Biz kabul Austin Cyphersmith ve Mayandi Sivaguru (Genomik Biyoloji Carl R. Woese Enstitüsü, University of Illinois at Urbana Champaign) mikroskobu ile yardım için ve cömertçe mikroskopi özünde ekran ve video çekimi barındırmak için.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Deneylerde, biz en yaygın hataları uydurma dizilerin kalitesi ile ilgili ve kötü ilgi biyolojik sistem yanıtı karakterize bulduk. Biz cep mikroarray deneylerde yaygın arıza modları ve ilişkili sorun giderme adımları için Tablo 1&#39;de okuyucu bakın. Özellikle dizilerin kalitesiyle ilgili, biz aşağıdaki öneriyoruz. Böyle rodamin-konjuge dekstran gibi floresan etiketli molekülleri kullanarak programları parametreler ve tamponlar arraying teknik kalite ve sağlamlığı onaylayın. önce ya da daha fazla görsel üreticinin talimatlarına göre arraying ve sonra ya tamamen temiz pimleri pim kanalları ışık mikroskobu kullanılarak enkaz açık olup olmadığını kontrol edin. genel protein lekeleri veya immün kullanarak dizilmiş biyomolekül tutma onaylayın. 70 kDa altında bir moleküler ağırlığa sahip biyomoleküller sık hidrojel 23 korunmaz unutmayın </<html> sup&gt; 31. Birden fazla hücre tiplerini kullanarak dizilmiş biyomolekül hücre işlevselliğini doğrulamak. Sadece yapışık hücreler diziler ile uyumlu olduğunu unutmayın; Buna ek olarak, diziler kaynaşmasının hücreye özel özellikleri (örneğin, integrin ifade profili) ve seçilen ECM proteinleri bağlıdır. Sınırlı yer nedeniyle, burada dizi tasarım, düzen ve imalat geniş bir tedavi verilmez ve daha önceki 23 çalışır için, 25 okuyucu bakın. Biz genel olarak 10-20 benzersiz biyomolekül koşulları (yani, 5-10 noktalar / durumu) oluşan 100 nokta Altdizilim (150 mikron nokta çapı 450 mikron merkez-merkez mesafesi) kullanın. bir dizide altdizilimlerden sayısı rahatça biri 25 × 75 mm mikroskop lamı üzerine 1,280 kadar ölçeklendirilebilir ilgi biyomolekül koşulları sayısına bağlı olarak değişir (~ 64 altdizilimlerden içinde 6.400 noktalar)xref &quot;&gt; 25, 31 parametre üzerinde daha fazla ilgi desen boyutuna bağlı olarak değişir;. 75 desen üretme kapasitesine sahip pimleri - 450 mikron kolayca kullanılabilir. Dizi deneyler en iyi diğer kültür biçimlerini kullanarak yüksek faiz-puanlama dizilmiş koşulları, tahlil okumalara ve biyolojik model sistemleri doğrulama ile tamamlanmaktadır. Spesifik olarak, daha ayrıntılı bir şekilde, standart moleküler biyoloji teknikleri (örneğin, QRT-PCR, immün) veya standart TFM ile bağlantılı dökme kültürleri kullanılarak seçme dizilmiş koşullarının kanıtlayan önerilir. Genetik manipülasyon Ayrıca diziler gözlenen etkileri onaylamak için hizmet, uygun bir biyolojik model sisteminde ilgi faktörünün (örneğin, demonte veya aşırı ifadesi). In vivo hayvan modelleri doğrulama başka bir yöntem temsil en son galektin-3 ve galektin-8 merkezi rolü teyit etmek için, örneğin, kullanılanAkciğer kanseri metastatik niş, başlangıçta hücre mikroarray 31 49 aracılığıyla belirledi. Diğer bir dizi yöntem, iki boyutlu bir mikrofabrike sistemleri 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 ve üç boyutlu tasarlanmış biyomalzeme sistemleri 56, çeşitli 57, 58 dahil olmak üzere, hücresel fonksiyonları microenvironmental düzenleme, problamak için kullanılmıştır , 59, 60, 61. diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada tarif edilen hücre mikrodizi platformun özel avantajlar oluşur: (1) ila yukarı çıktıyüzlerce veya etkileşim etkilerinin analizi sağlayan faktörlerin farklı kombinasyonları, binlerce; (2) erişilebilir, otomatik görüntüleme ve analizi; (3) dizilmiş faktörlerin kontrollü sunumu ile hem biyokimyasal ve biyofiziksel okumalarla entegrasyonu; (4) alt-tabaka malzemesi özellikleri değiştirme yeteneğini de; hücre kaderinin ve fonksiyonu ve (5) yüksek içeriği tek hücre analizi. Özetle, ayarlanabilir alt tabaka sertliği yüzeylerde TFM hücre microarrays kombinasyonu hem biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının kapsamlı karakterizasyonu sağlar. Burada görüldüğü gibi, bu platform genellenebilir ve hali hazırda hücre farklılaşması ve mechanotransduction kombinatoryal mikro-çevresel bir düzenleme daha iyi anlaşılması doğru yapışık hücre tipleri ve doku çeşitli bağlamlarda da uygulanabilir.

Hücre ve çevresindeki mikro-çevresel faktörler arasındaki etkileşimler geliştirme, homeostaz ve hastalığın patojenezi, 1, 2, 3, 4 boyunca biyolojik süreçlerin büyük bir çeşitlilik aracılık eder. Bu mikro-çevresel etkileşimler ligand-reseptörü aracılığıyla hücrelere çözünür faktörlerin teslim bağlayıcı hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri bulunmaktadır. Yukarıda biyokimyasal açıdan ek olarak, bu tür alt-tabaka mekanik özellikleri biofiziksel parametreleri (örneğin, Young modülü, gözeneklilik) ve hücre şekli ve ilişkili alt mechanotransduction artan hücre farklılaşması 5, 6, 7, 8, anahtar aracılar olarak tanındı adres 9 <sup&gt; 10. Bu microenvironmental etkileşimler kaynaklanan sinyaller gen ağları ve sinyal yolları girdi olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, bu hücre iç bileşenler aynı zamanda hücre hakiki genetik programlar ve hücre dış mikro-çevresel faktörlerin 5, 11, 12 arasındaki karmaşık eş düzenleyici döngü tamamlayan salgılanan faktörler ve matris-parçalayıcı enzimler yoluyla mikro geri bildirimde bulunur. Mikro-çevresel faktörler tarafından kontrol edilen sunum için tasarlanmış sistemlerinin kullanımı farklı bağlamlarda 13, 14, 15, bir dizi yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle mikrofabrike sistemleri, minyatürleştirme 13 ile protein ve hücreleri hem de yüksek paralelleştirilmiş analiz hassas mekansal model oluşturmanın kolaylaştırmıştır <supSınıf = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Hücre mikrodizileri biyomoleküllerin kombinasyonları iletişim baskılı bir esnek poliakrilamid hidrojel alt-tabaka 23, 24, 25 üzerine olan bu tür bir mikrofabrike sistemi temsil eder. Hücre-yapışkan bileşenlerin (yani matriks proteinleri) dahil sık sık immünsitokimya ve floresan gazetecilere yoluyla aşağı analizi ile takip edilmektedir mikrodizinlerinde sürekli hücre yapışması ve kültürünü mümkün kılar. Hücre mikroarray&#39;ler verimli karaciğer hücre fenotip 23, 26, nöral prekürsör farklılaşma 27 mammar geliştirilmiş bir anlayış elde yönelik edilmiştiry progenitör kader kararları 28, embriyonik kök hücre bakım / farklılaşma 23, 29, 30, akciğer kanseri metastazı 31 ve melanom 32 tedavi yanıtı. Son zamanlarda endoderm tarifnamede 33, karaciğer progenitör farklılaşma 34, 35, ve akciğer tümör hücre tedaviye yanıt 36 hücre dışı matris (ECM) protein bileşiminin rolünü tanımlamak için hücre mikrodizileri kullanımını göstermiştir. Bu çalışmalarda, biz dizi platformunun kombinasyon yeteneklerinin artırılması ve hücre dışı matriks kompozisyonu ve biyomekanik ile hücre içsel sinyalizasyon kavşakları keşfetmeye odaklanmıştır. Ayrıca, yetenek kantitatif şekilde karakterize sağlamak için bu dizi platformda biyofizik readouts hayata geçirdikfarklılaşma hücre kontraktilite terize rolü 35 işler. Bunu yapmak için, biz hücre tarafından üretilen çekiş yüksek verimlilik değerlendirilmesini sağlamak için hücre mikroarray&#39;ler ile çekme kuvvet mikroskobu (TFM) entegre edilmiştir. TFM hücresi tarafından oluşturulan çekme kuvvetlerinin ölçülmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olup, bileşim ve yerel mikro-37, 38, 39, 40 biyomekanik tek-hücre ve doku düzeyinde işlev koordinasyonu ile ilgili önemli bilgiler sağlamıştır. Bu nedenle, hücre mikrodizileri ile TFM birleştiren temel fizyolojik olarak uygun biofiziksel parametreleri ölçmek için yüksek verimli bir sistem sağlar. Burada anlatılan hücre mikroarray platformu dört bölümden oluşmaktadır: poliakrilamid yüzeylerde, diziler, hücre kültürü ve tahlil okuma üretiminde ve verilerin analizi imalatı. Görmekİlk üç deney bölümleri şematik özeti Şekil 1 &#39;dir; immünofloresan verilerin analizi odaklanarak son bölümde bir şematik özeti için bakınız Şekil 2. Biyomekanik hücre alt-tabaka etkileşim çalışmalar hücre mikrodizi platformu adapte amacıyla, Wen et al başına ayarlanabilir Young modülü ama benzer gözenekli poliakrilamid substratlar kullanılır. 41. onların alt tabaka üzerinde hücreler tarafından uygulanan kuvvetlerin TFM ölçümleri etkinleştirmek için, biz sık sık diğer gruplar tarafından kullanılan slaytlar kalın cam mikroskop ek olarak cam alt Petri kabı biçimi uyguladı. Bu nedenle, bu hücre mikrodizi platformu ayrı cam alt yemekler TFM ile mikroskop lamı ve hücre tarafından üretilen kuvvetlerin immünofloresan ile hücre farklılaşmasının paralel ölçümler yeteneğine sahiptir. Biz de yaygın hücre mikroarray&#39;ler ile kullanılan analitik yaklaşıma çeşitli iyileştirmeler uyguladık. Özelly, yerine genel ada yoğunluğu parametrik Z-puanlama, biz tek hücreli yoğunluğunu ölçmek ve normal olmayan dağılımlar için hesap ve daha doğru hücresel davranışını tanımlamak için kantil normalleşme uygulayın. Biz bu gelişmeler biyokimyasal ve biyofiziksel hem ipuçları önemli, kesişen rol oynadığı biyolojik süreçlerin araştırılması yönünde özellikle yarar sağladığına inanıyoruz. Ayrıca, bizim analitik gelişmeler tek hücreli ve nüfus seviyesi davranışı sapmak hangi hücresel fonksiyonları bir dizi çalışmalara hücre mikroarray&#39;ler uygulanmasını sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

elastik hidrojel yüzeyinde biyomoleküllerin temas baskılı kombinasyonları oluşur microfabricated hücresel mikroarray&#39;ler, hücre farklılaşması üzerine dizilmiş biyokimyasal sinyallerin etkisini ölçmek için bir sıkı kontrol, yüksek verimli mühendislik sistem sağlamak. Hücre mikrodiziler kullanarak Son çalışmalar, birçok microenvironmental faktör paralel olarak sunulduğu kombinasyon çalışmaları için kendi programını ortaya koymuştur. Ancak bu çabalar hücre yanıtları biyokimyasal ipuçlarının etkilerini araştıran öncelikle odaklanmıştır. Burada, çekiş kuvveti mikroskobu ile immünofloresan ve biyomekanik hücre-substrat etkileşimleri hem hücre farklılaşması değerlendirmek için ayarlanabilir malzeme özelliklerine sahip bir cep mikroarray platformu sunuyoruz. Bunu yapmak için, biz ya mikroskop lamı veya cam alt Petri kapları üzerinde fabrikasyon Young modülü değişen poliakrilamid hidrojeller kullanan iki farklı biçimleri geliştirmişlerdir. Biz bes sağlamakBu hidrojel yüzeylerde microarrays imalat, mikrodizinlerinde sonraki hücre kültürü ve veri edinimi için t uygulamaları ve sorun giderme. Bu platform da biyokimyasal (örneğin, hücre dışı matris bileşimi) hem ve biyofiziksel (örneğin, alt-tabaka sertliği) işaretler rolleri kesişen önemli oynayabilir biyolojik proseslerin incelenmesi kullanılmak için çok uygundur.

Bu platformu kullanarak, karaciğer atalarıdır 34, 35 kaderi şartnamede hem biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının rolünü araştırdık. Protein A / G-konjuge Çentik ligandlan poliakrilamid hidrojel (Şekil 3A), geliştirilmiş saklama ve kümelenme gösterdi ve safra kanalı, hücre kaderine (Şekil 3B) doğru karaciğer progenitörlerin farklılaşmasını sürüş Ayrıca sahip idi. Tek hücreli bir analiz kullanarak, liganda karaciğer progenitörlerinin tepkisi de bağlıdır bulgu, ECM proteinleri kolajen I, kolajen III, kolajen IV, fibronektin ve laminin (Şekil 3C) çentik ligandlarına yanıt sayısal ECM bağlam. Son olarak, ligandlar DLL1 ve Jag1 olmadan karaciğer atalarıdır oluşturmak için ShRNA demonte kullanılmaktadır. dizilmiş Notch bağına yanıt pr bağlı olarak değişiklikHer iki ligandın özünü, hücre dışsal liganda yanıt hücre iç ligand ifade (Şekil 3D) bir fonksiyonu da doğrular. Dahası, çift pozitif bir tat alt popülasyonunu gözlenmiştir (ALB + / OPN +) DLL1 demonte (Şekil 3D) hücreler. Birlikte, bu temsili sonuçlar göstermektedir: (1) tek tek ligandların devirme ile birden dizilmiş ECM proteinleri ve Çentik ligand eşleştirme ile gösterildiği üzere bir dizi formatı kombinasyon yetenekleri; (2) sadece bir işlevi ECM proteinlerini dizilmiş değil, aynı zamanda protein A / G-aracılı birleştirme aracılığı ile hücre-hücre ligand dizilmiş; ve (3) bizim tek hücreli analizi ve benzersiz alt popülasyonlar ayırt etme yeteneği uygulanması. Ayrıca karaciğer progenitörlerinin farklılaşma alt-tabaka sertliği ve ECM bileşimi (Şekil 4a, her iki bağımlı olduğu görülmektedir </str<html> fibronektin sadece sert yüzeylerde (Şekil 4B) üzerinde farklılaşma desteklerken ong&gt;), özellikle kolajen IV bulma hem yumuşak ve sert yüzeylerde farklılaşma destekleyicidir. TFM ölçümlerinin Temsilcisi ısı haritaları kollajen IV düşük substrat sertliği de sürekli çekiş stres safra yolu hücreleri (Şekil 4C), ortalama kök ortalama kare değerleri (Şekil 4D) tarafından teyit bir bulgu haline farklılaşmayı teşvik önerdi. Birlikte, bu temsili sonuçlar göstermektedir: (1) bir ayarlanabilir sertlik yüzeylerde hücre mikroarreyleri ile TFM başarılı entegrasyon hücre fenotipi ve çekiş stres hem değerlendirmek için; (2) matris bileşimi ve alt tabaka sertlik hem karaciğer progenitör hücre kaderinin koordinasyonu; ve (3) hücre mikrodizilerinde bizim TFM analizi ve tipik bir gerilim profillerini uygulanması. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: İlk Üç Deneysel Bölümler gösteriliyor Özet şematik. Bölüm 1, cam yüzeylerde temizlenmeli ve poliakrilamid hidrojeller fabrikasyon kolaylaştırmak için Silanlanmış edilir. Bölüm 2&#39;de, ilgi konusu biyomolekülün kombinasyonları 384 kaynağı mikro-hazırlanır. Bir robot arrayer sonra hidrojeller üzerinde diziler imalatı, temiz pimleri, kaynak mikroplaka ve poliakrilamid hidrojeller ile yüklenir ve başlatılır. Bölüm 3, hücreler dizilmiş alan üzerine ekilip ilgi kültür protokolü uygulandı, bundan sonra, uygun izin verilir. uç noktada, hücreler ya TFM kullanarak immünsitokimya / Immünofloresan için sabit veya analiz edilir. Ölçek çubukları 75 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> = &quot;1&quot;&gt; sayfa içinde <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Şekil 2: İşleme ve Diziler gelen İmmünofloresan Verilerin Analizi. (A) Karo, kompozit 32 bit RGB görüntüleri ilk binned ve daha sonra tek tek 8-bitlik kanallara ayrılır. dizilmiş floresan belirteçler ve hücre adaların bir arada kullanarak, dizinin üç köşesi otomatik yönlendirme ve dizilerin gridding sağlamak için belirlenmiştir. (B) tek-hücreli veri giriş dizilerinin her kanal için oluşturulur. Deneysel sürüklenme hesaba amacıyla, kantil normalleştirme tüm çoğaltır genelinde tek bir paylaşılan dağıtım üreten, biyolojik tekrarında uygulanır. Quantile normalize veri sonradan ya da tek hücreli dağılımlarının doğrudan analizi (bir etiket için pozitif yüzde hücre yoğunluğu ortalama örneğin, hücre / ada) çizilen ve topluluk ölçümlerinin hesaplanması yoluyla yorumlanır.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Şekil 3: Notch Ligand Sunum Aracılık Karaciğer Progenitör Farklılaşma. (A) Fc-rekombinant Çentik ligandları Jagged-1 (JAG1) ve Delta gibi 1 (DLL1) Protein A / G ile dizilmiş gelişmiş tutma ve kümelenme sergiledi. Ölçek çubuğu 50 mm. (B) Karaciğer ataları Notch ligand ile ibrazı üzerine safra yolu hücrelerine diferansiye. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nükleer bir etiket, albümin (ALB) bir karaciğer hücre belirteci olduğu ve osteopontin (APN) olan bir safra kanalı, hücre belirtecidir. Ölçek çubuğu 150 mm. (C) ECM proteinleri üzerinde çentik ligandlar JAG1, DLL1 ve Delta gibi 4 (DLL4) için APN için pozitif hücrelerin yüzdesi miktarının belirlenmesi I kollajenin, collagen III, kolajen IV, fibronektin ve laminin. Student t-test P &lt;0.05 (*) için belirtilen P-değerleri, her ECM proteininde içinde her dizilmiş Çentik ligand için kontrol IgG karşı yapıldı. Notch ligandları JAG1, DLL1 ve DLL4 mevcuttur kollajen III hücreler için ALB ve APN (D) Görüntüleme sitometri. Çentiksiz karaciğer progenitörler DLL1 ve Jag1 (yani, shDll1 ve shJag1) shRNA demonte kullanılarak elde edilmiştir ligandları. Ortalama ± sem Bu rakam Kaylan&#39;ın ark tadil edilmiş olduğu (C) &#39;de veriler sunmuşlardır. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Şekil 4: The Matrix Kompozisyon ve Yüzey Sertlik CooKaraciğer Progenitör Farklılaşma rdinate. Kanal hücreleri safra (A) Karaciğer progenitör farklılaşma ECM kompozisyon ve alt tabaka sertlik hem bağlıdır. DAPI ALB bir karaciğer hücre işaretleyici ve APN bir safra kanalı, hücre işaretleyici, nükleer bir etikettir. (B) Young modülü alt tabakalar 30 kPa, 13 kPa, kollajen 4 kPa I (C1), kolajen IV (C4), fibronektin (FN), ve iki yönlü kombinasyonları ile ilgili APN için pozitif hücrelerin yüzdesi kantifikasyonu bu ECM proteinleri. (C) Celi bir gerilim alt-tabaka sertliği ve ECM bileşimin hem bağlıdır. (D) Young modülü alt tabakalar 30 kPa ve kollajen 4 kPa I (C1), kolajen IV (C4), fibronektin (FN), ve bu her iki yollu kombinasyonları, çekiş stres kök-ortalama-kare değerlerinin miktarının belirlenmesi ECM proteinleri. (B) ve (D) &#39;de, veriler SEM ve Student t-test, ortalama ± olarak sunulduP &lt;0.05 (*) p &lt;0.01 (**) için belirtilen P-değerleri, her ECM kombinasyonu için 30 kPa karşı gerçekleştirilen edildi ve p &lt;0.001 (***). Ölçek çubukları 50 mikron. Bu rakam Kourouklis ark modifiye edilmiştir. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Bölüm </td><td fo:width="1.5in"> Sorun </td><td fo:width="1.5in"> potansiyel Nedenler </td><td> Çözüm </td></tr><tr><td rowspan="3"> Poliakrilamid Yüzey 1. Fabrikasyon. </td><td> Coverglass hidrojelden kaldırılamaz. </td><td> Overpolymerization. </td><td> &lt;10 dakika (4 W / m 2) polimerizasyon süresini azaltın. UV crossli kontrolnker çıkış beklenen aralığı içindedir. </td></tr><tr><td> Kötü poliakrilamid hidrojel polimerizasyon. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Polimerizasyon süresi&gt; 10 dakika (4 W / m 2) artırmak. UV çapraz bağlayıcı çıkışı beklenen aralıkta olup olmadığını kontrol edin. </td></tr><tr><td> Poliakrilamid hidrojellerin coverglass çıkarıldıktan sonra zarar görmektedir. </td><td> Yumuşak poliakrilamid hidrojeller zarar kolaydır. </td><td> Biz özellikle (yani, 4 kPa) hidrojeller yumuşak hidrojel üretim verimi (~% 50) azalan gözlemlemek. nazikçe hidrojeller Kulp ve istenilen verimi elde etmek için başlangıç ​​sayısını artırmak. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Diziler 2. Fabrikasyon. </td><td rowspan="2"> Kötü veya tutarsız nokta morfolojisi. </td><td> Tutarsız nemlendirici fonksiyonu. </td><td> Bu nemlendirici kontrol edin ve her yazdırma çalışması boyunca işlevsel reometre ve% 65 RH korumak. </td></tr><tr><td> baskı kafası veya takunya sıkışmış pimleriged. </td><td> ücretsiz pim hareketine izin vermek için yazıcı kafasını temizleyin. iyice önce veya her baskı çalışmasından sonra temiz iğneler pim kanallarından agrega kaldırmak için. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Hücre Kültürü ve Tahlili Yürütme. </td><td rowspan="2"> İlk eki sonra diziler Hücre dekolmanı ya da ölüm. </td><td> Overseeding ve aşırı çoğalması. </td><td> İlk tohumlama yoğunluğu ve süresini azaltın. hücre çoğalmasını azaltmak için dizi kültürü sırasında &quot;bakım&quot; veya &quot;farklılaşma&quot; ortamını kullanın. </td></tr><tr><td> hidrojel toksik akrilamid Yayın. </td><td> Akrilamid difüzyon / tahliyesine imkan vermek ve hücre toksisitesini azaltmak için en az 3 gün boyunca dH 2 O hidrojeller bekletin. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Hücreler diziler eklemek gerekmez. </td><td> Underseeding. </td><td> İlk tohumlama yoğunluğu ve süresini artırın. Bir daha güçlü yapışık hücre türünü kullanın. </td></tr><tr><td> Zayıf birikimimatris veya Biyomoleküllerin durum. </td><td> Parçacıkların ve agrega temiz iğne, baskı parametrelerini onaylamak ve floresan belirteçler, örneğin, rodamin-konjuge dekstran lekelenme değerlendirir. </td></tr><tr><td> hücre-matris etkileşimlerinin spesifikliği. </td><td> Farklı hücre tipleri, bazı ancak diğer ECM proteinleri spesifik olarak yapışır. senin hücreleri ile birden fazla farklı ECM proteinleri test edin. </td></tr><tr><td> imalattan sonra suboptimal dizi depolama. </td><td> Biz dondurma sırasında faz değişiklikleri önlemek için kısmen,% 65 RH ve oda sıcaklığında gece boyunca fabrikasyon dizileri saklamak öneririz. Hücre yapışması, her iki nem, sıcaklık ve depolama süresi karşı duyarlıdır; Bu parametreler deneyler için optimize / tutarlı olduğundan emin olun. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Hücre kültürü sırasında cam alt tabakadan hidrojel dekolmanı. </td><td> Kötü slayt temizleme ve silanizasyon. </td><td> slayt temizliği için çalışan çözümler değiştirin vesilanizasyon. </td></tr><tr><td> Overdehydrated hidrojel. </td><td> daha uzun 15-30 dakika süreyle sıcak bir plaka üzerinde kurutucu hidrojeller bırakmayın. </td></tr><tr><td> Verilerin 4. analizi. </td><td> tekrarlanan noktalar ve slaytlar arasında yüksek değişkenlik. </td><td> Dizi üretiminde değişkenliği. </td><td> pim ve yazıcı kafası temiz olup olmadığını kontrol edin. nemlendirici işlevi onaylayın. Görselleştirmek ve floresan işaretlerini kullanarak spot ve dizi kalitesini ölçmek. olarak saklayın dizileri yukarıda önerilir. </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Sorun Giderme.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

a-high-throughput-cell-microarray-platform-for-correlative-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Görüntüleme.  University of Illinois at Urbana–Champaign.  Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar. 

Video: A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Biyomühendislik

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...