Die Autoren möchten Christine Auste für ihre Unterstützung mit der video-Aufzeichnung und Chalid Ghadban für seine hervorragenden technischen Betreuung danken. Urszula Grabiec stützten die Roux Programm FKZ 29/18.

Tierversuche wurden gemäß der Ethik-Politik und die Politik auf den Einsatz von Tieren in der neurowissenschaftlichen Forschung durchgeführt, wie von der Europäischen Gemeinschaften Rat Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments genehmigt und des Rates der Europäischen Union über den Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere.
 1. Vorbereitung der Instrumente und Kulturmedien <ol><li>für die Vorbereitung der OHSC verwenden die folgenden Instrumente: zwei kleine Schere, zwei gebogene Pinzetten, eine Pinzette mit einer feinen Spitze drei Klingen (zwei der Größe 11, einer der Größe 15), Inhaber von drei Skalpell Runde Filterpapiere (Durchmesser: 35 mm), Agar, einer Rasierklinge, einer unveränderten Pasteurpipette und eine geändert Pasteurpipette ohne ein Trinkgeld. Sterilisieren Sie alle Materialien in einem Autoklaven vor Verwendung ( Abbildung 1).</li>
	<li>Wiegen 5 g Agar und in 100 mL destilliertem Wasser auflösen. Die Lösung für 20 min bei 121,7 ° C 210,8 kPa im Autoklav zu sterilisieren. Verteilen Sie 3 mL flüssigen Agar Lösung in 60 mm Petrischalen mit einer sterilen Glaspipette zu, lassen Sie es für 5 h zu festigen, Deckel mit plastischen Paraffin Film Kontamination zu vermeiden und bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung speichern. Agar-Blöcke sind notwendig, um das Gehirn während des slicing Verfahrens stabilisieren.</li>
	<li>Media <ol><li>machen 200 mL des Mediums Vorbereitung (pH 7,35) bestehend aus 198 mL minimal wesentliche Medium (MEM) und 2 mL L-Glutamin-Lösung (Endkonzentration 2 mM). Bereiten Sie die Lösung am Tag der Medien Vorbereitung und speichern Sie es auf 4 ° c</li>
		<li>Vorbereiten 100 mL Kulturmedium bestehend aus 49 mL MEM, 25 mL Hanks &#39; ausgewogen Salzlösungen (HBSS), 25 mL (V/V) normales Pferd Serum (NHS), 1 mL L-Glutamin-Lösung (Endkonzentration 2 mM), 100 µg Insulin, Glukose 120 mg, 10 mg Streptomycin , 10.000 U Penicillin und 800 µg Vitamin C wie bereits berichtet. Das Medium (37 ° C) warm, stellen Sie den pH-Wert auf pH 7,4 und steriler Filter (0,2 µm Porengröße). Wiederholen Sie den Vorgang (Aufwärmen, pH-Anpassung, etc..) jeden zweiten Tag vor dem Ändern des Mediums. Verwenden Sie das Medium höchstens eine Woche lang bei Lagerung bei 4 ° c</li>
	</ol></li> <li>Füllen einen 35-mm-Petrischale mit Vorbereitung Medium, das Gehirn zu speichern. Legen Sie zwei leere Petrischalen für das Gewebe auf eine Kühlpackung im Arbeitsbereich sammeln.</li>
</ol> 2. Vorbereitung und Slicing mit einem Vibratome <ol><li>Verwendung Gehirne von 7-9 Tage alten Ratten oder 4-5 Tage alte Mäuse für die OHSC Zubereitung nach Stoppini Et Al. 4 nach der Enthauptung von Tieren, die Haut abziehen vom Schädel mit einer Schere.</li>
	<li>Die Klinge von einer feinen Schere in das Foramen Magnum einführen und Öffnen des Schädels durch Schneiden entlang der kaudalen (wieder) rostral (vorderen) Achse. Machen zwei schneidet senkrecht zur ersten, so dass die Schere in Richtung der linken und rechten Ohr bzw. zeigen (&#34; T-Schnitt &#34;).</li>
	<li>Den Schädel öffnen Sie vorsichtig mit feinen Zangen, die Aufmerksamkeit nicht auf das Gehirn zu verletzen. Ein Skalpell (Klingengröße 11) verwenden, um die meisten rostral Teil der vorderen Pole und das Kleinhirn abgeschnitten.</li>
	<li>Mittels Spatel, entfernen Sie das Gehirn zu und legen Sie es vorsichtig in der Petrischale gefüllt mit Vorbereitung Medium ( Abbildung 2). Das Gehirn auf Probenhalter und fixieren Sie es mit medizinischen Cyanacrylat-Klebstoff. Verwenden Sie die Stücke des Nährbodens zur mechanischen Stabilisierung versichern.</li>
	<li>Sezieren des Gewebes horizontal in 350 µm dicken OHSC mit einer gleitenden Vibratome.</li>
	<li>Bewerten die Scheiben optisch unter Verwendung eines binokularen Mikroskops. OHSC von geringer Qualität sofort zu verwerfen. Es ist wichtig, nur diese Segmente mit intakten Cytoarchitecture isoliert aus dem mittleren Teil des Hippocampus (siehe Abbildungen 3 und 4) zwischen den dorsalen und ventralen Hippocampus.</li>
	<li>Zu trennen, der hippocampal Region und dem entorhinalen Kortex mit einem Skalpell (Runde Klingengröße 15; ( Abbildung 3). Die Perforant Weg und entorhinalen Kortex muss bewahrt werden.</li>
	<li>Werden sechs bis acht OHSC aus jedem Gehirn gewonnen. 2-3 Scheiben in einer Zelle Kultur einfügen (Pore Größe 0,4 µm) und legen Sie sie in einen Brunnen von einer 6-Well Kulturschale mit 1 mL Kulturmedium pro Bohrloch.</li>
	<li>6-wohlen Teller bei 35 ° C in einer voll feuchte Atmosphäre mit 5 % (V/V) CO 2 brüten und ändern das Zellkulturmedium jeden zweiten Tag. 
	Hinweis: Führen Sie Ihre Experimente an 6 Tagen in Vitro (Div). Entzündliche Reaktionen im Zusammenhang mit dem slicing Verfahren verschwinden von Tag 6. In diesem Stadium Mikroglia-Zellen zeigen eine verzweigte Morphologie wieder und synaptische Verbindungen gereift.</li>
</ol> 3. Bewertung der Qualität der Gewebe <ol><li>Fixierung, Kennzeichnung und Visualisierung von degenerierenden Neuronen im OHSC <ol><li>nach der Durchführung der Experimente, brüten die OHSC mit 5 µg/mL Propidium Jodid (PI) für 2 h vor der Fixierung, in zu die Kernen der degenerierenden Neuronen beflecken. 
		Achtung: PI ist karzinogenverdächtig, immer tragen persönlichen Schutzausrüstung (PSA) wie Handschuhe.</li>
		<li>Waschen der OHSC mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) und befestigen Sie sie mit einer 4 % (V/V) Lösung von Paraformaldehyd (PFA) für 24 h 
		Achtung: PFA ist giftig und Verdacht Karzinogen. Arbeiten unter Abzug und PSA tragen.</li>
		<li>Der OHSC in Einsätzen mit 1 mL PBS waschen und mit einem Ausleger Pinsel, um Scheiben von der Membran zu trennen.</li>
		<li>Kennzeichnen die OHSC mit IB 4 Farbstoff in einer 24-Well-Platte ( Abbildung 5).</li>
	</ol></li> <li>Durchführung von Tumor Invasion Experimente mit Gewebekulturen beschriftet Einzelzellen <ol><li>24 h vor dem Start eines Experiments, beschriften Sie die Tumorzellen mithilfe der Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFDA SE).</li>
		<li>Trennen und zählen die Tumorzellen mit einer Neubauer Kammer.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zellen im Medium, 10 µL der Aussetzung der gewünschten Zelle Nummer (normalerweise 50.000 oder 100.000 Zellen) enthält.</li>
		<li>Auftragen 10 µL Zellsuspension auf die Slice-Kultur und die Zellen, für 3 Tage zu erobern.</li>
		<li>Am Ende des Experiments, die Slice-Kulturen mit 4 % (V/V) PFA für 24 h zu beheben, und beschriften Sie die Ko-Kulturen mit PI für ein weiteres 24 h die Cytoarchitecture visualisieren. 
		Achtung: PFA ist giftig und Verdacht Karzinogen. Arbeiten unter Abzug und PSA tragen.</li>
		<li>Ko-Kulturen auf einem Deckglas für weitere Analysen mit Hilfe der Medien Montage montieren.</li>
	</ol></li></ol> 4. Auswertung der OHSC Experimente der OHSC mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) zu analysieren. Zur Erkennung von PI beschriftet, degeneriert Neuronen oder die PI mit der Bezeichnung Cytoarchitecture verwenden monochromatisches Licht der Wellenlänge λ = 543 nm und eine Emission Band pass Filter für Wellenlängen λ = 585-615 nm. Für CFDA Tumorzellen oder IB 4 Mikroglia gekennzeichnet, verwenden eine Erregung Wellenlänge von λ = 488 nm. Für beide experimentelle Arten erfassen einen Z-Stapel mit 2 µm Dicke optische Scheiben und für die Auswertung verwendet.

Die Autoren haben nichts preisgeben

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der OHSC. Dieses Modell ermöglicht die Prüfung der inneren Fähigkeiten und Reaktionen von Hirngewebe nach der Anwendung der physiologischen und pathologischen Reize. Neben Analysen elektrophysiologische Parameter kann OHSC lesioned und die Auswirkungen eines Schadens auf alle Zelltypen ermittelt werden. Behandlung mit verschiedenen Substanzen und die detaillierte Beschreibung der schädigendes Prozesse oder in Ermangelung von Makrophagen und Lymphozyten Heilung ist möglich...

OHSC sind eine gut charakterisierte in Vitro Modell zur physiologische und pathologische Eigenschaften der Neuronen, Astrozyten und Mikroglia1. Es ist einfach die extrazelluläre Umwelt steuert und überwacht die zellulären und morphologische Veränderungen nach verschiedene Reize. Die Organisation der hippocampal Neuronen und ihre Verbindungen sind nach Vorbereitung2,3gut erhalten. Aus mehrere Vorteile OHSC ermöglichen eine Überwachung der Gehirn Verletzungen und Tumor Invasion ohne tierische Operation. Sechs bis acht OHSC erhalten Sie bei einem einzigen Nagetier Gehirn. OHSC daher deutlich reduzieren die Anzahl der Tiere und ermöglichen testen mehrere Drogen Konzentrationen, genetische Manipulationen oder verschiedene Läsion Modelle im gleichen Tier helfen. Im Slice-based Assays können experimentelle Bedingungen exakt gesteuert werden. Darüber hinaus Zeit abhängige Entwicklung von pathologischen Zuständen wie Folgeschäden durch Time-Lapse-Bildgebung leicht überwacht werden können.
In das angegebene Protokoll, ursprünglich festgelegten Stoppini Et al. 4, die Vorbereitungsschritte sind beschrieben und wichtige morphologische Wahrzeichen für die Auswahl der entsprechenden Scheiben werden hervorgehoben. Es wird empfohlen, die Vorbereitung der postnatalen Tag 7-9 Ratten oder postnatale Tag 4-5 Mäuse. In diesen Perioden OHSC zeigen eine robuste Beständigkeit gegen mechanische Verletzungen und ein hohes Potential für die Reorganisation von neuronalen Schaltkreisen. Im Gegensatz dazu Zubereitungen aus embryonalen oder erwachsenen Ratten schnell ändern ihre Struktur verlieren ihre organotypischen Morphologie während des Anbaus und eignen sich daher weniger für das Studium langfristige Prozesse in Grundlagenforschung5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. ein weiterer kritischer Punkt für die Überlebensrate der OHSC ist die Dicke der Scheibe selbst, da die Diffusion und damit Nährstoffversorgung begrenzte12,13,14 sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:412px;">6-Well</td>
			<td style="width:204px;">Falcon</td>
			<td style="width:179px;">35-3046</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Autoclav</td>
			<td>Systec</td>
			<td>DX-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFDA</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher</td>
			<td>V12883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eagle&#180;s Minimal Essential Medium&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>32360-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FL-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein labeled GSL I &#8211; isolectin B4</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FL-1201&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1083371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hank&#180;s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24020-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hank&#180;s Balanced Salt Solution (without Ca2+&#160; and Mg2+)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LN229</td>
			<td>Cell-Lines-Service</td>
			<td>300363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Millicell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NMDA N-methyl-D-aspartic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal Horse Seum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dishes (all sizes)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>627160/664160/628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0335.1</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium iodid (PI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>81845-25MG</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U138</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica VT 1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic hippocampal slice cultures as a model to study neuroprotection and invasiveness of tumor cells

Im organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind die morphologischen und funktionellen Eigenschaften der Neuronen und Gliazellen gut erhalten. Dieses Modell eignet sich für den Umgang mit verschiedenen Forschungsfragen, die Studien zur Neuroprotektion, Elektrophysiologische Experimente auf Neuronen, neuronale Netze oder Tumorinvasion beinhalten. Der Hippokampus Architektur und neuronaler Aktivität in multisynaptic Schaltungen sind gut konserviert in OHSC, obwohl das slicing Verfahren selbst zunächst Läsionen und führt zur Bildung einer glial Narbe. Die Narbenbildung ändert vermutlich die mechanischen Eigenschaften und diffusiven Verhalten von kleinen Molekülen, etc.. Scheiben erlauben die Überwachung der Zeit abhängigen Prozesse nach Hirnverletzung ohne tierische Chirurgie und Studien zu Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Gehirn abgeleitet Zelltypen, nämlich Astrozyten, Mikroglia und Neuronen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Ein ambivalenter Aspekt dieses Modells ist das Fehlen von Blutfluss und Immunzellen im Blut. Während der Progression der neuronalen Verletzung Migration Immunzellen aus Blut spielen eine wichtige Rolle. Da diese Zellen in Scheiben fehlen, können die innere Prozesse in der Kultur ohne Einmischung von außen beobachtet werden. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung der Medium-externe Umwelt in OHSC exakt gesteuert. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die geringere Anzahl der geopferten Tiere im Vergleich zu standard-Vorbereitungen. Mehreren OHSC erhalten Sie von einem Tier ermöglichen die gleichzeitige Studien mit mehreren Behandlungen in einem Tier. Aus diesen Gründen OHSC sind gut geeignet, um die Auswirkungen der neuen schützenden Therapeutika nach Gewebeschädigung oder während Tumorinvasion analysieren.
Das Protokoll präsentiert hier beschreibt eine Vorbereitung Methode der OHSC, die Erzeugung von hoch reproduzierbare ermöglicht, gut erhaltene Scheiben, die für eine Vielzahl von experimentellen Untersuchungen, wie z.B. Neuroprotektion oder Tumor Invasion Studien verwendet werden können.

Neuroprotektion Studien: Zur Bestimmung der neuronalen Schaden, die Anzahl der positiven Kerne PI und IB4 positive Mikroglia in jeder dritten optischen Teil des Granulat-Zellschicht (GCL) von den dentate Gyrus (DG) gezählt wurde. Für Tumor Invasion Experimente wurde die maximale Intensität Z-Projektion des Stapels verwendet für die Berechnung der Fläche von Tumorzellen, als Maßnahme der Invasion und verschiedenen Invasion Muster (Abbi...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells at JoVE.com

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

organotypic-hippocampal-slice-cultures-as-model-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.8K Aufrufe.  Martin Luther University Halle-Wittenberg. Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.

Serie: Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early postnatal development, cerebellar Purkinje cells are known to go through a vulnerable period, during which they undergo programmed cell death. Here, we provide a detailed protocol to perform mouse organotypic cerebellar slice culture during this critical time. The slices are further labeled to assess Purkinje cell survival and the efficacy of neuroprotective treatments. This method can be extremely valuable to screen for new neuroactive molecules.

Organotypic slice cultures are a powerful tool to study neurodevelopmental or degenerative/regenerative processes. Here, we describe a protocol that models the neurodevelopmental death of Purkinje cells in mouse cerebellar slice cultures. This method may benefit research in neuroprotective drug discovery.

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine in Hippocampusschnitt Kulturen

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine in Hippocampusschnitt Kulturen