הלב בשילוב עם הקלטת וידאו של הדבורה לצפות לשינויים בפעילות הלב 6. יתרון בולט לגישות אלה הוא כי קצב לב נבחן דבורה שלמה, חייה, ולא בתוך דגימה גזורה, אשר מסייעת להבטיח את הזמינות של המגוון הרחב של תגובות פיסיולוגיות בנושא. האתגרים של גישות אלה כוללים חשבונאי קיבוע או הרדמה של הנושא, את הצורך להגביל משתנה גירויים חיצוניים שעשויים לשנות את קצב לב, כמו גם קביעת שיטת הצגה מתאימה כאשר בודקים סוכנים תרופתיים. גישה נוספת, שבו נעשה שימוש ללימוד פעילות דבורת לב היא לנתח את החרק חלקית כדי לחשוף את הלב, אז למדוד התכווצויות כלי הגבו באמצעות מתמר עקירה בכוח 7. בפרוטוקול זה, בלב טובל הרף עם תמיסת מלח פיזיולוגית ריצה ושיתוף מבחןmpounds יכול להיות מומס פתרון זה עבור יישום לנושא 7. הבדל משמעותי בין שיטה זו לבין אלה שתוארו לעיל הוא כי חוט עצב הגחון מוסר, ומבטל את התפקיד שמערכת העצבים המרכזית הוכחה לשחק ויסות קצב לב 5. התוצאה היא כי דופק הבסיס, שהיא בדרך כלל די יציבה, מייצב בתדר נמוך בהרבה משרעת מ הוא ציין בדרך כלל חרק חי 5,7. מה כל אחת מהשיטות הללו יש מכנה משותף הוא שהם דורשים ציוד מיוחד מאוד ולעתים קרובות יקר, בנוסף לרמה מסוימת של מומחיות, כדי להתנהל. אולי החסרון הגדול הוא שאף אחד גישות אלו גם מתאימים במיוחד לניסויים כרוכים בדיקה של מספר רב של נושאים, כגון הקרנת ספרייה של תרכובות cardiomodulatory הפוטנציאלי. נקודת הכח החזק ביותר של הגישה המתוארת כאןהפשטות היא שלה. הפרוטוקול הוא יחסית קל לשלוט, ההתקנה דורשת שטח קטן, ורק קלט פיננסי מינימלי הכרחי. השיטה מחייבת קצת יותר דבורים כמה, כמה מכשירי ניתוח, פתרון איזוטוני, ואו מיקרוסקופ דיגיטלי או מיקרוסקופ מסורתי עם מצלמה דיגיטלית. דבורים הם גזורים לדמיין כלי הגבה וסרטי וידאו דיגיטלי משמשים כדי להקליט קצב לב לפני ואחרי טיפול עם סוכנים תרופתיים. למרות הקלטת וידאו הוא לא באמת הכרחי כדי לצפות לשינויים בקצב הלב, זה יגביר את התפוקה באופן משמעותי (כלומר, מספר הנבדקים כי ניתן לעבד כמות של זמן נתון). החוקר יכול למקסם את היעילות על ידי הקלטת מספר רב של קטעי וידאו בו-זמנית ולאחר מכן מאוחר יותר הבקיע את סרטי הווידאו האלה בזמן שנוח יותר. יתרון נוסף של גישה זו הוא כי קטעי וידאו לאפשר החוקר להתחיל מחדש, צריך תהליך הניקוד יופרע, ולהקל על נiewer לדעת מה הם מקבלים את הטיפול על מנת לצמצם הטיה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Dino-Lite Edge digital USB microscope</td>
			<td style="width:111px;">Dino-Lite</td>
			<td style="width:119px;">AM4815ZT</td>
			<td style="width:405px;">Any digital microscope or similar setup will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Microscope stand</td>
			<td style="width:111px;">Dino-Lite</td>
			<td style="width:119px;">RK-10</td>
			<td>Any stand appropriate for the digital microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Laptop or PC</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Necessary for digital microscope</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:200px;">Microdissection scissors (Vannas, 8cm, Straight, 5mm Blades)</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">14003</td>
			<td>Any similar scissors suitable for microdissection will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Microdissecting Forceps, 10.2cm, Angled (2 pair)</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">504482</td>
			<td>Any similar forceps suitable for microdissection will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Ringers solution 1/4 strength tablets&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">96724-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Dissecting tray</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any surface suitable for microdissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Single channel 10 &#181;l pipette</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any device capable of accurately delivering 10 &#181;l volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Pipette tips</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Small beaker or container of water</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to rinse instruments between subjects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Hand tally counter</td>
			<td style="width:111px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">295033</td>
			<td>Any similar product will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Timer</td>
			<td style="width:111px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">644219</td>
			<td>Any similar product will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Deionized water</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preparation of Ringers solution and rinsing instruments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and observation of honey bee dorsal vessel for studies of cardiac function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

מאחר ורבים מן הרכיבים פעילים מהבחינה פרמקולוגית שעשויים להיבדק באמצעות פרוטוקול זה אינם מסיסים במים, זה הכרחי כדי לקבל ממס אמין שיאפשר תרכובות בדיקה תועברנה באמצעות הפתרון איזוטוני נהג להתרחץ כלי הגבה. Sulfoxide דימתיל (DMSO) הוא חומר ממיס כי הוא נפוץ כמו...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function at JoVE.com

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

דיסקציה תצפית של כלי דבש דבורים הגבי ללימודים של תפקוד הלב

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

dissection-observation-honey-bee-dorsal-vessel-for-studies-cardiac

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Views.  Virginia Tech. The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Video: Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

בשנת vivo Ca 2 + - הדמיה של נוירונים גוף אינפקטד במהלך הלמידה חוש הריח של דבורת הדבש

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best established model to study how plasticity in lifespan and aging is explained by social factors.
The worker caste of honey bees includes nurse bees, which tend the brood, and forager bees, which collect nectar and pollen. Previous work has shown that brain functions and flight performance senesce more rapidly in foragers than in nurses. However, brain functions can recover, when foragers revert back to nursing tasks. Such patterns of accelerated and reversed functional senescence are linked to changed metabolic resource levels, to alterations in protein abundance and to immune function. Vitellogenin, a yolk protein with adapted functions in hormonal control and cellular defense, may serve as a major regulatory element in a network that controls the different aging dynamics in workers.
Here we describe how the emergence of nurses and foragers can be monitored, and manipulated, including the reversal from typically short-lived foragers into longer-lived nurses. Our representative results show how individuals with similar chronological age differentiate into foragers and nurse bees under experimental conditions. We exemplify how behavioral reversal from foragers back to nurses can be validated. Last, we show how different cellular senescence can be assessed by measuring the accumulation of lipofuscin, a universal biomarker of senescence.
For studying mechanisms that may link social influences and aging plasticity, this protocol provides a standardized tool set to acquire relevant sample material, and to improve data comparability among future studies.

In honey bee workers, aging depends on social behaviors rather than on chronological age. Here we show how worker-types with very different aging patterns can be obtained and analyzed for cellular senescence.

קבלת דגימות עם מואט, מואצת והפוך הזדקנות של דבורת דבש הדגם

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

שיטות להשוואה בין חומרים מזינים בBeebread נוצרו על ידי דבורים דבש Africanized ואירופאי והשפעות על titers חלבון Hemolymph

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

ניטור המושבה ברמת ההשפעה של ההדברה לא קטלני על דבש דבורים

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...