Diese Arbeit wurde unterstützt von Ministerio de Economìa y Competitividad / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 und PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 ) Und Agentschap voor Innovatie Tür Wetenschap en Technologie (SBO-140028) an FC Auch X. M, VF-D. Und FC gehören zur &quot;Neuropharmakologie und Schmerz&quot; akkreditierten Arbeitsgruppe (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Die Arbeit wurde auch von der &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot; von CAPES (Brasilien) bis FC unterstützt

Alle tierversuchenden Verfahren wurden von der Universität von Barcelona Ausschuss für Tiernutzung und Pflege (CEEA) unter Einhaltung der Richtlinien, die im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren 11 und nach der Europäischen Gemeinschaft, das Gesetz 86/609 / CCE, FELASA und ARRIVE Richtlinien. So sind Mäuse in Standardkäfigen untergebracht, mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser und werden unter kontrollierten Standardbedingungen (12 h dunkler / leichter Zyklus ab 7:30 Uhr, 22 ° C Temperatur und 66% Feuchtigkeit) gehalten. 1. Erhalten von Maus-Gehirn-Synaptosomen mit einem diskontinuierlichen Sucrose-Gradienten Anmerkung: Diese Methode wurde zuvor gemeldet 10 . <ol><li> Bereiten Sie frischen Isolationspuffer (IB), pH 7.4; 2 M Saccharose; 1 M Saccharose / 0,1 mM CaCl 2 ; Und 0,1 mM CaCl &amp; sub2 ; (siehe Tabelle 1 ). Chill die Lösungen auf Eis. </li><li> SaFünf Mäuse durch zervikale Versetzung beenden Entkapseln und schnell das Gehirn eines jeden Tieres entfernen. Die Hirnregion von Interesse (dh den Hippocampus, 0,25-0,35 g frisches Gewebe) zerlegen und in eine 5 mL Potter-Elvehjem-Glasröhre auf Eis mit 1 mL IB geben. </li><li> Homogenisieren des Gewebes mit einem Homogenisierungsrührer (10 Hübe bei 700-900 Umdrehungen pro Minute), vorzugsweise in einem Eisbad, um die Probenwärme auszuschließen. </li><li> Das homogenisierte Gewebe (1 ml) in ein 15 ml-Röhrchen geben, das 6 ml 2 M Saccharose und 2,5 ml 0,1 mM CaCl 2 bei 4 ° C enthält. Mischen Sie langsam durch Umkehren der Röhre. Anmerkung: Die Zugabe von Calcium ist wesentlich für die Aufrechterhaltung der adhäsiven Wechselwirkungen zwischen Organellen und damit zur Erhaltung der Struktur der verschiedenen &quot;Dichten&quot;. </li><li> Die Lösung wird in ein 12-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und langsam 2,5 ml 1 M Saccharose / 0,1 mM CaCl 2 auf die Oberseite jedes Röhrchens gegeben, um den Saccharosegradienten zu bilden. Hinweis: Beschriftung der Position oF die Gradientenschnittstelle auf dem Zentrifugenröhrchen mit einer permanenten Markierung. </li><li> Wiegen und Ausgleichen der Zentrifugenröhrchen mit IB-Lösung in ihren entsprechenden Stahlträgern und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 3 h bei 100.000 x g und 4 ° C mit einer Schwenkschaufelrotorzentrifuge. Füllen Sie den Rotor vollständig mit allen Stahlträgern aus (ggf. leer). </li><li> Verwerfe die oste Schicht, die Myelin enthält. Mit einer Pasteurpipette den weißen Ring zwischen der 1,25-M- und 1-M-Saccharose-Interphase entsprechend der Synaptosomenfraktion sammeln. </li><li> Verdünnen Sie die Synaptosomen mit 9X ihr Volumen mit IB in einem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wiegen und Ausgleichen der Zentrifugenröhrchen mit IB-Lösung in ihren entsprechenden Stahlträgern und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Die Röhrchen für 30 min bei 15.000 x g und 4 ° C mit einer Schwenkschaufelrotorzentrifuge zentrifugieren. </li><li> Den Überstand verwerfen und thE-Pellet mit 1,1 ml IB-Lösung. 100 μl dieser synaptosomalen Lösung sammeln und 5 min bei 11.000 x g und 4 ºC zentrifugieren. </li><li> Das synaptosomale Pellet in 5% igem Natriumdodecylsulfat (SDS) resuspendieren und diese Probe bei -20 ºC aufbewahren. Anmerkung: Diese Probe entspricht der gesamten Synaptosomenfraktion für die weitere Western-Blot-Analyse. Die verbleibende synaptosomale Fraktion (~ 1 ml) kann entweder bei -20 ºC bis zur Verwendung oder zur nachfolgenden subynaptischen Fraktionierung eingefroren werden. Die Synaptosomen oder gereinigten Synapsen repräsentieren zwischen 1 und 2% des gesamten Hippocampusvolumens 12 . </li></ol> 2. Vor-, Post- und Extrasynaptische Isolation <ol><li> 2x frischen Solubilisierungspuffer, pH 6,0, vorbereiten; 1x Solubilisierungspuffer, pH 6,0; Solubilisierungspuffer, pH 8,0; Und 0,1 mM CaCl &amp; sub2 ; (siehe Tabelle 1 ). Chill die Lösungen auf Eis. Hinweis: Der pH-Wert dieser Lösungen sollte genau seinY angepasst, um eine gute subsynaptische Fraktionierung zu erreichen. </li><li> Die 1-ml-resuspendierte synaptosomale Fraktion (siehe Schritt 1.12) mit 5 ml 0,1 mM CaCl 2 langsam verdünnen. </li><li> Füge das gleiche Volumen (5 ml) eiskaltes 2x Solubilisierungspuffer, pH 6,0, hinzu und inkubiere für 50 min auf Eis unter hohem Rühren in einem Becher auf Eis. Anmerkung: Während 1% Triton X-100 bei pH 6,0 alle Plasmamembranproteine ​​löst, bewahrt es Proteine ​​innerhalb der synaptischen Kontakte oder Übergänge ( dh vor- und postsynaptische Strukturen) 4 . </li><li> Die Lösung in ein Zentrifugenröhrchen geben. Wiegen und Äquilibrieren der Röhrchen mit äquivalenten Volumina von 0,1 mM CaCl 2 und 2x Solubilisierungspufferlösung, pH 6,0, innerhalb ihrer entsprechenden Stahlträger und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 min bei 40.000 x g und 4 ° C mit einer schwenkbaren Eimer-Rotor-Zentrifuge. Der entstehende Überstand stellt die extrasynaptische Fraktion dar,Und das Pellet entspricht den synaptischen Übergängen ( dh vor- und postsynaptischen Fraktionen). </li><li> Konzentrieren Sie den Überstand, der die extrasynaptische Fraktion enthält, auf ein endgültiges 200 &amp; mgr; l Volumen unter Verwendung eines 15 ml 10 k Filterrohrs, das bei 4000 × g und 4 ºC zentrifugiert wurde. </li><li> Die resultierende konzentrierte extrasynaptische Fraktion (200 ul) mit 5 Volumina (1 ml) vorgekühltem (-20ºC) Aceton über Nacht bei -20ºC abfließen. </li><li> Am nächsten Tag wird die extrasynaptische Fraktion für 30 min bei 18.000 x g und -15 ° C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation den Acetonüberstand verwerfen und das Pellet trocknen, um jegliche Spur von Aceton zu entfernen. </li><li> Schließlich wird das Pellet, das die extrasynaptischen Proteine ​​enthält, mit 200 &amp; mgr; l 5% SDS resuspendiert. Sonde das Pellet, falls erforderlich. </li><li> Ohne sie zu stören, das Pellet sorgfältig mit den vor- und postsynaptischen Fraktionen mit 2 ml 1x Solubilisierungspuffer, pH 6,0, abwaschen. Verwerfe den Puffer </li><li> ResuspendierenDas Pellet mit 10 ml 1x Solubilisierungspuffer, pH 8,0, unter Verwendung einer Glaspasteurpipette. Anmerkung: Während 1% Triton X-100 bei pH 8,0 die präsynaptische Spezialisierung löst, bewahrt es die unlösliche postsynaptische Dichte 4 . </li><li> Inkubieren Sie die Suspension für 50 min auf Eis unter hohem Rühren in einem Becher auf Eis. </li><li> Die Lösung in ein Zentrifugenröhrchen geben. Wiegen und Äquilibrieren der Röhrchen mit 1x Solubilisierungspufferlösung, pH 8,0, innerhalb ihrer entsprechenden Stahlstützen und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 min bei 40.000 x g und 4 ° C mit einer schwenkbaren Eimer-Rotor-Zentrifuge; Der resultierende Überstand entspricht der präsynaptischen Fraktion und dem Pellet der postsynaptischen Fraktion. </li><li> Verarbeiten Sie den Überstand, der die präsynaptische Fraktion enthält, wie in den Schritten 2.6-2.9 beschrieben. </li><li> Resuspendieren des Pellets mit postsynaptischen Fraktion mit 200 μl 5% SDS. Sonde das Pellet, ichF erforderlich </li></ol> 3. Analysieren Sie die Proben durch Immunoblot, um die Membranfraktionierung zu validieren <ol><li> Bestimmen Sie die Menge an Protein in jeder Fraktion ( dh die Gesamt-, Extra-, Pre- und Post-Synaptic-Fraktionen) unter Verwendung des Bicinchoninsäure-Protein-Assays. </li><li> Nehmen Sie 20 μg Protein aus jeder Fraktion und verdünnen Sie es auf ein Endvolumen von 50 μl in SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Probenpuffer. 5 min bei 100 ºC kochen. </li><li> Trennen Sie die Proteine ​​durch SDS-PAGE-Elektrophorese 10%, mit einem 4% konzentrierenden Gel unter reduzierenden Bedingungen. Elektrophorese bei konstanter Spannung von 80 V, bis der Farbstoff in das untere Gel eintritt und dann die Spannung auf 120 V erhöht. </li><li> Übertragen Sie die Proteine ​​auf eine PVDF-Membran und blockieren Sie mit IB-Blockierlösung für 45 min bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Inkubieren der Membran über Nacht bei 4 ºC mit dem angegebenen primären Antikörper ( dh anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, Anti-Synaptophysin oder Anti-GPR37) verdünnt in IB-Blockierungslösung unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Membran dreimal (jeweils 10 min) mit IB-Waschlösung, um ungebundenen primären Antikörper zu eliminieren. </li><li> Inkubieren mit dem angegebenen sekundären Antikörper für 90 min in dunklen Bedingungen bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Membran dreimal (jeweils 10 min) mit IB-Waschlösung, um ungebundenen sekundären Antikörper zu eliminieren. </li><li> Inkubieren Sie die Membran mit chemilumineszierendem Substrat (bereiten Sie die Mischung unter dunklen Bedingungen vor und folgen Sie dem 1: 1-Anteil der Lösung A und B, die vom Hersteller bereitgestellt wird). </li><li> Analysieren Sie die Membran in einer Chemilumineszenz-Detektionsvorrichtung. </li></ol>

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+III:+The+Central+Nervous+System.">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , (1897).</li><li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The fine structure of the nervous system. , (1991).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li><li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presynaptic+particle+web:+ultrastructure,+composition,+dissolution,+and+reconstitution.">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li><li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus.">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li><li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+adenosine+A(1)+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus.">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li><li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat.">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li><li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1,+P2X2/3,+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1,+P2Y2,+and/or+P2Y4+Receptors+in+the+Rat.">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li><li>Gar&#231;&#227;o, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits:+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum.">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li><li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parkinson's+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus:+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system.">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li><li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+Report:+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li><li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart:+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications.">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li><li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain.">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li><li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization.">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li><li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37.">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li><li>Gand&#236;a, J., Fern&#225;ndez-Due&#241;as, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain.">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li><li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin.">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li><li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pael+receptor,+endoplasmic+reticulum+stress,+and+Parkinson's+disease.">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9 (2003).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

Die synaptische Übertragung beruht auf der physischen Integrität der Synapse, ein Konzept, das schon 1897 von Foster und Sherrington 1 vorgesehen war. Daher ist das Verständnis der Verteilung der Schlüsselneurotransmission-Komponenten ( z. B. Ionenkanäle, Rezeptoren usw. ) unerlässlich, um die synaptische Funktion sowohl bei normalen als auch bei pathologischen Zuständen aufzuklären. Die Elektronenmikroskopie (EM) hat enorm zur aktuellen ultrastrukturellen Vorstellung von Prototypen des zentralen Nervensystems (ZNS) beigetragen. Auf diese Weise hat EM die Unterschiede zwischen prä- und postsynaptischen Dichten, die durch eine Spalte mit einem ziemlich gleichmäßigen Abstand (~ 25 nm) getrennt sind, fein festgelegt. Interessanterweise weist die postsynaptische Apparatur eine relativ kontinuierliche, elektronendichte Verdickung unterhalb ihrer Plasmamembran, die sogenannte postsynaptische Dichte oder PSD 2 auf . Umgekehrt, bei der präsynaptischen Apparatur, eine bemerkenswerteE diskontinuierliches Cytomatrix-Netzwerk ist gerade unterhalb der Plasmamembran angeordnet, was für die Ausrichtung und das Andocken von synaptischen Vesikeln auf die aktive Zone der Plasmamembran wesentlich ist. Daher stellt EM den goldenen experimentellen Ansatz dar, um die Verteilung von Proteinen innerhalb strukturell konservierter ZNS-Synapsen zu untersuchen. Jedoch ist die Information, die durch Elektronenmikrographien bereitgestellt wird, statisch. In der Tat zeigen akkumulierende Beweise, dass in vivo Synapsen extrem dynamisch sind und so dramatische strukturelle Veränderungen bei anhaltender synaptischer Übertragung erleben. Darüber hinaus können sich die Morphologie und Zusammensetzung der Synapsen in verschiedenen ZNS-Regionen und bei der Entwicklung, Reifung, Alterung und der Entwicklung neuropathologischer Zustände ändern. Insgesamt stellt ein Protokoll zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten in physiologischen Zuständen gehören, ein wertvolles Werkzeug für eine umfassendere Untersuchung der synaptischen Funktion dar. <p cLass = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier beschreiben wir diese Art von komplementärem experimentellen Ansatz, der die präparative biochemische Anreicherung der verschiedenen synaptischen Membranfächer ermöglicht - nämlich extra-, vor- und postsynaptische Membrandomänen. Dieses Membranfraktionierungsverfahren, das zuerst von Philips et al . (2001) 4 beruht auf einer pH-Verschiebung, die die in der prä- und postsynaptischen Apparatur auftretenden adhäsiven Wechselwirkungen schwächt. Zunächst ist es durch die Verwendung von milden Reinigungsmitteln bei pH 6,0 möglich, den Adhäsionsübergang zu erkennen, der die prä- und postsynaptische Apparatur hält und der von der extrasynaptischen Membrandomäne gehalten wird, die solubilisiert ist und somit aus den synaptischen Kontakten extrahiert werden kann. Anschließend schwächt die Erhöhung des pH-Werts von 6,0 auf 8,0 in Gegenwart von milden Reinigungsmitteln die Festigkeit des adhärenten Übergangs, der die präsynaptische aktive Zone fest an die postsynaptische Dichte gebunden hält. Daher ist das präsynaptische Fach soLubilisiert und kann von der postsynaptischen Dichte getrennt werden, die meistens erhalten bleibt, weil die Konzentration des verwendeten Waschmittels ihre Solubilisierung nicht begünstigt 4 . Interessanterweise kann die Fraktionierungseffizienz, eventuell höher als 90%, durch verschiedene subsynaptische Marker bestätigt werden: i ) synaptosomal assoziiertes Protein 25 (SNAP-25) aus der präsynaptischen aktiven Zone; Ii ) Synaptophysin aus der extrasynaptischen Fraktion ( dh außerhalb der aktiven Zone und einschließlich Mikrosomen); Und iii ) postsynaptisches Dichteprotein 95 (PSD-95), aus der postsynaptischen Dichte. Bemerkenswert ist, dass diese Hirnmembranfraktionierungsmethode erfolgreich eingesetzt wurde. Dementsprechend war es möglich, die subsynaptische Lokalisierung verschiedener Rezeptoren, wie alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) -Rezeptoren 5 , Adenosin-A 1 -Rezeptor (A 1 R) 6 präzise zu bestimmen ,Adenosin-A 2A -Rezeptor (A 2A R) 7 , Adenosintriphosphat (ATP) P2-Rezeptoren 8 , Nikotinacetylcholinrezeptor-Untereinheiten 9 und Parkinson-assoziierter Rezeptor GPR37 10 . Eine Reihe von Beschränkungen kann jedoch eine angemessene Beurteilung der synaptischen Verteilung eines bestimmten neuronalen Proteins behindern. So beschreiben wir in diesem Verfahren nicht nur das gesamte Protokoll vollständig, sondern auch einige kritische Punkte, wie die relativ große Menge an benötigtem Gewebe, die geringe Proteinausbeute und die zwingende Anforderung, die Effizienz zu validieren Jede Trennung vor der Durchführung des definierten Experiments.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sucrose</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,211,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">CaCl2</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">2,112,211,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,313,961,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Protease inhibitor cocktail Set III</td>
			<td style="width:249px;">Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">535140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,236,541,209</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">SDS</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">L3771</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Glycerol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">G5516</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,311,651,604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">D0632</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tween 20</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:249px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">NaCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,216,591,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,314,941,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:249px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">4873</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,781,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Basic 20 pH</td>
			<td style="width:249px;">Crison, Alella, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:128px;">Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;">344059</td>
			<td style="width:167px;">Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td>
			<td style="width:249px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">UFC901008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Centrifuge 5430R</td>
			<td style="width:249px;">Eppendorf, Hamburgo, Germany</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sonifier 250</td>
			<td style="width:249px;">Branson, Danbury, Connecticut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:249px;">GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td style="width:160px;">612-1702</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Compact Balance EK-610</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:249px;">Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">GR 200 Precision Balance</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-GPR37</td>
			<td style="width:249px;">Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td>
			<td style="width:249px;">Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:30000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

Die Beurteilung der synaptischen Proteinzusammensetzung und -funktion stellt eine wichtige Herausforderung in der Neurowissenschaft dar. Allerdings ist es nicht einfach, die Neurotransmission, die in Synapsen auftritt, zu bewerten, da sie durch dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen und Phosphorylierungsereignisse stark reguliert wird. Dementsprechend ist es, wenn eine Methode verwendet wird, um synaptische Transmission zu studieren, ein wichtiges Ziel, diese vorübergehenden physiologischen Modifikationen zu bewahren. Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt. Mit anderen Worten beschreibt das Protokoll eine biochemische Methodik zur Durchführung der Proteinanreicherung aus präsynaptischen, postsynaptischen und extrasynaptischen Kompartimenten. Zuerst werden Synaptosomen oder synaptische Terminals aus Neuronen gewonnen, die alle synaptischen Kompartimente mit einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten enthalten. Bemerkenswert ist die Qualität dieser ersten synaptischen Membranvorbereitung cRituell Anschließend wird die Isolierung der verschiedenen subsynaptischen Kompartimente mit leichter Solubilisierung unter Verwendung von milden Reinigungsmitteln bei unterschiedlichen pH-Bedingungen erreicht. Dies ermöglicht eine Trennung durch Gradienten- und Isopycnic-Zentrifugationen. Schließlich wird die Proteinanreicherung an den verschiedenen subsynaptischen Kompartimenten ( dh vor-, post- und extrasynaptischen Membranfraktionen) mittels Immunoblotanalyse mittels gut charakterisierter synaptischer Proteinmarker ( dh SNAP-25, PSD-95 und Synaptophysin, ), So dass eine direkte Bewertung der synaptischen Verteilung eines bestimmten neuronalen Proteins ermöglicht wird.

Die beschriebene Methodik wurde weitgehend für die subsynaptische Analyse von neuronalen Proteinen im Allgemeinen und für die Isolierung und biochemische Charakterisierung der synaptischen Rezeptoren 5 , 6 , 7 , 8 , 9 insbesondere verwendet. Interessanterweise zeigt das hier dargestellte repräsentative Ergebnis die Nützlic...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization at JoVE.com

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

10.3K Aufrufe.  Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat.  Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt. 

Serie: Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

Messung von Wechselwirkungen zwischen fluoreszierenden Sonden und Lignin in Pflanzenabschnitten durch sFLIM basierend auf nativer Autofluoreszenz

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...