Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
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Wir erkennen an Austin Cyphersmith und mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institute for Genomic Biologie, Universität von Illinois in Urbana-Champaign) für die Unterstützung bei der Mikroskopie und für die großzügige Aufnahme von Bildschirm und Video-Capture in der Mikroskopie Kern.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In unseren Experimenten haben wir, dass die häufigste Defekt gefunden auf die Qualität der hergestellten Arrays verbunden sind und schlecht Reaktion im biologischen System von Interesse charakterisiert. Wir verweisen auf die Tabelle 1 für die gemeinsame Ausfallarten in Zellmikroarray - Experimenten und der damit verbundenen Schritte zur Fehlerbehebung. In Bezug auf die Qualität von Arrays insbesondere empfehlen wir folgendes. Bestätigen Sie die technische Qualität und Robustheit der Gruppierungs Programme, Parameter und Puffer fluoreszenzmarkierte Moleküle wie Rhodamin-konjugierten Dextran verwendet wird. Gründlich reinigen Stifte entweder vor oder nach dem Gruppierungs pro Anweisungen des Herstellers und weitere visuell zu überprüfen, dass die Stiftkanäle frei sind von Schutt mit einem Lichtmikroskop. Bestätigen Sie gruppierten Biomolekül Retention unter Verwendung der allgemeinen Protein Flecken oder Immunmarkierung. Man beachte , dass Biomoleküle mit einem Molekulargewicht unter 70 kDa sind, häufig nicht 23 in dem Hydrogel beibehalten </<html> sup&gt; 31. Validieren gruppierten Biomolekül Zell-Funktionalität mehrere Zelltypen verwendet. Beachten Sie, dass nur anhaftenden Zellen mit Arrays kompatibel sind; Zusätzlich Haftung auf Arrays hängt sowohl zellspezifischen Eigenschaften (zB Integrin - Expressionsprofil) und den ausgewählten ECM Proteine. Aufgrund des beschränkten Platz, haben wir nicht eine umfassende Behandlung von Array - Design, Layout und Fertigung hier und verweisen den Leser auf vorherigen 23 vorgesehen funktioniert, 25. Wir verwenden in der Regel 100 Spot Subarrays (150 &amp; mgr; m Fleckdurchmesser, 450 &amp; mgr; m von Mitte zu Mitte Abstand) , bestehend aus 10-20 einzigartigen Biomolekül Bedingungen (dh 5-10 Punkte / Zustand). Die Anzahl der Sub-Arrays in einem Array in Abhängigkeit von der Anzahl der Biomolekül Bedingungen von Interesse abhängig, die bequem bis zu einer 25 × 75 mm Objektträger bis 1.280 skaliert werden kann (~ 6.400 Spots in 64 Subarrays)xref &quot;&gt; 25, 31 Die Parameter weiter oben in Abhängigkeit von der Mustergröße von Interesse variieren;. Stifte in der Lage , Muster von 75 zu erzeugen - 450 &amp; mgr; m sind leicht verfügbar. Array-Experimente werden am besten durch die Validierung von High-Scoring angeordnet Bedingungen von Interesse unter Verwendung anderer Kulturformate, Assay Ablesungen ergänzt und biologische Modellsysteme. Insbesondere empfehlen wir weitere Effekte von ausgewählten Array - Bedingungen Validierung unter Verwendung von Massenkulturen in Verbindung mit molekularbiologischen Standardtechniken (zB qRT-PCR, Immunoblot) oder Standard - TFM. Genetische Manipulation (zB Zuschlags oder Überexpression) des Faktors von Interesse in einem geeigneten biologischen Modellsystem kann auch dazu dienen , Effekte in Arrays beobachtet , um zu bestätigen. In - vivo - Tiermodelle repräsentieren ein weiteres Mittel zur Validierung und wurden vor kurzem verwendet, zum Beispiel die zentrale Rolle von Galectin-3 und Galectin-8 in bestätigenmetastatischen Nische der Lungenkrebs, wie zunächst über Zellmikroarray identifiziert 31, 49. Eine Anzahl von anderen Verfahren verwendet wurden Mikroumgebungs Regulation von Zellfunktionen zu untersuchen, einschließlich einer Vielzahl von zweidimensionalen mikrofabrizierten Systeme 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 und dreidimensionale engineered Biomaterial Systeme 56, 57, 58 , 59, 60, 61. Im Vergleich mit anderen Verfahren, beschrieben die besonderen Vorteile der Zelle Microarray-Plattform hier bestehen aus: (1) einem Durchsatz von bis zuHunderte oder Tausende von unterschiedlichen Kombinationen von Faktoren, so dass Analyse Wechselwirkungen; (2) zugänglich, automatisierte Bildgebung und Analyse; (3) Integration der beiden biochemischen und biophysikalischen Ablesungen mit kontrollierter Darstellung von angeordneten Faktoren; (4) die Fähigkeit Substratmaterialeigenschaften zu variieren; und (5) High-Content-Single-Cell-Analyse von Zellschicksal und Funktion. Zusammenfassend ermöglicht die Kombination von Zell-Mikroarrays mit TFM auf Substraten von abstimmbaren Substrat Steifigkeit gründliche Charakterisierung der beiden biochemischen und biophysikalischen Signale. Wie hier dargestellt, ist diese Plattform generalizable und können leicht an eine Vielzahl von adhärenten Zelltypen und Gewebe Kontexten zu einem verbesserten Verständnis der kombinatorischen Mikroumgebungs Regulation der Zelldifferenzierung und Mechanotransduktion angewendet werden.

Wechselwirkungen zwischen Zellen und der umgebenden Mikroumgebungsfaktoren vermitteln eine Vielzahl von biologischen Prozessen während der Entwicklung, Homöostase und Pathogenese der Erkrankung 1, 2, 3, 4. Diese Mikroumgebungs Wechselwirkungen umfassen die Lieferung von löslichen Faktoren zu Zellen, Zell-Matrix-Bindung, und die Zell-Zell-Wechselwirkungen über Ligand-Rezeptor-Bindung. Zusätzlich zu den oben genannten biochemischen Überlegungen biophysikalischen Parameter, wie Substrat mechanischen Eigenschaften (beispielsweise Elastizitätsmodul, Porosität) und der Zellform und die damit verbundenen nachgeschalteten Mechanotransduktion zunehmend Anerkennung als wichtige Mediatoren der Zelldifferenzierung gewonnen haben , 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt; 10. Die Signale aus diesen Mikroumgebungs Wechselwirkungen dienen als Eingänge für Gen-Netzwerke und Signalwege. Darüber hinaus sind diese Zellen intrinsische Komponenten bieten auch Rückmeldung an die Mikroumgebung über sekretierte Faktoren und Matrix-abbauende Enzyme, eine komplexe co-Regelungsschleife zwischen zell intrinsischen genetischen Programme und zell extrinsische Faktoren Mikroumgebungs 5, 11, 12 vervollständigt. Die Verwendung von technischen Systemen für die kontrollierte Darstellung von Mikroumgebungsfaktoren wurde in einer Reihe verschiedener Kontexte 13, 14, 15 bewährt. Mikrofabrizierte Systeme haben insbesondere präzise räumliche Strukturierung von Proteinen und Zellen erleichtert sowie hoch parallelisierte Analyse über Miniaturisierung 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Zelle Mikroarrays stellen eine solche mikrofabrizierten System , in dem Kombinationen von Biomolekülen sind berührungs gedruckt auf einem elastischen Polyacrylamidhydrogel Substrat 23, 24, 25. Die Einbeziehung von zellKlebstoffKomponenten (nämlich Matrixproteine) ermöglicht anhalt Zelladhäsion und Kultur auf Mikroarrays, die häufig durch nachgeschaltete Analyse mittels Immunzytochemie und fluoreszierende Reporter folgt. Zellmikroarrays wurden zur Verwirklichung eines verbesserten Verständnis von Leberzell - Phänotyp 23, 26, neurale Vorläufer Differenzierung 27, produktiv gerichtet Mammary Vorläufer Entscheidungen Schicksal 28, embryonalen Stammzellen Wartung / Differenzierung 23, 29, 30, Metastasen Lungenkrebs 31 und therapeutische Reaktion bei Melanom 32. Wir haben vor kurzem gezeigt , die Verwendung von Zell - Microarrays zur Bestimmung der Rolle der extrazellulären Matrix (ECM) Proteinzusammensetzung in Endoderm Spezifikation 33, Lebervorläufer Differentiation 34, 35, und die Zelllungentumorarzneimittelantwort 36. In diesen Arbeiten haben wir uns auf die Erweiterung der kombinatorischen Fähigkeiten der Array-Plattform und die Erkundung der Kreuzungen von Zell-Eigen Signalisierung mit extrazellulären Matrixzusammensetzung und Biomechanik konzentriert. Darüber hinaus haben wir biophysikalischen Ablesungen in diesem Array Plattform implementiert quantitativ Eigenschafte, um die Möglichkeit zu bieten,zeichnen die Rolle der Zellkontraktilität in Differenzierungsprozessen 35. Dazu integriert wir Traktionskraftmikroskopie (TFM) mit Zellmicroarrays Hochdurchsatzbewertung von zell erzeugten Traktion zu ermöglichen. TFM ist ein weithin genutzt Verfahren zell erzeugten Zugkräfte zu messen und hat sich mit der Zusammensetzung und der Biomechanik des lokalen Mikro 37, 38, 39, 40 in Bezug auf die Koordinierung der einzelnen Zelle und Gewebe-Ebene Funktion wichtige Erkenntnisse zur Verfügung gestellt. Somit liefert für Meßtaste, physiologisch relevanten biophysikalischen Parameter eines Hochdurchsatzsystem mit Zellmicroarrays TFM kombiniert. Die Zelle Microarray-Plattform hier beschriebene besteht aus vier Abschnitten: Herstellung von Polyacrylamid-Substrate, die Herstellung von Arrays, Zellkultur und Assay Auslesung und Analyse von Daten. SehenFigur 1 eine schematische Zusammenfassung der ersten drei Versuchsabschnitte; siehe Abbildung 2 für eine schematische Zusammenfassung des letzten Abschnitts mit einem Schwerpunkt auf der Analyse von Immundaten. Um die Zelle Microarray - Plattform auf Studien von biomechanischen Zell-Substrat - Wechselwirkungen anzupassen, haben wir Polyacrylamid - Substrate von abstimmbaren Elastizitätsmodul , aber ähnliche Porosität, je Wen et al. 41. TFM Messungen der Kräfte, die durch Zellen, die auf ihrem Substrat ausgeübt zu ermöglichen, haben wir ein Glasboden-Petrischale Format neben dem dicken Glasobjektträgern durch andere Gruppen häufig genutzt. Somit ist diese Zelle Microarray Plattform, die parallel Messungen der Zelldifferenzierung mittels Immunofluoreszenz auf Objektträgern und zell erzeugten Kräfte über TFM auf separaten Glasbodenschalen. Wir haben auch eine Reihe von Verbesserungen an den analytischen Ansatz häufig verwendete mit Zellmikroarrays angewendet. specifically statt parametrischer Z-Scoring der gesamten Insel Intensität messen wir Intensität Einzelzelle und Quantil Normalisierung, um für Nicht-Normalverteilungen und genauer Zellverhalten beschreiben zu berücksichtigen gilt. Wir glauben, dass diese Verbesserungen einen besonderen Nutzen auf Untersuchungen von biologischen Prozessen schaffen, bei dem sowohl biochemische und biophysikalische Signale signifikant, sich schneidende Rollen spielen. Ferner ermöglichen es unseren analytischen Verbesserungen, um die Anwendung von Zellmikroarrays Studien einer Reihe von zellulären Funktionen, für die das Verhalten Einzelzelle und Bevölkerungsebene abweichen.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td></tr><tr><td>100 &amp;times; penicillin&amp;ndash;streptomycin solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 &amp;times; 60 mm coverglasses</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Store under inert gas per manufacturer&#039;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td><td>Cell E&amp;amp;G</td><td>GBD00002-200</td><td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td></tr><tr><td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>6-well polystyrene microplates</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>Collagen III, human</td><td>EMD Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV, human</td><td>EMD Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker, 365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1841</td><td>Used as a marker for array location.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific (HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant JAG1, rat</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin, human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope, inverted</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (&lt;em&gt;i.e&lt;/em&gt;., 37 &amp;deg;C and 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;) is highly advisable for TFM.</td></tr><tr><td>Fluoromount G with DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, mouse</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Microarray scanner</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td></tr><tr><td>Microarrayer</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid Micro</td><td>Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.</td></tr><tr><td>Microscope slides, 25 &amp;times; 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td><td>~0.9 &amp;ndash; 1.1 mm thickness.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT15710</td><td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Protein A/G, recombinant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex drying tray, 2,000&amp;nbsp;mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>Rectangular 4-chambered culture dish</td><td>Fisher Scientific (Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Stealth pin for arraying</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&amp;ndash;450 microns) as suited to your particular application.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

Mikrofabrizierten zelluläre Mikroarrays, welche der kontakt gedruckten Kombinationen von Biomolekülen auf einem elastischen Hydrogel Oberfläche bestehen, bieten eine streng kontrolliert, Hochdurchsatz-engineered System für den Einfluss von angeordneten biochemische Signale auf die Zelldifferenzierung zu messen. Die jüngsten Bemühungen der Zelle unter Verwendung von Microarrays haben ihre Nützlichkeit für kombinatorische Studien nachgewiesen, in denen viele Mikroumgebungsfaktoren sind parallel dargestellt. Allerdings haben diese Bemühungen konzentriert sich hauptsächlich auf die Auswirkungen der biochemischen Signale auf Zell-Reaktionen zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Zelle Microarray-Plattform mit abstimmbaren Materialeigenschaften für die Beurteilung sowohl der Zelldifferenzierung durch Immunofluoreszenz und biomechanische Zell-Substrat-Wechselwirkungen, die durch Traktion Kraftmikroskopie. Dazu haben wir zwei verschiedene Formate unter Verwendung von Polyacrylamid-Hydrogele unterschiedlicher Young-Modul entweder auf Mikroskop-Objektträger oder Glasboden-Petrischalen hergestellt entwickelt. Wir bieten BESt Praktiken und Problemlösungen für die Herstellung von Microarrays auf diesen Hydrogel-Substrate, die nachfolgende Zellkultur auf Mikroarrays, und der Übernahme von Daten. Diese Plattform ist gut geeignet für die Verwendung bei Untersuchungen der biologischen Prozesse , bei denen sowohl biochemische (beispielsweise extrazelluläre Matrixzusammensetzung) und biophysikalischen (beispielsweise Substrat Steifigkeit) cues signifikante spielen können, sich schneidende Rollen.

Mit dieser Plattform haben wir untersucht die Rolle der beiden biochemischen und biophysikalischen Signale in das Schicksal Spezifikation der Leber Vorläufern 34, 35. Protein A / G-konjugierten Notch - Liganden zeigten verbesserte Retention und clustering in dem Polyacrylamid - Hydrogel (3A) und waren weiterhin fähig ist zu einer Gallengang - Zellschicksal Differenzierung der Leber - Vorläufern Antriebs (3B). Verwendung von Einzelzellanalyse quantifiziert wir die Antwort auf die Notch - Liganden für die ECM - Proteine Kollagen I, Kollagen III, Kollagen IV, Fibronectin und Laminin (3C), Feststellung , dass die Antwort von Lebervorläuferzellen an den Liganden auch auf die hängt ECM Kontext. Zuletzt verwendeten wir shRNA Knockdown Leber Vorläufern ohne den Liganden DLL1 und JAG1 zu erzeugen. Die Reaktion auf die aufgereiht Notch-Liganden variiert in Abhängigkeit von der prEsence von beiden Liganden zu bestätigen, dass die Reaktionsfähigkeit der Zell extrinsischen Liganden ist auch eine Funktion des Zell intrinsischen Liganden - Expression (Abbildung 3D). Ferner beobachteten wir eine deutliche Subpopulation von doppelt positiven (ALB + / OPN +) Zellen im DLL1 Knockdown (3D). Zusammen zeigen diese repräsentative Ergebnisse: (1) die kombinatorischen Fähigkeiten des Array-Format, wie es durch die Paarung von mehreren aufgereiht ECM Proteine ​​und Notch-Liganden mit Zuschlags einzelner Liganden veranschaulicht; (2) die Funktionalität nicht nur angeordnet Proteine ​​ECM, sondern auch Zell-Zell-Liganden mittels Protein A / G-vermittelte Konjugation angeordnet sind; und (3) die Umsetzung unserer Single-Cell-Analyse und seine Fähigkeit, einzigartige Subpopulationen zu erkennen. Wir beobachteten auch , dass die Differenzierung der Leber - Vorläufern ist sowohl abhängig von der Substrat Steifigkeit und der ECM - Zusammensetzung (4A </str<html> Ong&gt;), ist , dass Kollagen IV speziell der Suche nach nur der Differenzierung unterstützend auf beiden weichen und steifen Substraten während Fibronektin Differenzierung auf steife Substrate (4B) unterstützt. Repräsentative Wärme Karten von TFM Messungen vorgeschlagen , dass nachhaltige Zugspannung bei niedrigen Substratsteifigkeit auf Kollagen IV Differenzierung in den Gallengang - Zellen (4C) gefördert, die Feststellung bestätigt durch das durchschnittliche Effektivwert-Quadrat - Werte (4D). Zusammen zeigen diese repräsentative Ergebnisse: (1) die erfolgreiche Integration von TFM mit Zellmikroarrays auf Substraten mit einer abstimmbaren Steifigkeit sowohl die Zell-Phänotyp und die Traktion Stress zu bewerten; (2) die Koordination der Lebervorläuferzellschicksal sowohl mit der Matrix-Zusammensetzung und dem Substrat Steifigkeit; und (3) die Umsetzung unserer TFM Analyse und typische Traktionsspannungsprofile in Zellmikroarrays. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Schematische Übersicht der ersten drei Versuchsteilen angezeigt. In Abschnitt 1 werden Glassubstrate gereinigt und silanisiert die Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogele zu erleichtern. In Abschnitt 2 werden die Biomolekül Kombinationen von Interesse in einer Quelle Mikrotiterplatte mit 384 gut vorbereitet. Ein Roboter-Arrayers wird dann mit sauberen Nadeln, die Quelle Mikrotiterplatte und die Polyacrylamid-Hydrogele und initialisiert, Herstellung Arrays auf den Hydrogelen geladen. In Abschnitt 3 werden die Zellen auf die Array-Domänen ausgesät und haften gelassen, wonach das Kulturprotokoll von Interesse durchgeführt wird. Am Endpunkt werden die Zellen entweder für Immunzytochemie / Immunofluoreszenz analysiert feste oder TFM verwenden. Maßstabsbalken sind 75 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> innerhalb-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Abbildung 2: Verarbeitung und Analyse von Immunfluoreszenz - Daten aus Arrays. (A) Fliesen-, Composite - 32-Bit - RGB - Bilder werden zuerst binned und dann aufgeteilt in einzelne 8-Bit - Kanäle. Verwendung einer Kombination von angeordneten fluoreszierenden Marker und Zellinseln, drei Ecken des Arrays identifiziert für die automatische Ausrichtung und Rasterung der Arrays zu ermöglichen. (B) Einzelzellendaten für jeden Kanal der eingegebenen Arrays erzeugt. Um für experimentelle Drift zu berücksichtigen, wird Quantils Normalisierung durch biologische Replikation angewendet, um eine Shared Verteilung über alle Replikate zu erzeugen. Quantile normalisierten Daten werden anschließend über die Berechnung der Ensemblemessungen (zB Zellen / Insel, mittlere Intensität, Prozent Zellen positiv für ein Label) oder direkte Analyse von Einzelzellverteilungen aufgetragen und interpretiert.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Abbildung 3: Notch - Liganden Präsentation Vermittelt Leber Progenitor Differenzierung. (A) Fc-rekombinante Notch - Liganden Jagged-1 (JAG1) und Delta-like 1 (DLL1) zeigten verbesserte Retention und Clustering , wenn sie mit Protein A / G angeordnet. Maßstabsbalken ist 50 &amp; mgr; m. (B) Leber Vorläufern differenziert in den Gallengang - Zellen bei Vorlage mit Notch - Liganden. 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) ist ein Kern Etikett, Albumin (ALB) ein Leberzellmarker ist, und Osteopontin (OPN) ist eine Gallengang-Zellmarker. Maßstabsbalken ist 150 &amp; mgr; m. (C) Quantifizierung der Prozentsatz der Zellen , die positiv für OPN für den Notch - Liganden JAG1, DLL1 und Delta-like 4 (DLL4) auf die ECM - Proteine Kollagen I, collagen III, Kollagen IV, Fibronectin und Laminin. Student-t -Tests wurden für jede aufgereiht Notch - Liganden gegen Kontroll - IgG durchgeführt innerhalb jedes ECM - Proteins mit P-Werte angegeben für P &lt;0,05 (*). (D) Imaging - Zytometrie von ALB und OPN für Zellen auf Kollagen III mit den Notch - Liganden präsentiert JAG1, DLL1 und DLL4. Leber - Vorläufern ohne die Notch - Liganden DLL1 und JAG1 (dh shDll1 und shJag1) wurden shRNA Knockdown generiert. Daten in (C) dargestellt als Mittelwert ± SEM Diese Zahl wurde von Kaylan et al modifiziert. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Abbildung 4: Matrixzusammensetzung und Substrat Stiffness Coordinate Leber Progenitor Differenzierung. (A) Differenzierung Liver Vorläuferzellen zu Gallenkanal ist abhängig von sowohl ECM - Zusammensetzung und dem Substrat Steifigkeit. DAPI ist ein Kern Etikett ist ALB eine Leberzellmarker und OPN ist ein Kanalzellmarker Galle. (B) Quantifizierung der Prozentsatz der Zellen positiv für OPN auf Substraten des Elastizitätsmoduls 30 kPa, 13 kPa, und 4 kPa für Kollagen I (C1), Kollagen IV (C4), Fibronectin (FN), und alle Zwei-Wege - Kombinationen diese ECM-Proteine. (C) Zell Zug beansprucht wird sowohl Substrat Steifigkeit und ECM - Zusammensetzung abhängig. (D) Die Quantifizierung der root-mean-square Werte der Zugspannung auf Substraten des Elastizitätsmoduls 30 kPa und 4 kPa für Kollagen I (C1), Kollagen IV (C4), Fibronektin (FN) und alle Zwei-Wege - Kombinationen derjenigen ECM-Proteine. In (B) und (D) wurden die Daten als Mittelwert ± SEM und Student t -Tests präsentiertfür jede ECM Kombination mit P-Werten gegenüber 30 kPa wurden für P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**) und P &lt;0,001 (***) angegeben durchgeführt. Maßstabsbalken sind 50 &amp; mgr; m. Diese Zahl wurde von Kourouklis et al modifiziert. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Abschnitt </td><td fo:width="1.5in"> Problem </td><td fo:width="1.5in"> Mögliche Ursachen </td><td> Lösung </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Herstellung von Polyacrylamid-Substrat. </td><td> Abdeckglas nicht aus Hydrogel entfernt werden. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Reduzieren Polymerisationszeit auf &lt;10 Minuten (4 W / m 2). Überprüfen Sie, dass UV-crosslinker Ausgang ist im erwarteten Bereich. </td></tr><tr><td> Schlechte Polyacrylamid-Hydrogel-Polymerisation. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Erhöhen Polymerisationszeit auf&gt; 10 Minuten (4 W / m 2). Überprüfen Sie, dass UV-Vernetzer Ausgang innerhalb des erwarteten Bereichs liegt. </td></tr><tr><td> Polyacrylamide Hydrogele werden nach Entfernung der beschädigten Abdeckglas. </td><td> Soft-Polyacrylamid-Hydrogele sind leicht zu beschädigen. </td><td> Wir beobachten Abnahme Hydrogel Fertigungsausbeute (~ 50%) für den weichsten (dh 4 kPa) Hydrogele im Besonderen. Griff Hydrogele sanft und Startnummern erhöhen, um die gewünschte Ausbeute zu erreichen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Herstellung von Arrays. </td><td rowspan="2"> Schlechte oder inkonsistent Stelle Morphologie. </td><td> Uneinheitliche Luftbefeuchter Funktion. </td><td> Überprüfen Sie, dass Luftbefeuchter und Rheometer eine funktionelle während jeder Auflage und 65% relativer Feuchtigkeit halten. </td></tr><tr><td> Pins stecken in Druckkopf oder Clogged. </td><td> Reinigen Sie den Druckkopf kostenlos Stift Bewegung zu ermöglichen. Saubere Stifte gründlich vor oder nach jedem Drucklauf Aggregate von Stiftkanälen zu entfernen. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Zellkultur und Execution-Assay. </td><td rowspan="2"> Zellablösung oder Tod auf Arrays nach der ersten Anlage. </td><td> Nachsaat und übermäßige Vermehrung. </td><td> Reduzieren anfängliche Aussaatdichte und Zeit. Verwenden Sie &quot;Wartung&quot; oder &quot;Differenzierung&quot; Medien während Array Kultur Zellproliferation zu reduzieren. </td></tr><tr><td> Freisetzung toxischer Acrylamidmonomer aus Hydrogel. </td><td> Einweichen Hydrogele in dH 2 O für mindestens 3 d für die Diffusion / Freisetzung von Acrylamidmonomer zu ermöglichen und Zelltoxizität reduzieren. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Die Zellen nicht legen zu Arrays. </td><td> Underseeding. </td><td> Erhöhen anfängliche Aussaatdichte und Zeit. Verwenden Sie eine stärker adhärenten Zelltyp. </td></tr><tr><td> Schlechte Ablagerung vonMatrix oder Biomolekül Zustand. </td><td> Saubere Stifte und Aggregate, Druckparameter bestätigen und zu bewerten Spotten von Fluoreszenzmarkern, zB Rhodamin-konjugierten Dextran. </td></tr><tr><td> Spezifität der Zell-Matrix-Wechselwirkungen. </td><td> Verschiedene Zelltypen haften spezifisch an einige, aber nicht andere ECM-Proteine. Testen Sie mehrere verschiedene ECM-Proteine ​​mit Ihren Zellen. </td></tr><tr><td> Suboptimale Array Lagerung nach der Herstellung. </td><td> Wir empfehlen über Nacht bei 65% relativer Luftfeuchtigkeit und Raumtemperatur hergestellten Arrays speichern, teilweise Phasenänderungen zu vermeiden, während des Einfrierens. Zelladhäsion ist empfindlich gegenüber sowohl Feuchtigkeit, Temperatur und Lagerzeit; sicherstellen, dass diese Parameter für Ihre Experimente konsistent / optimiert sind. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Detachment von Hydrogel aus Glassubstrat während der Zellkultur. </td><td> Schlechte Rutsche Reinigung und Silanisierung. </td><td> Ersetzen Arbeitslösungen für Dia-Reinigung undSilanisierung. </td></tr><tr><td> Overdehydrated Hydrogel. </td><td> Lassen Sie keine Hydrogele auf einer heißen Platte länger als 15-30 Minuten auszutrocknen. </td></tr><tr><td> 4. Analyse der Daten. </td><td> Hohe Variabilität zwischen Replikat Flecken und Dias. </td><td> Variability in der Arrayherstellung. </td><td> Überprüfen Sie, ob Stifte und Druckkopf sauber sind. Bestätigen Luftbefeuchter Funktion. Visualisieren und zu quantifizieren Stelle und Array Qualität unter Verwendung von fluoreszierenden Markern. Shop-Arrays, wie oben empfohlen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Fehlerbehebung.

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A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Die Zelldifferenzierung wird durch eine Vielzahl von Mikroumgebungsfaktoren reguliert, einschließlich der beiden Matrixzusammensetzung und Substratmaterialeigenschaften. Wir beschreiben hier eine Technik unter Verwendung von Zellmicroarrays in Verbindung mit Traktionskraftmikroskopie sowohl Zelldifferenzierung und biomechanischen Zell-Substrat-Wechselwirkungen als Funktion der Mikroumgebungskontext zu bewerten.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

a-high-throughput-cell-microarray-platform-for-correlative-analysis

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JoVE Journal

Bioengineering

9.6K Aufrufe.  University of Illinois at Urbana–Champaign.  Die Zelldifferenzierung wird durch eine Vielzahl von Mikroumgebungsfaktoren reguliert, einschließlich der beiden Matrixzusammensetzung und Substratmaterialeigenschaften. Wir beschreiben hier eine Technik unter Verwendung von Zellmicroarrays in Verbindung mit Traktionskraftmikroskopie sowohl Zelldifferenzierung und biomechanischen Zell-Substrat-Wechselwirkungen als Funktion der Mikroumgebungskontext zu bewerten. 

Serie: A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Einfache und genaue Mechanotherapie Profilierung Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Medizin

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

Hochdurchsatz-Traktionskraftmikroskopie mit PDMS zeigt dosisabhängige Effekte transformierender Wachstumsfaktoren auf den epitheliaal-mesenchymalen Übergang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Herstellung und Implementierung einer referenzfreien Traktionskraftmikroskopie-Plattform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, function at both the cellular and tissue levels,and regulate the mechanical systems in the body. Numerous biological processes are force-dependent, including motility, adhesion, and division of single-cells, as well as contraction and relaxation of organs such as the heart, bladder, lungs, intestines, and uterus. Given its importance in maintaining proper physiological function, cellular contractility can also drive disease processes when exaggerated or disrupted. Asthma, hypertension, preterm labor, fibrotic scarring, and underactive bladder are all examples of mechanically driven disease processes that could potentially be alleviated with proper control of cellular contractile force. Here, we present a comprehensive protocol for utilizing a novel microplate-based contractility assay technology known as fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS), that provides simplified and intuitive analysis of single-cell contractility in a massively scaled manner. Herein, we provide a step-wise protocol for obtaining two six-point dose-response curves describing the effects of two contractile inhibitors on the contraction of primary human bladder smooth muscle cells in a simple procedure utilizing just a single FLECS assay microplate, to demonstrate proper technique to users of the method. Using FLECS Technology, all researchers with basic biological laboratories and fluorescent microscopy systems gain access to studying this fundamental but difficult-to-quantify functional cell phenotype, effectively lowering the entry barrier into the field of force biology and phenotypic screening of contractile cell force.

This work presents a flexible protocol for utilizing fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS) Technology in microwell format for simplified, hands-off quantification of single-cell contractile forces based on visualized displacements of fluorescent protein micropatterns.

Vereinfachte Hochdurchsatzanalyse der Einzelzellkontraktilität mit mikrostrukturierten Elastomeren

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...