Name: organotypic hippocampal slice cultures as a model to study neuroprotection and invasiveness of tumor cells
Uploaded: 2017-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
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Die Autoren möchten Christine Auste für ihre Unterstützung mit der video-Aufzeichnung und Chalid Ghadban für seine hervorragenden technischen Betreuung danken. Urszula Grabiec stützten die Roux Programm FKZ 29/18.

Tierversuche wurden gemäß der Ethik-Politik und die Politik auf den Einsatz von Tieren in der neurowissenschaftlichen Forschung durchgeführt, wie von der Europäischen Gemeinschaften Rat Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments genehmigt und des Rates der Europäischen Union über den Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere.
 1. Vorbereitung der Instrumente und Kulturmedien <ol><li>für die Vorbereitung der OHSC verwenden die folgenden Instrumente: zwei kleine Schere, zwei gebogene Pinzetten, eine Pinzette mit einer feinen Spitze drei Klingen (zwei der Größe 11, einer der Größe 15), Inhaber von drei Skalpell Runde Filterpapiere (Durchmesser: 35 mm), Agar, einer Rasierklinge, einer unveränderten Pasteurpipette und eine geändert Pasteurpipette ohne ein Trinkgeld. Sterilisieren Sie alle Materialien in einem Autoklaven vor Verwendung ( Abbildung 1).</li>
	<li>Wiegen 5 g Agar und in 100 mL destilliertem Wasser auflösen. Die Lösung für 20 min bei 121,7 ° C 210,8 kPa im Autoklav zu sterilisieren. Verteilen Sie 3 mL flüssigen Agar Lösung in 60 mm Petrischalen mit einer sterilen Glaspipette zu, lassen Sie es für 5 h zu festigen, Deckel mit plastischen Paraffin Film Kontamination zu vermeiden und bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung speichern. Agar-Blöcke sind notwendig, um das Gehirn während des slicing Verfahrens stabilisieren.</li>
	<li>Media <ol><li>machen 200 mL des Mediums Vorbereitung (pH 7,35) bestehend aus 198 mL minimal wesentliche Medium (MEM) und 2 mL L-Glutamin-Lösung (Endkonzentration 2 mM). Bereiten Sie die Lösung am Tag der Medien Vorbereitung und speichern Sie es auf 4 ° c</li>
		<li>Vorbereiten 100 mL Kulturmedium bestehend aus 49 mL MEM, 25 mL Hanks &#39; ausgewogen Salzlösungen (HBSS), 25 mL (V/V) normales Pferd Serum (NHS), 1 mL L-Glutamin-Lösung (Endkonzentration 2 mM), 100 µg Insulin, Glukose 120 mg, 10 mg Streptomycin , 10.000 U Penicillin und 800 µg Vitamin C wie bereits berichtet. Das Medium (37 ° C) warm, stellen Sie den pH-Wert auf pH 7,4 und steriler Filter (0,2 µm Porengröße). Wiederholen Sie den Vorgang (Aufwärmen, pH-Anpassung, etc..) jeden zweiten Tag vor dem Ändern des Mediums. Verwenden Sie das Medium höchstens eine Woche lang bei Lagerung bei 4 ° c</li>
	</ol></li> <li>Füllen einen 35-mm-Petrischale mit Vorbereitung Medium, das Gehirn zu speichern. Legen Sie zwei leere Petrischalen für das Gewebe auf eine Kühlpackung im Arbeitsbereich sammeln.</li>
</ol> 2. Vorbereitung und Slicing mit einem Vibratome <ol><li>Verwendung Gehirne von 7-9 Tage alten Ratten oder 4-5 Tage alte Mäuse für die OHSC Zubereitung nach Stoppini Et Al. 4 nach der Enthauptung von Tieren, die Haut abziehen vom Schädel mit einer Schere.</li>
	<li>Die Klinge von einer feinen Schere in das Foramen Magnum einführen und Öffnen des Schädels durch Schneiden entlang der kaudalen (wieder) rostral (vorderen) Achse. Machen zwei schneidet senkrecht zur ersten, so dass die Schere in Richtung der linken und rechten Ohr bzw. zeigen (&#34; T-Schnitt &#34;).</li>
	<li>Den Schädel öffnen Sie vorsichtig mit feinen Zangen, die Aufmerksamkeit nicht auf das Gehirn zu verletzen. Ein Skalpell (Klingengröße 11) verwenden, um die meisten rostral Teil der vorderen Pole und das Kleinhirn abgeschnitten.</li>
	<li>Mittels Spatel, entfernen Sie das Gehirn zu und legen Sie es vorsichtig in der Petrischale gefüllt mit Vorbereitung Medium ( Abbildung 2). Das Gehirn auf Probenhalter und fixieren Sie es mit medizinischen Cyanacrylat-Klebstoff. Verwenden Sie die Stücke des Nährbodens zur mechanischen Stabilisierung versichern.</li>
	<li>Sezieren des Gewebes horizontal in 350 µm dicken OHSC mit einer gleitenden Vibratome.</li>
	<li>Bewerten die Scheiben optisch unter Verwendung eines binokularen Mikroskops. OHSC von geringer Qualität sofort zu verwerfen. Es ist wichtig, nur diese Segmente mit intakten Cytoarchitecture isoliert aus dem mittleren Teil des Hippocampus (siehe Abbildungen 3 und 4) zwischen den dorsalen und ventralen Hippocampus.</li>
	<li>Zu trennen, der hippocampal Region und dem entorhinalen Kortex mit einem Skalpell (Runde Klingengröße 15; ( Abbildung 3). Die Perforant Weg und entorhinalen Kortex muss bewahrt werden.</li>
	<li>Werden sechs bis acht OHSC aus jedem Gehirn gewonnen. 2-3 Scheiben in einer Zelle Kultur einfügen (Pore Größe 0,4 µm) und legen Sie sie in einen Brunnen von einer 6-Well Kulturschale mit 1 mL Kulturmedium pro Bohrloch.</li>
	<li>6-wohlen Teller bei 35 ° C in einer voll feuchte Atmosphäre mit 5 % (V/V) CO 2 brüten und ändern das Zellkulturmedium jeden zweiten Tag. 
	Hinweis: Führen Sie Ihre Experimente an 6 Tagen in Vitro (Div). Entzündliche Reaktionen im Zusammenhang mit dem slicing Verfahren verschwinden von Tag 6. In diesem Stadium Mikroglia-Zellen zeigen eine verzweigte Morphologie wieder und synaptische Verbindungen gereift.</li>
</ol> 3. Bewertung der Qualität der Gewebe <ol><li>Fixierung, Kennzeichnung und Visualisierung von degenerierenden Neuronen im OHSC <ol><li>nach der Durchführung der Experimente, brüten die OHSC mit 5 µg/mL Propidium Jodid (PI) für 2 h vor der Fixierung, in zu die Kernen der degenerierenden Neuronen beflecken. 
		Achtung: PI ist karzinogenverdächtig, immer tragen persönlichen Schutzausrüstung (PSA) wie Handschuhe.</li>
		<li>Waschen der OHSC mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) und befestigen Sie sie mit einer 4 % (V/V) Lösung von Paraformaldehyd (PFA) für 24 h 
		Achtung: PFA ist giftig und Verdacht Karzinogen. Arbeiten unter Abzug und PSA tragen.</li>
		<li>Der OHSC in Einsätzen mit 1 mL PBS waschen und mit einem Ausleger Pinsel, um Scheiben von der Membran zu trennen.</li>
		<li>Kennzeichnen die OHSC mit IB 4 Farbstoff in einer 24-Well-Platte ( Abbildung 5).</li>
	</ol></li> <li>Durchführung von Tumor Invasion Experimente mit Gewebekulturen beschriftet Einzelzellen <ol><li>24 h vor dem Start eines Experiments, beschriften Sie die Tumorzellen mithilfe der Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFDA SE).</li>
		<li>Trennen und zählen die Tumorzellen mit einer Neubauer Kammer.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zellen im Medium, 10 µL der Aussetzung der gewünschten Zelle Nummer (normalerweise 50.000 oder 100.000 Zellen) enthält.</li>
		<li>Auftragen 10 µL Zellsuspension auf die Slice-Kultur und die Zellen, für 3 Tage zu erobern.</li>
		<li>Am Ende des Experiments, die Slice-Kulturen mit 4 % (V/V) PFA für 24 h zu beheben, und beschriften Sie die Ko-Kulturen mit PI für ein weiteres 24 h die Cytoarchitecture visualisieren. 
		Achtung: PFA ist giftig und Verdacht Karzinogen. Arbeiten unter Abzug und PSA tragen.</li>
		<li>Ko-Kulturen auf einem Deckglas für weitere Analysen mit Hilfe der Medien Montage montieren.</li>
	</ol></li></ol> 4. Auswertung der OHSC Experimente der OHSC mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) zu analysieren. Zur Erkennung von PI beschriftet, degeneriert Neuronen oder die PI mit der Bezeichnung Cytoarchitecture verwenden monochromatisches Licht der Wellenlänge λ = 543 nm und eine Emission Band pass Filter für Wellenlängen λ = 585-615 nm. Für CFDA Tumorzellen oder IB 4 Mikroglia gekennzeichnet, verwenden eine Erregung Wellenlänge von λ = 488 nm. Für beide experimentelle Arten erfassen einen Z-Stapel mit 2 µm Dicke optische Scheiben und für die Auswertung verwendet.

Die Autoren haben nichts preisgeben

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der OHSC. Dieses Modell ermöglicht die Prüfung der inneren Fähigkeiten und Reaktionen von Hirngewebe nach der Anwendung der physiologischen und pathologischen Reize. Neben Analysen elektrophysiologische Parameter kann OHSC lesioned und die Auswirkungen eines Schadens auf alle Zelltypen ermittelt werden. Behandlung mit verschiedenen Substanzen und die detaillierte Beschreibung der schädigendes Prozesse oder in Ermangelung von Makrophagen und Lymphozyten Heilung ist möglich...

OHSC sind eine gut charakterisierte in Vitro Modell zur physiologische und pathologische Eigenschaften der Neuronen, Astrozyten und Mikroglia1. Es ist einfach die extrazelluläre Umwelt steuert und überwacht die zellulären und morphologische Veränderungen nach verschiedene Reize. Die Organisation der hippocampal Neuronen und ihre Verbindungen sind nach Vorbereitung2,3gut erhalten. Aus mehrere Vorteile OHSC ermöglichen eine Überwachung der Gehirn Verletzungen und Tumor Invasion ohne tierische Operation. Sechs bis acht OHSC erhalten Sie bei einem einzigen Nagetier Gehirn. OHSC daher deutlich reduzieren die Anzahl der Tiere und ermöglichen testen mehrere Drogen Konzentrationen, genetische Manipulationen oder verschiedene Läsion Modelle im gleichen Tier helfen. Im Slice-based Assays können experimentelle Bedingungen exakt gesteuert werden. Darüber hinaus Zeit abhängige Entwicklung von pathologischen Zuständen wie Folgeschäden durch Time-Lapse-Bildgebung leicht überwacht werden können.
In das angegebene Protokoll, ursprünglich festgelegten Stoppini Et al. 4, die Vorbereitungsschritte sind beschrieben und wichtige morphologische Wahrzeichen für die Auswahl der entsprechenden Scheiben werden hervorgehoben. Es wird empfohlen, die Vorbereitung der postnatalen Tag 7-9 Ratten oder postnatale Tag 4-5 Mäuse. In diesen Perioden OHSC zeigen eine robuste Beständigkeit gegen mechanische Verletzungen und ein hohes Potential für die Reorganisation von neuronalen Schaltkreisen. Im Gegensatz dazu Zubereitungen aus embryonalen oder erwachsenen Ratten schnell ändern ihre Struktur verlieren ihre organotypischen Morphologie während des Anbaus und eignen sich daher weniger für das Studium langfristige Prozesse in Grundlagenforschung5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. ein weiterer kritischer Punkt für die Überlebensrate der OHSC ist die Dicke der Scheibe selbst, da die Diffusion und damit Nährstoffversorgung begrenzte12,13,14 sind.

<table><tbody><tr><td>6-Well</td><td>Falcon</td><td>35-3046</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fluka</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Autoclav</td><td>Systec</td><td>DX-45</td><td></td></tr><tr><td>CFDA</td><td>&amp;nbsp;Thermo Fisher</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eagle&amp;acute;s Minimal Essential Medium&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>32360-034</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1101</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merk</td><td>1083371000</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;acute;s Balanced Salt Solution (with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Invitrogen</td><td>24020-133</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;acute;s Balanced Salt Solution (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>LN229</td><td>Cell-Lines-Service</td><td>300363</td><td></td></tr><tr><td>Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)</td><td>B.Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Culture Inserts</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>NMDA N-methyl-D-aspartic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Seum</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (all sizes)</td><td>Greiner</td><td>627160/664160/628160</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Roth</td><td>0335.1</td><td>toxic</td></tr><tr><td>Propidium iodid (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81845-25MG</td><td>toxic</td></tr><tr><td>U138</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT 1200</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypic hippocampal slice cultures as a model to study neuroprotection and invasiveness of tumor cells

Im organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind die morphologischen und funktionellen Eigenschaften der Neuronen und Gliazellen gut erhalten. Dieses Modell eignet sich für den Umgang mit verschiedenen Forschungsfragen, die Studien zur Neuroprotektion, Elektrophysiologische Experimente auf Neuronen, neuronale Netze oder Tumorinvasion beinhalten. Der Hippokampus Architektur und neuronaler Aktivität in multisynaptic Schaltungen sind gut konserviert in OHSC, obwohl das slicing Verfahren selbst zunächst Läsionen und führt zur Bildung einer glial Narbe. Die Narbenbildung ändert vermutlich die mechanischen Eigenschaften und diffusiven Verhalten von kleinen Molekülen, etc.. Scheiben erlauben die Überwachung der Zeit abhängigen Prozesse nach Hirnverletzung ohne tierische Chirurgie und Studien zu Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Gehirn abgeleitet Zelltypen, nämlich Astrozyten, Mikroglia und Neuronen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Ein ambivalenter Aspekt dieses Modells ist das Fehlen von Blutfluss und Immunzellen im Blut. Während der Progression der neuronalen Verletzung Migration Immunzellen aus Blut spielen eine wichtige Rolle. Da diese Zellen in Scheiben fehlen, können die innere Prozesse in der Kultur ohne Einmischung von außen beobachtet werden. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung der Medium-externe Umwelt in OHSC exakt gesteuert. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die geringere Anzahl der geopferten Tiere im Vergleich zu standard-Vorbereitungen. Mehreren OHSC erhalten Sie von einem Tier ermöglichen die gleichzeitige Studien mit mehreren Behandlungen in einem Tier. Aus diesen Gründen OHSC sind gut geeignet, um die Auswirkungen der neuen schützenden Therapeutika nach Gewebeschädigung oder während Tumorinvasion analysieren.
Das Protokoll präsentiert hier beschreibt eine Vorbereitung Methode der OHSC, die Erzeugung von hoch reproduzierbare ermöglicht, gut erhaltene Scheiben, die für eine Vielzahl von experimentellen Untersuchungen, wie z.B. Neuroprotektion oder Tumor Invasion Studien verwendet werden können.

Neuroprotektion Studien: Zur Bestimmung der neuronalen Schaden, die Anzahl der positiven Kerne PI und IB4 positive Mikroglia in jeder dritten optischen Teil des Granulat-Zellschicht (GCL) von den dentate Gyrus (DG) gezählt wurde. Für Tumor Invasion Experimente wurde die maximale Intensität Z-Projektion des Stapels verwendet für die Berechnung der Fläche von Tumorzellen, als Maßnahme der Invasion und verschiedenen Invasion Muster (Abbi...

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Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.8K Aufrufe.  Martin Luther University Halle-Wittenberg. Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.

Serie: Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Neurowissenschaften

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Co-Kultur-System mit einer Scheibe Organotypische Gehirn-und 3D-Sphäroid von Karzinomzellen

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Medizin

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Ein Hirntumor / Organotypischen Co-Kultursystem für die Untersuchung Tumor-Microenvironment und gezielte Arzneimitteltherapie

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Ein menschliches Glioblastom Organotypisches Scheibenkulturmodell zur Untersuchung der Tumorzellmigration und patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Arzneimitteln

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early postnatal development, cerebellar Purkinje cells are known to go through a vulnerable period, during which they undergo programmed cell death. Here, we provide a detailed protocol to perform mouse organotypic cerebellar slice culture during this critical time. The slices are further labeled to assess Purkinje cell survival and the efficacy of neuroprotective treatments. This method can be extremely valuable to screen for new neuroactive molecules.

Organotypic slice cultures are a powerful tool to study neurodevelopmental or degenerative/regenerative processes. Here, we describe a protocol that models the neurodevelopmental death of Purkinje cells in mouse cerebellar slice cultures. This method may benefit research in neuroprotective drug discovery.

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

Ein Modell der Epileptogenese in rhinalen Kortex-Hippocampus Organotypischen Schnittkulturen

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Establishing a Brain Tumor in an Organotypic Slice Co-culture Model

Source: Chadwick, E. J. et al. <a href="https://app.jove.com/v/53304">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the development of a 3D co-culture system. Mouse brain slices are placed on a membrane, and fluorescently labeled human brain tumor cells are allowed to grow on it. Once the system is ready, it is stained for imaging.

Etablierung eines Hirntumors in einem organotypischen Scheiben-Co-Kulturmodell

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Plating the Slices onto the ...