המחברים רוצה להודות כריסטין Auste לתמיכה שלה עם הקלטת וידאו, Chalid Ghadban לסיוע טכני מעולה שלו. אורסולה Grabiec נתמכה על ידי רו Programm FKZ 29/18.

הניסויים בוצעו על פי מדיניות של האתיקה ומדיניות השימוש בבעלי חיים במחקר מדעי המוח כפי שאושר על-ידי באירופה קהילות המועצה דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי, מועצת האיחוד האירופי בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות.
 1. הכנה של מכשירים ומדיה תרבות <ol><li>עבור הכנת OHSC להשתמש בערכת הבאה של מכשירים: שני מספריים קטנים, שני פינצטה מעוקל, פינצטה אחד עם טיפ בסדר, שלושה להבים (שניים בגודל 11, אחד בגודל 15), שלושה בעלי אזמל, לעגל מסנן המסמכים (קוטר: 35 מ מ), אגר, סכין גילוח אחד, אחד יבוצעו בהם שינויים פסטר פיפטה, 1 שונה פסטר פיפטה ללא טיפ. לעקר את כל החומרים ב החיטוי לפני השימוש ( איור 1).</li>
	<li>שוקל 5 g אגר, להמיס במים 100 מ ל מזוקק. לעקר את הפתרון עבור 20 דקות ב 121.7 ° C ב kPa 210.8 ב החיטוי. להפיץ את הפתרון אגר נוזלי 3 מ"ל ב 60-מ מ פטרי באמצעות פיפטה של זכוכית סטריליים, לאפשר לו לחזק עבור 5 שעות, לכסות עם פרפין פלסטיק הסרט כדי למנוע זיהום ולאחסן ב 4 ° C עד להמשך השימוש. קוביות אגר יש צורך לייצב את המוח במהלך ההליך עם פרוסות.</li>
	<li>מדיה <ol><li>להפוך 200 מ"ל של המדיום הכנה (pH 7.35) המורכב מ ל 198 בינוני חיוני מינימלי (מאמ) ו- 2 מ לגלוטמין פתרון (ריכוז סופי 2 מ מ). להכין את הפתרון ביום של מדיה הכנה ואחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>להכין 100 מ של המדיום תרבות המורכב מ ל 49 גברתי, 25 מ ל הנקס &#39; מאוזנת פתרונות מלח (HBSS), 25 מ ל (v/v) סוס רגיל סרום (NHS), 1 מ לגלוטמין פתרון (ריכוז סופי 2 מ מ), אינסולין µg 100, 120 מ"ג גלוקוז, סטרפטומיצין 10 מ ג , 10,000 U פניצילין, µg 800 ויטמין C כפי שדווח בעבר. לחמם את המדיום (37 מעלות צלזיוס), התאם את ערך ה-pH pH 7.4 וסטרילי מסנן (0.2 µm גודל הנקבוביות). חזור על הפעולות (מתחמם, התאמת חומציות, וכו ') בכל יומיים לפני שינוי המדיום. השתמש המדיום לכל היותר שבוע אחד כאשר הוא מאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>למלא אחד 35 מ מ צלחת פטרי עם הכנה בינונית כדי לאחסן את המוח. במקום שתי צלחות פטרי ריק עבור איסוף הרקמה על חבילת קירור באזור העבודה.</li>
</ol> 2. הכנה, Slicing עם Vibratome <ol><li>שימוש המוח בת 7-9 יום חולדות או 4-5 יום עכברים הישן להכנת OHSC על פי Stoppini et al. 4 אחרי עריפת ראש של בעלי חיים, מסירים את העור של הגולגולת עם מספריים.</li>
	<li>להציג את להב מספריים בסדר לתוך נקב המאגנום ופתח את הגולגולת על ידי גזירה לאורך הציר סימטרית (קבלה) rostral (חזרה). יצירת שני חתכים בניצב הראשונה, כך המספריים הצבע לכיוון האוזן ימינה ושמאלה, בהתאמה (&#34; T-החתך &#34;).</li>
	<li>פתח את הגולגולת בזהירות עם מלקחיים בסדר, תשומת לב לא לפגוע במוח. השימוש באזמל (גודל להב 11) לחתוך את החלק rostral ביותר של הקוטב חזיתית ואת המוח הקטן.</li>
	<li>אומר על ידי מריבה, מסירים את המוח ואז מניחים אותה בזהירות צלחת פטרי עם הכנה בינונית ( איור 2). מקם את המוח על המחזיק הדגימה ותקן אותה באמצעות דבק רפואי דבק מגע. להשתמש את החלקים של אגר כדי להבטיח מייצב מכני.</li>
	<li>לנתח את הרקמה אופקית על 350 מיקרומטר עבה OHSC באמצעות vibratome הזזה של.</li>
	<li>להעריך את פרוסות באמצעות מיקרוסקופ דו-עינית אופטית. להתעלם OHSC של איכות נמוכה באופן מיידי. חשוב לקחת רק את הפרוסות עם שלם cytoarchitecture מבודד מן החלק האמצעי של ההיפוקמפוס (ראה דמויות 3 ו- 4) בין מהראש ההיפוקמפוס הגחון.</li>
	<li>נפרדים של ההיפוקמפוס, קליפת entorhinal באמצעות אזמל (סיבוב הלהב גודל 15; איור 3). מסלול perforant קליפת המוח entorhinal חייב להישמר.</li>
	<li>OHSC 6-8 התקבלו כל המוח. להעביר 2-3 פרוסות לתוך תא אחד תרבות הוספה (נקבוביות בגודל 0.4 מיקרומטר) ולמקם אותו אחד טוב של מנה 6-ובכן תרבות המכיל 1 מ"ל בינוני תרבות לכל טוב.</li>
	<li>דגירה הכלים 6-ובכן 35 ° C באווירה humidified באופן מלא עם 5% (v/v) CO 2 ולשנות המדיום התרבות התא בכל יום שני- 
	הערה: לנהל את הניסויים שלך ב 6 יום במבחנה (div). תגובות דלקתיות המשויך ההליך עם פרוסות נעלמים ביום 6. בשלב זה, תאים microglial להראות מורפולוגיה כחוד שוב, קשרים סינפטיים הבשילו.</li>
</ol> 3. הערכת איכות רקמת <ol><li>יציבות, תיוג והדמיה של נוירונים המתנוונת ב- OHSC <ol><li>לאחר ביצוע הניסויים, דגירה של OHSC עם 5 יודיד propidium µg/mL (PI) כבר שעתיים לפני קיבוע, ב כדי להכתים את הגרעינים של נוירונים המתנוונת. 
		התראה: פאי הוא קרצינוגן חשד, תמיד ללבוש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) כגון כפפות.</li>
		<li>לרחוץ את OHSC עם מאגר פוספט 0.1 M (pH 7.4) ותקן אותן עם פתרון 4% (v/v) של paraformaldehyde (PFA) עבור ה 24 
		התראה: PFA הוא קרצינוגן רעיל, החשודות. לעבוד תחת מכסה המנוע fume וללבוש את עיקרון השוויון הפוליטי.</li>
		<li>לרחוץ את OHSC ב מוסיף עם 1 מ"ל PBS ולהשתמש במברשת חבלה פרוסות להפריד הקרום.</li>
		<li>לתייג את OHSC עם צבע 4 ליברות לתוך צלחת 24-טוב ( איור 5).</li>
	</ol></li> <li>הולכה של הגידול הפלישה ניסויים באמצעות fluorescently שכותרתו תאים בודדים <ol><li>24 שעןת לפני תחילת הניסוי, תווית לתאי הגידול באמצעות succinimidyl diacetate Carboxyfluorescein של הפלורסנט אסתר (CFDA SE).</li>
		<li>ניתוק ולספור את תאי הגידול באמצעות תא נויבאואר.</li>
		<li>Resuspend התאים מדיום, כך µL 10 של השעיה מכיל את מספר התאים הרצוי (בד כ 100,000-50,000 תאים).</li>
		<li>החל µL 10 של התליה תא אל התרבות פרוסה ולאפשר את התאים לפלוש במשך 3 ימים.</li>
		<li>בסוף הניסוי, לתקן את התרבויות פרוסה באמצעות 4% (v/v) מחברים עבור 24 שעות ולאחר תווית התרבויות שיתוף עם PI עבור עוד 24 שעות ביממה כדי להמחיש את cytoarchitecture. 
		התראה: PFA הוא קרצינוגן רעיל, החשודות. לעבוד תחת מכסה המנוע fume וללבוש את עיקרון השוויון הפוליטי.</li>
		<li>הר התרבויות שיתוף על תגית כיסוי לצורך ניתוח נוסף באמצעות התקשורת הרכבה.</li>
	</ol></li></ol> 4. הערכה של ניסויים OHSC לנתח את OHSC עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM). זיהוי של פאי שכותרתו, מושחת נוירונים או החוקר הנקרא cytoarchitecture להשתמש אור מונוכרומטי λ אורך גל = 543 nm ו להקת פליטה לעבור סינון עבור אורכי גל λ = nm 585-615. עבור CFDA שכותרתו תאים סרטניים או מיקרוגלייה 4 ליברות, השתמש של גל עירור של λ = 488 ננומטר. לשני סוגי ניסיוני להקליט z-מחסנית עם 2 מיקרומטר אופטי פרוסות עבות ומשמש להערכה.

המחברים אין לחשוף

בפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכנת OHSC. דגם זה מאפשר בדיקה של תגובות של רקמת המוח ויכולות מהותי לאחר היישום של גירויים פיזיולוגיים ופתולוגיים. מלבד ניתוחים של פרמטרים אלקטרופיזיולוגיות, OHSC יכול להיות lesioned, ההשפעות של נזק על כל סוגי תאים יכול להיקבע. טיפול עם חומרים שונים על תיאור מפורט של תהליכי...

OHSC הם מודל מאופיין היטב במבחנה ללמוד מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של נוירונים, האסטרוציטים מיקרוגלייה1. קל יותר לשלוט בסביבה חוץ-תאית ולעקוב אחר השינויים הסלולר מורפולוגי אחרי גירויים שונים. הארגון של נוירונים בהיפוקמפוס והקשרים שלהם הם שנשתמרו לאחר הכנה2,3. מתוך מספר יתרונות, OHSC לאפשר פיקוח על הפלישה פציעה, גידול במוח ללא ניתוח בעלי חיים. 6-8 OHSC ניתן להשיג מוח מכרסמים יחיד. OHSC ולכן הם מסייעים באופן משמעותי להפחית את מספר בעלי החיים ולאפשר בדיקות סמים ריכוזים מרובים, שינויים גנטיים או מודלים שונים הנגע אותה חיה. במבחני המבוסס על פרוסה, תנאים ניסיוני יכול להיות דווקא נשלט. בנוסף, זמן פיתוח תלות של מצבים פתולוגיים כמו נזקים משניים יכול בקלות יהיה פיקוח על ידי הדמיה בצילום מואץ.
בפרוטוקול נתון, שנוסדה במקור על ידי Stoppini. et al. 4, ההכנה המתוארת, ציוני מורפולוגי החשובים לבחירת פרוסות המתאים מודגשים. אנו ממליצים על הכנת כמחנכת יום 7-9 חולדות או עכברים כמחנכת ביום 4-5. בתקופות אלה, OHSC מראים התנגדות חזקה טראומות מכני ובעל פוטנציאל גבוה רה-ארגון של מעגלים עצביים. לעומת זאת, גלמי חולדות עובריים או למבוגרים במהירות לשנות את המבנה שלהם מאבדים מורפולוגיה organotypic שלהם במהלך הטיפוח-תרגול ואת ולכן מתאימים פחות לימוד לטווח ארוך בתהליכי מחקר בסיסי5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. עוד נקודה קריטית עבור שיעור הישרדות של OHSC הוא עובי הפרוסה עצמה כמו דיפוזיה ובכך אספקת מזונם הם מוגבלים12,13,14.

<table><tbody><tr><td>6-Well</td><td>Falcon</td><td>35-3046</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fluka</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Autoclav</td><td>Systec</td><td>DX-45</td><td></td></tr><tr><td>CFDA</td><td>&amp;nbsp;Thermo Fisher</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eagle&amp;acute;s Minimal Essential Medium&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>32360-034</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1101</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merk</td><td>1083371000</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;acute;s Balanced Salt Solution (with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Invitrogen</td><td>24020-133</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;acute;s Balanced Salt Solution (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>LN229</td><td>Cell-Lines-Service</td><td>300363</td><td></td></tr><tr><td>Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)</td><td>B.Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Culture Inserts</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>NMDA N-methyl-D-aspartic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Seum</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (all sizes)</td><td>Greiner</td><td>627160/664160/628160</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Roth</td><td>0335.1</td><td>toxic</td></tr><tr><td>Propidium iodid (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81845-25MG</td><td>toxic</td></tr><tr><td>U138</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT 1200</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypic hippocampal slice cultures as a model to study neuroprotection and invasiveness of tumor cells

בתרבויות organotypic פרוסה בהיפוקמפוס (OHSC), המאפיינים פונקציונלי מורפולוגיים של שני נוירונים ותאי גלייה הם השתמרה היטב. מודל זה מתאים פונה שאלות מחקריות שונות הכרוכות מחקרים על neuroprotection, אלקטרופיזיולוגיות ניסויים הנוירונים, רשתות עצביים או גידול הפלישה. האדריכלות בהיפוקמפוס ואת פעילות. עצבית ב מעגלים multisynaptic הם טוב שמור ב OHSC, למרות הנוהל עם פרוסות עצמה בתחילה נגעים ומובילה היווצרות צלקת גליה. היווצרות צלקת משנה יש להניח את תכונות מכניות וההתנהגות דיפוזיה של מולקולות קטנות, וכו '. פרוסות לאפשר פיקוח על תהליכי תלויות זמן לאחר פגיעה מוחית ללא ניתוח בעלי חיים, וכן מחקרים על אינטראקציות בין סוגי תאים במוח-derived שונים, כלומר האסטרוציטים, מיקרוגלייה ו נוירונים תחת פיזיולוגיים ופתולוגיים תנאים. היבט אמביוולנטי של מודל זה הוא העדר זרימת דם ותאי דם חיסוניים. במהלך ההתקדמות של הפגיעה העצבית, העברת תאים חיסוניים מהמחזה דם תפקיד חשוב. כאשר תאים אלה חסרים לפרוסות, התהליכים מהותי בתרבות ייבחנו ללא הפרעה חיצונית. יתר על כן, ב- OHSC ההרכב של הסביבה בינוני-חוץ נשלטת בצורה מדויקת. יתרון נוסף של שיטה זו הוא המספר הנמוך יותר של חיות שהקריבה עצמה לעומת סוגי הפינויים הסטנדרטיים. ניתן להשיג את מספר OHSC מחיה לחיה ביצוע מחקרים בו זמנית עם מספר טיפולים אפשריים חיה אחת. מסיבות אלו, OHSC מתאימים היטב כדי לנתח את ההשפעות של הרפוי מגן חדש לאחר נזק לרקמות או במהלך הפלישה הגידול.
פרוטוקול שהוצג כאן מתאר שיטת הכנה OHSC המאפשרת יצירת מאוד לשחזור, ישמרו פרוסות יכול לשמש למגוון רחב של מחקר ניסיוני, כמו מחקרים הפלישה neuroprotection או גידול.

מחקרים Neuroprotection: כדי לקבוע נזקים עצביים, מספר גרעינים חיובי PI ו ליברות4 חיובי נספר מיקרוגלייה בכל מקטע אופטי השלישי של השכבה תא גרגר (שזכתה) של הכישור משוננת (ג'י). לניסויים הפלישה הגידול, בעוצמה מירבית z-ההקרנה של הערימה שימש לחישוב השטח המכוסה תאים סרטניים, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells at JoVE.com

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות (OHSC) מייצגים במבחנה דגם המדמה את המצב ויוו היטב. כאן נתאר מבוסס-vibratome משופרת עם פרוסות פרוטוקול כדי לקבל פרוסות באיכות גבוהה לשימוש בהערכת הפוטנציאל neuroprotective של חומרים חדשניים או ההתנהגות הביולוגית של תאים סרטניים.

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

organotypic-hippocampal-slice-cultures-as-model-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.9K Views.  Martin Luther University Halle-Wittenberg. Organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות (OHSC) מייצגים במבחנה דגם המדמה את המצב ויוו היטב. כאן נתאר מבוסס-vibratome משופרת עם פרוסות פרוטוקול כדי לקבל פרוסות באיכות גבוהה לשימוש בהערכת הפוטנציאל neuroprotective של חומרים חדשניים או ההתנהגות הביולוגית של תאים סרטניים.

Video: Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Developmental Biology

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

מערכת Coculture עם מוח פרוס Organotypic ו3D אליפטית של קרצינומה של תאים

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Medicine

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

גידול במוח / Organotypic Slice משותף תרבות מערכת לימוד microenvironment גידול וממוקד תרופות טיפולים

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

A Glioblastoma האדם דגם תרבות פרוסה Organotypic לחקר גידול תאים סרטניים ואפקטים ספציפיים לחולה של תרופות אנטי פולשניות

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early postnatal development, cerebellar Purkinje cells are known to go through a vulnerable period, during which they undergo programmed cell death. Here, we provide a detailed protocol to perform mouse organotypic cerebellar slice culture during this critical time. The slices are further labeled to assess Purkinje cell survival and the efficacy of neuroprotective treatments. This method can be extremely valuable to screen for new neuroactive molecules.

Organotypic slice cultures are a powerful tool to study neurodevelopmental or degenerative/regenerative processes. Here, we describe a protocol that models the neurodevelopmental death of Purkinje cells in mouse cerebellar slice cultures. This method may benefit research in neuroprotective drug discovery.

הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

מודל של אפילפטוגנזה בתרבויות פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס של רינאל קליפת המוח

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Establishing a Brain Tumor in an Organotypic Slice Co-culture Model

Source: Chadwick, E. J. et al. <a href="https://app.jove.com/v/53304">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the development of a 3D co-culture system. Mouse brain slices are placed on a membrane, and fluorescently labeled human brain tumor cells are allowed to grow on it. Once the system is ready, it is stained for imaging.

ביסוס גידול במוח במודל תרבית משותפת של פרוסות אורגנוטיפיות

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Plating the Slices onto the ...