We would like to thank Dr. Robert Angerer for his careful reading and editing of the manuscript. NIH R15HD088272-01 as well as the Office of Research and Development, and Department of Biological Sciences at Mississippi State University provided support for this project to RCR.

1. עיצוב אסטרטגית Morpholino תפוקה גבוהה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות גן (ים) של עניין (גישת הגן המועמד למשל, ניתוח הרגולציה ציס, RNA-seq ו / או מסכי ההפרש proteomic). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גנומית, transcriptomic, ונתוני ביטוי גנים באתרים מתעדכנים בתדירות גבוהה (למשל SpBase http://www.echinobase.org 20 וס purpuratus הגנום http חיפוש: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) כדי לקבוע שפרופיל הביטוי spatiotemporal חופף עם מנגנון התפתחות מדובר. אם אין נתוני ביטוי זמינים, ולאחר מכן ליצור פריימרים qPCR ו / או antisense ב חללית באתרו להעריך את דפוס ביטוי גנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קביעת דפוס ביטוי במרחב ובזמן, להשיג את רצף הדנ&quot;א מאתרי האינטרנט הגנומי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקה oligonucleotides morpholino חסימה-תרגום, להשיג רצף of 5 &#39;באזור un-מתורגם (5&#39; UTR) ישירות במעלה הזרם מן קודון ייזום מהתג רצף הביע (EST) מאגרי מידע נגיש SpBase או ס purpuratus הגנום אתרי חיפוש. אם מידע זה אינו זמין עבור הגן של עניין, ולאחר מכן לבצע 5 &#39;RACE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצב morpholino חסימת-אחוי, לחפש את הרצף הגנומי כולל אקסונים אינטרונים שימוש באפשרות פיגום blastn בכלי חיפוש SpBase או ס purpuratus הגנום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באתר בעיצוב oligonucleotide http://oligodesign.gene-tools.com כדי לעצב את רצף morpholino זוג 25 בסיס הרצוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך morpholino חסימת-translational, השתמש רצף mRNA מ 5 &#39;ל 3&#39; כמקור רצף היעד translational. כלול את רצף UTR &#39;5 (כ -70 נוקלאוטידים upstream של אתר תחילת השעתוק) בתוספת 25 בסיסים של קידוד באזור (במורד הזרם של האתר התחל) עם תחילת קודון wi ניכרתבסוגריים ה (ATG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך morpholino חסימה-אחוי, בחר אינטרון-אקסון או רצף גבול-אינטרון אקסון וכולל 50 בסיסים (25 בסיסים של רצף אקסון ו -25 בסיסים של רצף אינטרון) סביב אזורי הגבול. סרוק את הגנום עם רצף morpholino כדי לוודא את הרצף ייחודי. </li></ol></li></ol> 2. Microinjection של Oligonucleotides Morpholino <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3 פתרונות מניות מ&quot;מ של oligonucleotides morpholino על ידי הוספת 100 μL מים nuclease חינם לתוך בקבוקון morpholino 300 nmol. הערה: אל תשתמש במים DEPC שטופלו מחדש ההשעיה בגלל diethyl pyrocarbonate יכול להזיק morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ספין הכינון מחדש הראשון במורד בקבוקון המכיל את פתרון oligonucleotide המניות למשך 30 שניות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG), בקצרה מערבולת, חום 65 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 10 דקות, מערבולת בקצרה, ולשמור את המניה morpholino ב חדר טמפרטורה לפחות h 1. פתרון המניות Morpholino<html> s מאוחסן מ -20 ° C עד 4+ מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון הזרקה המכיל oligonucleotides morpholino בריכוז הרצוי. פתרון זה מכיל בדרך כלל 20% גליצרול או 125 מ&quot;מ KCl כנשא ו -15% FITC-dextran (והעמסת isothiocyanate dextran 10,000 MW 2.5 מ&quot;ג / μL פתרון המניות). FITC-dextran ו conjugates dextran ניאון אחרים משמשים באופן שגרתי כדי לזהות עוברים מוזרק על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. פתרונות הזרקת חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את פתרון morpholino ב 65 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום או אמבט מים במשך לפחות 2 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה ספין פתרון morpholino למשך 30 שניות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG), מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG) במשך 10 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מחטי הזרקה עם פתרון morpholino. לקבלת פרוטוקול microinjection מפורט ראה Stepicheva ושיר 2014 21 ו תרועות Ettensohn 2004&quot;&gt; 22. </li></ol> קיבוע 3. בפרוטוקול באתרו ב 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) ב ס purpuratus עוברים הערה: פרוטוקול זה שונה מן ארנס-Mena et al. 2000 23 ו Sethi et al. 2014 24. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מספר טיפות של מקבע (ראה להלן) כדי בארות המכילות עובר, לערבב בעדינות על ידי pipetting, ולאפשר להם להתיישב. הסר את הפתרון מקבע, ולאחר מכן לערבב עובר עם שתי שטיפות נוספות 180 μL של מקבע. הערה: חשוב לערבב את העוברים ביסודיות במהלך הכביסות של עד pipetting עדין ומטה מספר פעמים. אי ביצוע הוראה זו יכולה להוריד את יחס האות לרעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את העוברים לתקן בכביסה מקבעת השנייה למשך 50 דקות עד 1 שעות בטמפרטורת חדר (RT) ב paraformaldehyde הכיתה במיקרוסקופ אלקטרוני 4% בהיקף של 10 מ&quot;מ מגבים 7.0 pH, 0.1% Tween-20, ומלאכותי seawater (ASW). הפוך את הפתרון הזה טרי בכל פעם עבור התוצאות הטובות ביותר. בנוסף, עבור עוברי הקלות והמעשיות המתוקנות ב- 96-גם הצלחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 20 שימוש מקבע 5 מ&quot;ל paraformaldehyde מ&quot;ל 16%, 15 מ&quot;ל ASW, 200 μL 1 M מגבים pH 7.0, ו -20 μL Tween-20. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 פעמים ב RT עם 180 μL של מגבים לשטוף חיץ המורכב pH 0.1 M מגבים 7.0, 0.5 M NaCl ו 0.1% Tween-20 במשך 5 דקות או עד העוברים לפחות טיפה לתחתית הבאר. שוב, חשוב לערבב את העוברים ביסודיות לתוך המאגר לשטוף ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים. חיץ מגבים לשטוף יכול לשמש 2 ימים אם לאחסן 4 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 40 מ&quot;ל מגבים לשטוף חיץ שימוש 4 מ&quot;ל 1 M מגבים pH 7.0, 4 מ&quot;ל 5 M NaCl, 32 מ&quot;ל DH 2 O, ו -40 μL Tween-20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים קבועים יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלסיוס למשך 2 ימים. הערה: אם אחסון עוברים קבוע יותר, ולאחר מכן להוסיף 0.2% אזיד הנתרן מגבים חיץ לשטוף כדי למנוע התפתחות חיידקים.</li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מגבים חיץ לשטוף ולהוסיף 180 μL של 2: יחס 1 של מגבים חיץ לשטוף למאגר הכלאה, לערבב עוברים לתוך התמיסה על ידי מספר פעמים pipetting עדין, דגירה במשך 20 דקות לפחות ב RT. הכלאה חיץ מורכב 70% לפוראמיד, 0.1 M מגבים pH 7.0, 0.5 M NaCl, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BSA ו -0.1% Tween-20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 40 מ&quot;ל חיץ הכלאה שימוש 4 מ&quot;ל 1 M מגבים pH 7.0, 4 מ&quot;ל 5 M NaCl, 4 מ&quot;ל DH 2 O, 0.04 גרם BSA, ו -40 μL Tween-20. מערבבים היטב על ידי vortexing, להוסיף 28 לפוראמיד מ&quot;ל, מערבולת שוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 2: יחס 1 של המגבים לשטוף מאגרי הכלאה ולהוסיף 180 μL של יחס של 1: 2 של מגבי חיץ לשטוף למאגר הכלאה, לערבב עובר לתוך התמיסה, דגירה במשך 20 דקות לפחות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכלאת הבדיקה לערבב עוברת בעדינות לתוך 100 - 150 μL של חיץ הכלאה. דגירה עוברים על 50 מעלות צלזיוס לפחות 1ח. הערה: הקבוצה מתחילה עובר לילה מקובל. לפני דוגרים, לאטום את הבארות עם גיליון דבק כדי למנוע אידוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הַכלָאָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור נפרד להוסיף 0.1 - 0.3 ng / μL של חללית ו -500 מיקרוגרם / מיליליטר השמרים tRNA למאגר הכלאה, ואז מערבולת בעדינות כדי ליצור פתרון חללי. tRNA שמרים מתווסף פתרון הבדיקה כדי להקטין הלא ספציפי מחייב של החללית אנטי תחושה. מחממים את הפתרון הזה ל -50 מעלות צלזיוס, חיץ הכלאה לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב בעוברים בשלב טרום הכלאה לתוך 100 μL של פתרון הבדיקה, חותם עם גיליון דבק, להכליא על 50 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 7 ימים, תלוי הבדיקה (חללית foxq2 ניתן וטופחה במשך 2 ימים). הערה: פעמים דגירה תשתנה בהתאם את החללית. גנים מסוימים לידי ביטוי ברמות נמוכות דורשים עד דגירת 7 ימים. ניתן להציב 96-גם הצלחות בקופסת לחות כביטוח נגד אידוי אם adhesגיליון ive נכשל לאטום כמו שצריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 פעמים ב 50 מעלות צלזיוס עם 180 μL של מגבים טריים לשטוף חיץ עבור סכום כולל של 3 שעות. לאחר מכן, לשטוף 3 פעמים (15 דקות) עם 180 μL של מגבים לשטוף חיץ ב RT. זכור לערבב עוברים לתוך לשטוף חיץ בכל פעם על ידי pipetting מספר פעמים בעדינות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מגבי חיץ לשטוף ומערבבים עוברים 180 μL של חיץ חסימת מורכב סרום כבשים 10% רגילים ו -5 מ&quot;ג / המ&quot;ל BSA ב מגבי חיץ לשטוף דגירה במשך 45 דקות לפחות ב RT או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חסימת חיץ ואז לערבב העוברים לתוך חסימת מאגר המכיל דילול 1: 1,500 של נוגדן אנטי digoxigenin phosphatase מצומדות אלקליין מדולל חסימת חיץ. דגירת הלילה ב RT צלחת אטומה כדי למנוע אידוי. הערה: אל תשאיר נוגדן על יותר הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברים 6 פעמים (5 דקות או עד העוברים טיפה) ב מגבים לשטוף חיץ ב RT. יכול עוברלאחסן לילה בשעה 4 ° C.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפיתוח באתרו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו עוברי 3 פעמים (10 דקות) ב RT עם חיץ pH 9.5 טריים המורכב 0.1 M טריס pH 9.5, 100 מ&quot;מ NaCl, 50 2 מ&quot;מ MgCl, 1 מ&quot;מ Levamisole, ו -0.1% Tween-20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 20 מ&quot;ל pH 9.5 חיץ שימוש 2 מ&quot;ל 1 M טריס pH 9.5, 400 μL 5M NaCl, 1 מ&quot;ל 1 M MgCl 2, 20 μL Tween-20, 16.6 מ&quot;ל DH 2 O, ו 0.0048 Levamisole גרם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים על 37 מעלות צלזיוס במאגר מכתים מוגן מפני אור. חיץ מכתים מורכב מ 10% דימתיל Formamide, 4.5 μL / מ&quot;ל ​​4-Nitro כלוריד כחול tetrazolium (NBT), ו -3.5 μL / מ&quot;ל ​​5-Bromo-4-כלורו-3-indolyl-פוספט (BCIP) במאגר pH 9.5 טריות . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 1 מ&quot;ל של חיץ מכתים להשתמש 100 μL דימתיל Formamide, 4.5 μL NBT, ו -3.5 μL BCIP. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את תגובת phosphatase אלקליין על ידי שטיפת 3 עד 5 פעמים ב מגבה לשטוף חיץ. ה- Wi התגובהה החללית foxq2 בדרך כלל לוקח 30 דקות עד 1 שעה. בדיקות מסוימות עשויות צריכות דגירת הלילה משני RT או 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים עוברים לתוך תמיסה של לשטוף 70% מגבים ו -30% גליצרול. גליצרול מספק מקדם השבירה צורך במיקרוסקופ. עוברים ניתן לאחסן את הפתרון הזה במשך כמה שבועות. חותם את הצלחות עם פרפין פלסטיק כדי למנוע אידוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שקופיות ולכידת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שקופית ידי סידור שלוש רצועות קטנות של דבק דו צדדי למשולש עם פערים קטנים בין רצועות לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים בכביסה 70% מגבים פתרון גליצרול 30% למרכז המשולש ומכסים coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את coverslip ידי החלת שכבת לק מסביב לקצוות של coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור מתחם עם מטרת 20X ומצלמה מצורפת. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Erwin, D. H., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hierarchical+gene+regulatory+networks.">The evolution of hierarchical gene regulatory networks.</a> Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).</li><li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+gene+regulatory+networks+controlling+body+plan+development.">Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development.</a> Cell. 144, 970-985 (2011).</li><li>Borggrefe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Notch+intracellular+domain+integrates+signals+from+Wnt,+Hedgehog,+TGFbeta/BMP+and+hypoxia+pathways.">The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways.</a> Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).</li><li>Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+canonical+and+noncanonical+Wnt+signaling+pathways+patterns+the+neuroectoderm+along+the+anterior-posterior+axis+of+sea+urchin+embryos.">Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos.</a> PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).</li><li>Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF,+TGFbeta+and+Wnt+crosstalk:+embryonic+to+in+vitro+cartilage+development+from+mesenchymal+stem+cells.">FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).</li><li>Lapraz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTK+and+TGF-beta+signaling+pathways+genes+in+the+sea+urchin+genome.">RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome.</a> Dev Biol. 300, 132-152 (2006).</li><li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+signalling+pathways+in+animal+development.">The evolution of signalling pathways in animal development.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).</li><li>Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+signaling+crosstalk+regulates+endomesoderm+segregation+in+sea+urchin+embryos.">Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos.</a> Science. 335, 590-593 (2012).</li><li>Range, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+positioning+of+the+anterior+neuroectoderm+in+deuterostome+embryos.">Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos.</a> Genesis. 52, 222-234 (2014).</li><li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+and+the+polarity+of+the+primary+body+axis.">Wnt signaling and the polarity of the primary body axis.</a> Cell. 139, 1056-1068 (2009).</li><li>Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deuterostome+origin+of+the+Spemann+organiser+suggested+by+Nodal+and+ADMPs+functions+in+Echinoderms.">A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms.</a> Nature communications. 6, 8434 (2015).</li><li>Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+activation+mechanisms+of+Wnt+signaling+pathways.">Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways.</a> Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).</li><li>Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development.">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).</li><li>Houart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+the+telencephalon+during+gastrulation+by+local+antagonism+of+Wnt+signaling.">Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling.</a> Neuron. 35, 255-265 (2002).</li><li>Bertrand, S., Escriva, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+amphioxus.">Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus.</a> Development. 138, 4819-4830 (2011).</li><li>Rottinger, E., Lowe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+hemichordates.">Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates.</a> Development. 139, 2463-2475 (2012).</li><li>Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Science. 314, 941-952 (2006).</li><li>Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+control+in+the+sea+urchin+aboral+ectoderm:+spatial+initiation,+signaling+inputs,+and+cell+fate+lockdown.">Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown.</a> Dev Biol. 374, 245-254 (2013).</li><li>Saudemont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancestral+regulatory+circuits+governing+ectoderm+patterning+downstream+of+Nodal+and+BMP2/4+revealed+by+gene+regulatory+network+analysis+in+an+echinoderm.">Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm.</a> PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).</li><li>Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpBase:+the+sea+urchin+genome+database+and+web+site.">SpBase: the sea urchin genome database and web site.</a> Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).</li><li>Stepicheva, N. A., Song, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microinjections+of+sea+urchin+zygotes.">High throughput microinjections of sea urchin zygotes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).</li><li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs.">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).</li><li>Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+expression+of+Hox+cluster+genes+in+the+ontogeny+of+a+sea+urchin.">Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin.</a> Development. , 4631-4643 (2000).</li><li>Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+labeling+in+developmental+gene+regulatory+network+analysis.">Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis.</a> Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).</li><li>Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Catenin+is+essential+for+patterning+the+maternally+specified+animal-vegetal+axis+in+the+sea+urchin+embryo.">beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).</li><li>Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wnt-FoxQ2-nodal+pathway+links+primary+and+secondary+axis+specification+in+sea+urchin+embryos.">A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos.</a> Dev Cell. 14, 97-107 (2008).</li><li>Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal:+master+and+commander+of+the+dorsal-ventral+and+left-right+axes+in+the+sea+urchin+embryo.">Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).</li><li>Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LvNumb+works+synergistically+with+Notch+signaling+to+specify+non-skeletal+mesoderm+cells+in+the+sea+urchin+embryo.">LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo.</a> Development. 135, 2445-2454 (2008).</li><li>Range, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulatory+analysis+of+nodal+and+maternal+control+of+dorsal-ventral+axis+formation+by+Univin,+a+TGF-beta+related+to+Vg1.">Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1.</a> Development. 134, 3649-3664 (2007).</li><li>Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+hedgehog+signaling+to+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+sea+urchin.">Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin.</a> Dev Biol. 411, 314-324 (2016).</li><li>Rottinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signals+guide+migration+of+mesenchymal+cells,+control+skeletal+morphogenesis+[corrected]+and+regulate+gastrulation+during+sea+urchin+development.">FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development.</a> Development. 135, 353-365 (2008).</li><li>Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+requires+motile+cilia+in+the+sea+urchin.">Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin.</a> Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).</li><li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology.">Evolutionary crossroads in developmental biology.</a> Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).</li><li>Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Wnt-Nodal+Signals+Regulate+the+Patterning+of+Anterior+Neuroectoderm.">Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm.</a> PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).</li><li>Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+and+BMP2/4+signaling+organizes+the+oral-aboral+axis+of+the+sea+urchin+embryo.">Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo.</a> Dev Cell. 6, 397-410 (2004).</li><li>Bradham, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chordin+is+required+for+neural+but+not+axial+development+in+sea+urchin+embryos.">Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos.</a> Dev Biol. 328, 221-233 (2009).</li><li>Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+for+ectoderm+specification+in+sea+urchin+embryos.">Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).</li><li>Lin, C. Y., Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+sea+urchin+embryos+by+using+a+CRISPR/Cas9+system.">Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system.</a> Dev Biol. 409, 420-428 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

המתודולוגיה המוצגת כאן היא דוגמא שממחישה את הכח של שימוש בעוברים עם מורכבות גנומית וצורניות פחות חוליות להבין את מסלולי העברת איתות GRNs המסדירים מנגנוני התפתחותיים יסוד .. מעבדות רבות משתמשות מבחנים דומים במהלך התפתחות קיפוד הים מוקדם לנתח את מסלולי איתות מעורבים בא...

ג&#39;ין רשתות רגולטוריות (GRNs) ואת מסלולי העברת אותות להקים הביטוי במרחב ובזמן של גנים במהלך ההתפתחות העוברית המשמשים לבניית תוכנית גוף החיה הבוגרת. תא אל תא מסלולי העברת אותות הם מרכיבים חיוניים של רשתות רגולטוריות אלו, מתן הכלי שבאמצעותו תאים מתקשרים. אינטראקציות הסלולר אלה להקים ולשפר את הביטוי של גני רגולטוריים והבחינו ובקרב בשטחים השונים במהלך embryogenesis 1, 2. אינטראקציות בין מאפננים תאיים מופרשים (הליגנדים, אנטגוניסטים), קולטנים, ו-קולטנים שיתוף לשלוט על פעילות מסלולי העברת אותות. מבחר של מולקולות תאיות transduces תשומות אלה וכתוצאה מכך ביטוי גנים שהשתנה, חלוקה, ו / או צורה של תא. בעוד רבים של מולקולות המפתח בשימוש ברמות התאיות ו תאי על המסלולים העיקריים הםידוע, הוא ידע שלם נובע במידה רבה למורכבות של מסלולי איתות בודדים. בנוסף, מסלולי איתות שונים לעתים קרובות אינטראקציה זה עם זה חיובי או שלילי על התאים, תאיים, ורמות תעתיק 3, 4, 5, 6. חשוב לציין, מרכיבי הליבה של מסלולי העברת אותות הם שמורים ביותר בכל המינים מטזואניים, ו, להפליא, רוב מסלולי איתות הגדולים לעתים קרובות לבצע פונקציות התפתחותי דומות במינים רבים כאשר משווים אורגניזמים טווח מערכת קשור קשר הדוק בפרט 7, 8, 9, 10, 11. המחקר של איתות במהלך ההתפתחות הוא משימה מרתיעה בכל אורגניזם, וישכמה אתגרים משמעותיים ללימוד מסלולי איתות במודלים השניוניים הפה ביותר (בעלי חוליות, המיתרנים חסרי חוליות, hemichordates, ו echinoderms): 1) בקרב בעלי חוליות יש מספר גדול של ליגנד האפשרי ואינטראקציות קולטן / אפנן-שיתוף, מולקולות התמרה תאיות, כמו גם אינטראקציות פוטנציאליות בין נתיבים שונים מאותתים בשל המורכבות של הגנום 12, 13, 14; 2) המורפולוגיה המורכבת ותנועות המוךפו&quot;גנטי שהולכות חוליות לעתים קרובות לעשות את זה יותר קשה לפרש אינטראקציות תפקודיות ובקרב מסלולי העברת אותות; 3) ניתוח ברוב מיני מודל שאינו קווצי עור חסר חוליות שניוניות פה מוגבל על ידי חלון קצר gravidity למעט כמה מיני מיתרני זנב 15, 16. העובר ים קיפוד יש כמה מן המגבלות הנ&quot;ל ומציע איכויות ייחודיות רבות לביצוע ניתוח מפורט של מסלולי העברת אותות in vivo. אלה כוללים את הבאים: 1) הפשטות היחסית של הגנום קיפוד הים מפחית באופן משמעותי את המספר ליגנד אפשרי, קולטן / שיתוף הקולטן מולקולת התמרה תאית קשרי גומלין 17; 2) GRNs שליטה במפרט הדפוסים של השכבות הניבטות וגרזנים עובריים עיקריים מבוססות היטב בעוברי קיפוד ים, בסיוע להבנת ההקשר רגולטוריות של התא / טריטורית קבלת האותות 18, 19; 3) מסלולי העברת אותות רבים ניתן ללמוד בין שלבי מחשוף gastrula מוקדם כאשר עוברים מורכבת של האפיתל שכבתית יחידה מורפולוגיה אשר קל יותר לנתח; 4) המולקולות לערבד ב מסלולי איתות של קיפודי הים הם מניפולציה בקלות; 5) קיפודי ים רבים המעוברים במשך 10 עד 11 חודשים בשנה (למשל Strongylocentrotus purpuratus ו Lytechinus variegatus). כאן, אנו מציגים שיטה בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות המציינים וטריטוריות דפוס בעוברי קיפוד ים כדי להמחיש את היתרונות כי מספר מערכות מודל חסרות חוליות להציע בחקר מנגנונים מולקולריים מורכבים.

<table><tbody><tr><td>Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino</td><td>Gene Tools LLC</td><td>Customized</td><td>More information at www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D1821</td><td>Make 25 mg/mL stock solution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution EM Grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1254-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23336-0010</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody</td><td>Roche</td><td>11 093 274 910</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisole hydrochloride (levamisole)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base UltraPure</td><td>Research Products Internationall Corp</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Roche</td><td>11 383 221 001</td><td></td></tr><tr><td>4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)</td><td>Roche</td><td>11 383 213 001</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

the power of simplicity: sea urchin embryos as in vivo developmental models for studying complex cell-to-cell signaling network interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

בעובר הים קיפוד הראינו כי 3 איתות סניפים Wnt שונים (Wnt / β-קטנין, Wnt / JNK, ו Wnt / PKC) 4, 25 פועלים יחד כדי ליצור רשת איתות Wnt השולט הקדמי-אחורי דפוסים (AP). אחת התוצאות החשובות ביותר של אירועי איתות אלה היא כי קדמי neuroectoderm רחב הביע הר?...

Watch this Scientific Journal Video about The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions at JoVE.com

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

the-power-simplicity-sea-urchin-embryos-as-vivo-developmental-models

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Unit 1

Principles of Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

7.8K Views.  Mississippi State University.  במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים. 

Video: The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Biology

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

ספקטרומטריית מסה מונחית שושלת תאים פרוטאומיקה בעובר המתפתח (צפרדע)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Chemistry

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

דור של מסלקי בלסטודרם נאיביים מעוברי דגי זברה

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video