עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם MRC.

1. הזדווגות איסוף ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Medaka נקבה וזכר יכולים בקלות להיות מכובדת על ידי גודל וצורה של סנפיר אנאלי הגבי. סנפירי האנאלי של הזכרים גדולים בצורת מקבילית בהשוואה לזו של הנקבות. סנפיר אנאלי הנשי הוא קטן בצורת משולש. סנפיר הגב זכר יש חריץ עמוק לעין בין שתי הקרניים האחרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Medaka שכבו עד 40 ביצים כל יום ונקבות medaka לשאת ביצים התקבצו ליד הבטן שלהם על ידי חוטים מצורף במשך כמה שעות לפני שהם פשט על הצמחים באקווריום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקבות יכול להיות לכוד ברשת וקבע בתוך בעדינות משני הצדדים על ידי יד אחת. ביצים אז יכול להיות התגרו בעדינות מהבטן עם האצבע המורה של היד השנייה. הנקבה אז יכול להיות שב הטנק. ביצים יש להעביר צלחת פטרי 6 ס&quot;מ מלאים התקשורת העובר על ידי מלקחיים קהה או אצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוגות Medaka נדירות להילחם כאשר הם מוחזקים בתוך קופסה קטנה ההזדווגות. לכן, הם יכולים להישמר טנק אחד קטן עם זרימת המים, כך שהם יכולים להיות מוזן וביצים ניתן לאסוף מזוג אותו כל יום במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב דג נקבה לא צריך להישמר ללא זכרים, שכן הביוץ מתרחש היומיום medaka נקבות. אחרת, הנקבות לא יכול לספק ביצים להיות ברע. </li></ol> 2. עוברים ניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת unclustered ביצים עם טפטפת זכוכית נייר זכוכית (p2000 בגודל חצץ, עמיד למים) להציב מכסה של צלחת פטרי 9cm. הסר בינוני עודף אלא להבטיח נפח מספיק נשאר כדי למנוע ייבוש של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלגל בעדינות עוברים על נייר זכוכית בעזרת האצבע המורה, הפעלת לחץ מינימלי ושמירה במקביל אצבע על פני השטח של הנייר בחול כ 45-60 שניות כדי להסיר כמה שערות פני השטח החיצוני של סיסית. אין לגלגל יותר מ 5-7 עוברים מיד זהירות זו תצמצם את הסיכון של ריסוק עוברים מתחת לזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים ניקוי לצלחת טרי בינוני העובר. </li></ol> 3. ביצוע צלחות agarose לקיום עוברים במהלך microinjection עוברים מוחזקים שקתות במהלך ההזרקה עשה עם עובש פרספקס agarose ב -1.5% (איור 1). ריכוז agarose חשוב להחזיק עוברים כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, ליצור מסגרת של agarose להחזיק את התבנית פרספקס. יוצקים agarose 1.5% במים עד לעומק 0.5cm בצלחת פטרי 9cm ולחכות עד שהוא מתקשה לחלוטין. לגזור על שטח של agarose רק גדול יותר בגודל של התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 1.5% agarose כדי למלא את שטח חתך מקום עובש כך שאין בועות לכודים ולהמתין עד agarose מתמצק. צלחת זו agarose ניתן לאחסן במקרר כדי לזרז solidifaction. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את התבנית כדי ליצור שקתות להחזיק את הביצים. הוסף בינוני העובר מספיק כדי לטבול את התבנית, מכסים ומאחסנים ב 4 מעלות צלזיוס עד הצורך. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סכמטי של עובש מחוייט המשמשים להכנת שקתות בצלחות agarose עבור microinjection. </li></ol> 4. Microinjection עוברים medaka ב medaka, DNA, RNA, oligonucleotides morpholino וצבעים נותב הם microinjected דרך סיסית לתוך הציטופלסמה של 1 עד 64 תאים בעובר בשלב במקום חלמון כמו דג הזברה. מאז הציטופלסמה קטנה יותר לעין ופחות medaka, בפועל על ידי הזרקת צבעים כגון rhodamine-dextran מומלץ לפתח את המיומנות הזאת. תוספת של פנול אדום כמו נותב הוא מעודד גם כדי לאפשר אישור של זריקות. ככל סיסית שמסביב עוברים medaka קשה, מחט קצרה, הזרקה חזקה רחב נדרשת (איור 2). הכן זה מחט חזקה הזרקת רחב של כוס חוט המכילים נימי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון זריקה עם פנול אדום כמו נותב ו לטעון אותו לתוך המחט מאחור עם microloader Eppendorf. חבר את המחט על משאבת אוויר מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים יש לאסוף unclustered בהקדם האפשרי לאחר ההפריה להזריק בשלב אחד התא. עוברים עוד ניתן להזריק ידי אחסונם על הקרח (לא יותר מ 30 דקות) כדי למנוע חלוקת התא. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. השוואה בין מחטים medaka ו דג הזברה. הערה קצה המחט MF (למעלה) הוא קצר יותר ולכן חזקה ניקוב סיסית קשה שמסביב עוברים medaka. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביצים לתוך הצלחת agarose וליישר אותם שקתות עם מלקחיים. ממש לפני ההזרקה, חמש ביצים יש לסובב כך קרום התא הציטופלסמה של תא אחד יכול להיות נפגע על ידי הדואר המחט בניצב. הציטופלסמה של תא אחד לא ניתן למצוא על ידי מחפש שטח נטולי טיפות שמן קטן שנמצא מול הצד של הביצה עם טיפות שמן הצפופים. האזור זיהו ניתן לאשר להיות בציטופלסמה ידי הצגת מהצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את המחט קרוב את הביצים. פתח את קצה המחט על ידי נוגע בעדינות את קצה המחט אל סיסית או באמצעות microforceps (איור 3). כמות קטנה של חומר הזרקה יש לראות לזרום החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב דרך סיסית למקום קצה של מחט בתוך סיסית. התאם את הלחץ החזקה של מזרק להיות גבוה יחסית, כדי להבטיח ריפלוקס לא מתרחשת עקב הלחץ הגבוה על לנקב דרך סיסית הקשה (הגדרות של 80 100hPA ללחץ החזקת 500-700hPA ללחץ הזרקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קצה המחט לתוך הציטופלסמה באמצעות חדה תוקע הקרום שלה. הימנע החדרת קצה המחט בחלמון. שלא כמו דג הזברה, החומר מוזרק לתוך החלמון לא יועברו לתוך הציטופלסמה. נוזלים מוזרקים יש גבול ברור כאשר הוא מוזרק לתוך החלמון ואילו הגבול מטושטש כאשר בציטופלסמה (איור 4). מדי פעם המחט עשוי להיחסם על ידי agarose / פסולת. מלקחיים ניתן להשתמש לגעת / rebreak סוף המחט ולהסיר את החסימה. אם המחט שוברת בכל נקודה במהלך ההזרקה, מבעבע יהיה לראות את העובר בינוני לבין חומר שאתה הזרקת יאבדו. זריקות צריך להתבצע באופן שיטתי מלמעלה למטה לאורך תעלות agarose ו משמאל לימין על פני התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים מוזרק יש להעביר צלחת נקייה המכילה בינוני העובר ופיתח בטמפרטורה המתאימה. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. שוברים את קצה המחט לפני ההזרקה. 1: העבר קצה המחט קרוב סיסית של העובר; 2: גע סיסית ולהעביר מחט בעדינות קדימה ואחורה כדי לשבור קצה; 3: כאשר כמות קטנה של חומר הזרקה זורם מתוך בסופו של המחט זו מאשרת שבירה של קצה. </li></ol> 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. תמונות נציג מוזרק עוברים medaka. לוח מראה תמונה מייצגת של הזרקה נכונה של rhodamine-dextran לתוך הציטופלסמה של תא אחד עובר שלב medaka. לוח ב &#39;מציג תמונה מייצגת של הזרקה שגויה של rhodamine-dextran לתוך שק החלמון של העובר חד תא הבמה medaka. לוחות C ו-D להראות את העוברים מקולטי A ו-B בהתאמה על כ 30 שעות לאחר ההזרקה. א.מ.: העובר, הקדמי הוא כלפי מעלה לוחות C ו-D ולהציג היא הגב. הערה על הגוף של העובר בלוח D הוא לא אדום כמו צבע היה מוזרק בצורה לא נכונה לתוך שק החלמון. חצים ב B ו-D עולה rhodamine-dextran מוזרק בצורה לא נכונה לתוך שק החלמון לציין את הגבול מעגלי מובהק. קווים מקווקווים ב A ו-B עולה קווי המתאר של הציטופלסמה של תא אחד, הוא להציג לרוחב.

<ol>
	<li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka,+Oryzias+latipes.">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li><li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+and+zebrafish,+an+evolutionary+twin+study.">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).</li></ol>

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה נותב התא, ה-mRNA, ה-DNA או oligonucleotide אנטי תחושה זריקה לתוך אחד התאים בשלב עוברי medaka. טכניקה זו אפשרה לנו לבחון תהליכים התפתחותיים שונים ב-vivo בזמן אמת. תהליך זה לבין ניתוח מפורט בהמשך היא מספקת יש פוטנציאל לשפר באופן משמעותי את הבנתנו organogenesis החולייתנים לבין ביולוגיה של התא הבסיסי. ידע כזה עשוי להיות חשוב, ואת התשואה יישומים טיפולית רפואה רגנרטיבית.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4" fine net</td>
<td>Tools</td>
<td>J &amp; K Aquatics Ltd.</td>
<td>MD001</td>
<td>Used to capture fish during egg harvesting.</td>
</tr>
<tr>
<td>Embryo medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size </td>
<td>Tools</td>
<td>Hermes Abrasives Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>GC100-10F</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige scientific instrument lab</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf microloader</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>For loading microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Microinjector apparatus </td>
<td>Equipment</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model 5242.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model MN151.</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose injection plate</td>
<td>Tools</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For holding embryos during injection.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקה של microinjection לאחד תאים בשלב עוברי medaka. Medaka הוא דג קטן ההטלה מים מתוקים המאפשר ניתוח הן גנטיות העוברית הוא אחד היצורים מודל חוליות שבו הגנום כולו פנוטיפ מונחה מסכי מוטציה בוצעו 1, כמו דג הזברה והעכבר. החפיפה סטייה תפקודית של גנים הקשורים בין medaka ו דג הזברה מאפשר זיהוי של פנוטיפים רומן כי הם ניתנים לזיהוי ב זן יחיד 2, ובכך medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. כדי לנצל את הדגים medaka אשר עוברים הם שקופים ולפתח חיצונית, microinjection היא טכניקה חיונית להזריק תא קליעים נותבים עבור תאים, mRNAs תיוג או תחושה אנטי oligonucleotides במשך-לבטא ו דפיקות מטה הגנים של עניין, DNAs להכנת מהונדס הקווים.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism at JoVE.com

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. פרוטוקול זה מדגיש את נקודות המפתח עבור microinjection מוצלח לעוברי medaka, טכניקה חשובה לניתוח העוברית ואת גנטי באמצעות medaka ו דג הזברה במעבדה.

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

microinjection-of-medaka-embryos-for-use-as-a-model-genetic-organism

Research

JoVE Journal

Biology

25.5K Views.  University of Bath. Medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. פרוטוקול זה מדגיש את נקודות המפתח עבור microinjection מוצלח לעוברי medaka, טכניקה חשובה לניתוח העוברית ואת גנטי באמצעות medaka ו דג הזברה במעבדה.

Video: Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: אורגניזם מודל לחקר פתוגנזה חיידקית - ראיון

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

השימוש Rotorod כשיטה לניתוח איכותי של הליכה עכברוש

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...