Gli autori vorrei ringraziare Christine Auste per il suo sostegno con la registrazione video e Chalid Ghadban per la sua eccellente assistenza tecnica. Urszula Grabiec è stato sostenuto dalle Roux Programm FKZ 29/18.

gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo criteri di etica e la politica di uso di animali nella ricerca in neuroscienza, come approvato dall'europeo comunità Consiglio direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio dell'Unione europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.
 1. preparazione degli strumenti e mezzi di coltura <ol><li>per la preparazione di OHSC utilizzare il seguente set di strumenti: due piccole forbici, due Pinzette curve, una pinzetta con punta sottile, tre lame (due di dimensioni 11, uno di dimensioni 15), tre titolari di bisturi, tondo di carta da filtro (diametro: 35 mm), agar, una lama di rasoio, uno non modificato pipetta Pasteur, e uno per volta pipetta Pasteur senza un suggerimento. Sterilizzare tutti i materiali in autoclave prima dell'uso ( Figura 1).</li>
	<li>Pesare 5 g di agar e dissolverlo in 100 mL di acqua distillata. Sterilizzare la soluzione per 20 min a 121,7 ° C a 210,8 kPa in autoclave. Distribuire la soluzione di liquido agar 3 mL in piastre di Petri 60-mm utilizzando una pipetta di vetro sterile, lasciarlo solidificare per 5 h, coprire con la pellicola di plastica paraffina per evitare contaminazione e conservare a 4 ° C fino al successivo utilizzo. Blocchi di agar sono necessari per stabilizzare il cervello durante la procedura d'affettatura.</li>
	<li>Media <ol><li>fare 200 mL di terreno preparazione (pH 7,35) costituito da 198 mL di terreno minimo essenziale (MEM) e 2 mL di soluzione di L-Glutammina (concentrazione finale di 2 mM). Preparare la soluzione il giorno della preparazione media e conservarla a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare 100 mL di terreno di coltura costituito da 49 mL MEM, 25ml Hanks &#39; equilibrato soluzioni saline (HBSS), 25 mL (v/v) di siero di cavallo normale (NHS), 1 mL di soluzione di L-Glutammina (concentrazione finale di 2 mM), 100 µ g insulina, glucosio 120 mg, streptomicina 10 mg , 10.000 U penicillina e 800 µ g di vitamina C come riportato in precedenza. Riscaldare il mezzo (37 ° C), regolare il valore di pH al filtro pH 7,4 e sterile (dimensione dei pori di 0,2 µm). Ripetere la procedura (riscaldamento, regolazione del pH, ecc.) ogni secondo giorno prima di cambiare il mezzo. Utilizzare il mezzo al massimo per una settimana se conservato a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Riempire una scatola di Petri 35 mm con preparazione mezzo per memorizzare il cervello. Posizionare due capsule di Petri vuota per raccogliere il tessuto su un pacchetto di raffreddamento nell'area di lavoro.</li>
</ol> 2. Preparazione e affettare con un vibratomo <ol><li>uso cervelli dai ratti di 7-9 ° giorno vecchio o 4-5 gg vecchi topi per la preparazione di OHSC secondo Stoppini et al. 4 dopo la decapitazione di animali, togliere la pelle dal cranio con le forbici.</li>
	<li>Introdurre la lama di una forbice bene il foro occipitale e aprire il cranio di taglio lungo l'asse (anteriore) (posteriore) rostrale caudale. Fare due tagli perpendicolari ad esso, cosicché le forbici puntino verso l'orecchio sinistro e destro, rispettivamente (&#34; T-incisione &#34;).</li>
	<li>Apre il cranio accuratamente con una pinzetta, facendo attenzione di non danneggiare il cervello. Utilizzare un bisturi (dimensione lama 11) per tagliare la parte più rostrale del palo frontale e il cervelletto.</li>
	<li>Per mezzo di una spatola, rimuovere il cervello e inserirlo con cautela di Petri riempito con il mezzo di preparazione ( Figura 2). Posizionare il cervello sul portacampioni e fissarlo con colla del cianoacrilato medico. Utilizzare i pezzi di agar per assicurare la stabilizzazione meccanica.</li>
	<li>Sezionare il tessuto orizzontalmente a 350 µm spessore OHSC utilizzando una scorrevole vibratome.</li>
	<li>Valutare le fette otticamente utilizzando un microscopio binoculare. Scartare immediatamente OHSC di bassa qualità. È importante prendere solo quelli fette con intatto cytoarchitecture isolato dalla parte centrale dell'ippocampo (Vedi figure 3 e 4) tra la dorsale e l'ippocampo ventrale.</li>
	<li>Separare la regione ippocampale e nella corteccia di entorhinal usando un bisturi (tondo lama taglia 15; Figura 3). Deve essere preservata la corteccia di pathway ed entorinale perforant.</li>
	<li>Sei-otto OHSC sono ottenuti da ogni cervello. 2-3 fette di trasferimento nell'inserto di cultura di una cella (poro taglia 0,4 µm) e posizionarlo in un pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti contenenti 1 mL di coltura per pozzetto.</li>
	<li>Incubare i piatti 6 pozzetti a 35 ° C in atmosfera umidificata completamente con 5% (v/v) di CO 2 e modificare il terreno di coltura cellulare ogni secondo giorno. 
	Nota: Il tuo esperimenti al giorno 6 in vitro (div). Reazioni infiammatorie associate alla procedura per affettare scompaiono di giorno 6. In questa fase, le cellule microgliali mostrano una morfologia ramificata nuovamente e connessioni sinaptiche hanno fatto maturare.</li>
</ol> 3. Valutazione della qualita ' del tessuto <ol><li>fissazione, etichettatura e visualizzazione di degenerazione neuroni in OHSC <ol><li>dopo aver eseguito gli esperimenti, incubare la OHSC con ioduro di propidio (PI) di 5 µ g/mL per 2 h prima della fissazione, in ordine a macchiare i nuclei dei neuroni in degenerazione. 
		Attenzione: PI è un sospetto cancerogeno, indossare sempre dispositivi di protezione individuale (PPE) ad esempio guanti.</li>
		<li>Lavare il OHSC con 0.1 M tampone fosfato (pH 7,4) e fissarle con una soluzione al 4% (v/v) di paraformaldeide (PFA) per 24 h. 
		Attenzione: PFA è un tossico e sospetto cancerogeno. Lavorare sotto cappa e indossare PPE.</li>
		<li>Lavare il OHSC in inserti con 1 mL di PBS e utilizzare un pennello rigger per separare le fette dalla membrana.</li>
		<li>Etichetta OHSC con IB 4 colorante in una piastra a 24 pozzetti ( Figura 5).</li>
	</ol></li> <li>Conduzione di esperimenti di invasione tumorale utilizzando fluorescente etichettati celluli <ol><li>24 h prima dell'inizio di un esperimento, etichettare le cellule del tumore usando la tintura fluorescente Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl estere (SE CFDA).</li>
		<li>Detach e contare le cellule del tumore utilizzando una camera di Neubauer.</li>
		<li>Risospendere le cellule in mezzo, tale che 10 µ l di sospensione contiene il numero di cella desiderata (normalmente 50.000 o 100.000 cellule).</li>
		<li>Applicare 10 µ l della sospensione delle cellule sulla cultura fetta e permettono alle cellule di invadere per 3 giorni.</li>
		<li>Alla fine dell'esperimento, correggere le culture fetta utilizzando 4% (v/v) PFA per 24 h ed etichettare le co-culture con PI per altre 24 ore per visualizzare la citoarchitettura. 
		Attenzione: PFA è un tossico e sospetto cancerogeno. Lavorare sotto cappa e indossare PPE.</li>
		<li>Montare il co-colture su un vetrino coprioggetto per ulteriori analisi utilizzando i supporti di montaggio.</li>
	</ol></li></ol> 4. Valutazione di OHSC esperimenti analizzare il OHSC con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM). Per rilevazione di PI etichettati, degenerando neuroni o il PI etichettato cytoarchitecture utilizzare luce monocromatica di lunghezza d'onda λ = 543 nm e una banda di emissione passare filtro per lunghezze d'onda λ = 585-615 nm. Per CFDA etichettato le cellule del tumore o IB 4 microglia, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di λ = 488 nm. Per entrambi i tipi sperimentali, registrano un z-stack con 2 µm spessore ottico fette e utilizzati per la valutazione.

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Il presente protocollo descrive la preparazione di OHSC. Questo modello consente di testare delle capacità intrinseche e reazioni del tessuto cerebrale dopo l'applicazione di stimoli fisiologici e patologici. Oltre alle analisi dei parametri elettrofisiologici, OHSC può essere leso e gli effetti di danni su tutti i tipi di cellule possono essere determinati. Trattamento con sostanze diverse e la descrizione dettagliata di lesioning processi o guarigione in assenza di macrofagi e linfociti è possibile.
<p class="jo...

OHSC sono un modello ben caratterizzati in vitro per studiare proprietà fisiologica e patologica di neuroni, astrociti e microglia1. È facile controllare l'ambiente extracellulare e monitorare i cambiamenti morfologici e cellulari dopo vari stimoli. L'organizzazione dei neuroni ippocampali e le loro connessioni sono ben conservati dopo preparazione2,3. Fuori parecchi vantaggi, OHSC consentire il monitoraggio dell'invasione del tumore e lesioni di cervello senza chirurgia degli animali. Sei-otto OHSC ottenibile da un singolo cervello del roditore. OHSC consentono pertanto significativamente ridurre il numero di animali e test più concentrazioni nella droga, manipolazioni genetiche o modelli differenti della lesione dello stesso animale. Nelle analisi basate su fetta, condizioni sperimentali possono essere controllate con precisione. Inoltre, può essere facilmente monitorato lo sviluppo dipendente dal tempo di condizioni patologiche come danni secondari da formazione immagine di time-lapse.
Nel protocollo specificato, originariamente costituito da Stoppini et al. 4, le operazioni di preparazione sono descritte e importanti punti di riferimento morfologici per la selezione delle fette appropriati vengono evidenziati. Si consiglia la preparazione postnatale giorno 7-9 ratti o topi postnatale giorno 4-5. In questi periodi, OHSC mostrano una robusta resistenza a traumi meccanici e un elevato potenziale di riorganizzazione dei circuiti neuronali. Al contrario, preparati dai ratti embrionali o adulti rapidamente cambiare la loro struttura e perdono la loro morfologia organotipiche durante la coltivazione e quindi sono meno adatti per lo studio dei processi a lungo termine in ricerca di base5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. un altro punto critico per il tasso di sopravvivenza di OHSC è lo spessore della fetta stessa, come la diffusione e quindi l'apporto nutritivo sono limitata12,13,14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:412px;">6-Well</td>
			<td style="width:204px;">Falcon</td>
			<td style="width:179px;">35-3046</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Autoclav</td>
			<td>Systec</td>
			<td>DX-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFDA</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher</td>
			<td>V12883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eagle&#180;s Minimal Essential Medium&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>32360-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FL-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein labeled GSL I &#8211; isolectin B4</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FL-1201&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1083371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hank&#180;s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24020-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hank&#180;s Balanced Salt Solution (without Ca2+&#160; and Mg2+)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LN229</td>
			<td>Cell-Lines-Service</td>
			<td>300363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Millicell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NMDA N-methyl-D-aspartic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal Horse Seum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dishes (all sizes)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>627160/664160/628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0335.1</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium iodid (PI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>81845-25MG</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U138</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica VT 1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic hippocampal slice cultures as a model to study neuroprotection and invasiveness of tumor cells

In colture hippocampal fetta organotipiche (OHSC), le caratteristiche morfologiche e funzionali di neuroni e cellule gliali sono ben conservate. Questo modello è adatto per affrontare questioni di ricerca diversi che coinvolgono studi sulla neuroprotezione, esperimenti elettrofisiologici sui neuroni, reti neuronali o l'invasione del tumore. L'architettura hippocampal e attività neuronale nei circuiti multisinaptici sono ben conservati in OHSC, anche se la stessa procedura per affettare inizialmente lesioni e conduce alla formazione di una cicatrice gliale. La formazione della cicatrice presumibilmente altera le proprietà meccaniche e comportamento diffusivo di piccole molecole, ecc. Fette di consentono il monitoraggio dei processi dipendenti tempo dopo il trauma cranico senza chirurgia animale e gli studi sulle interazioni tra vari tipi di cellule di cervello-derivato, vale a dire gli astrociti, microglia e neuroni sotto sia fisiologiche che patologiche condizioni. Un aspetto ambivalente di questo modello è l'assenza di flusso di sangue e le cellule immunitarie del sangue. Durante la progressione della lesione di un neurone, migrazione di cellule immuni dai giochi un ruolo importante di sangue. Come quelle cellule mancano in fette, i processi intrinseci nella cultura possono essere osservati senza interferenze esterne. Inoltre, in OHSC la composizione dell'ambiente medio-esterno è controllata con precisione. Un ulteriore vantaggio di questo metodo è il più basso numero di animali sacrificati rispetto alle preparazioni standard. OHSC diversi possono essere ottenuti da un animale, rendendo possibile la simultanei studi con trattamenti multipli in un animale. Per questi motivi, OHSC sono ben si adatta per analizzare gli effetti di nuove terapie protettive dopo danno tissutale o durante l'invasione del tumore.
Il protocollo presentato qui descrive un metodo di preparazione di OHSC che permette di generare altamente riproducibili, ben conservato fette che possono essere utilizzati per una varietà di ricerca sperimentale, come studi di invasione del tumore o di neuroprotezione.

Studi di neuroprotezione: Per determinare il danno neuronale, il numero di nuclei positivi PI e IB4 positivo microglia in ogni terza sezione ottica di strato delle cellule del granello (GCL) del giro dentato (DG) è stata contata. Per esperimenti di invasione tumorale, la z-proiezione di intensità massima dello stack è stata usata per calcolare l'area coperta dalle cellule del tumore, come una misura di invasione e di visualizzare i flussi di invasione divers...

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Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Colture organotipiche fettine di ippocampo (OHSC) rappresentano un modello in vitro che simula molto bene la situazione in vivo . Qui descriviamo un basato su vibratome migliorato affettare protocollo per ottenere fette di alta qualità per uso nel valutare il potenziale di neuroprotective del romanzo sostanze o il comportamento biologico delle cellule del tumore.

Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.8K Views.  Martin Luther University Halle-Wittenberg. Colture organotipiche fettine di ippocampo (OHSC) rappresentano un modello in vitro che simula molto bene la situazione in vivo . Qui descriviamo un basato su vibratome migliorato affettare protocollo per ottenere fette di alta qualità per uso nel valutare il potenziale di neuroprotective del romanzo sostanze o il comportamento biologico delle cellule del tumore.

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Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l&#39;esame di danno neuronale

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Neuroscienze

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipica Culture Slice ippocampale

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

Un modello di fetta di cervello Ex Vivo per studiare e indirizzare la crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Ricerca sul cancro

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Medicina

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

L&#39;analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Un tumore cerebrale / organotipica fetta sistema di co-coltura per lo Studio microambiente tumorale e mirata terapie farmacologiche

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Un modello di cultura organica fetta di Glioblastoma umano per lo studio della migrazione delle cellule tumorali e degli effetti specifici del paziente di farmaci antiinvasivi

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

Un modello di epileptogenesi nelle culture delle fette organotipiche della corteccia rinale-ippocampo

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Establishing a Brain Tumor in an Organotypic Slice Co-culture Model

Source: Chadwick, E. J. et al. <a href="https://app.jove.com/v/53304">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the development of a 3D co-culture system. Mouse brain slices are placed on a membrane, and fluorescently labeled human brain tumor cells are allowed to grow on it. Once the system is ready, it is stained for imaging.

Stabilire un tumore cerebrale in un modello di co-coltura a fette organotipiche

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Plating the Slices onto the ...

Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

Riepilogo

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