Name: brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
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Diese Arbeit wurde unterstützt von Ministerio de Economìa y Competitividad / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 und PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 ) Und Agentschap voor Innovatie Tür Wetenschap en Technologie (SBO-140028) an FC Auch X. M, VF-D. Und FC gehören zur &quot;Neuropharmakologie und Schmerz&quot; akkreditierten Arbeitsgruppe (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Die Arbeit wurde auch von der &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot; von CAPES (Brasilien) bis FC unterstützt

Alle tierversuchenden Verfahren wurden von der Universität von Barcelona Ausschuss für Tiernutzung und Pflege (CEEA) unter Einhaltung der Richtlinien, die im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren 11 und nach der Europäischen Gemeinschaft, das Gesetz 86/609 / CCE, FELASA und ARRIVE Richtlinien. So sind Mäuse in Standardkäfigen untergebracht, mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser und werden unter kontrollierten Standardbedingungen (12 h dunkler / leichter Zyklus ab 7:30 Uhr, 22 ° C Temperatur und 66% Feuchtigkeit) gehalten. 1. Erhalten von Maus-Gehirn-Synaptosomen mit einem diskontinuierlichen Sucrose-Gradienten Anmerkung: Diese Methode wurde zuvor gemeldet 10 . <ol><li> Bereiten Sie frischen Isolationspuffer (IB), pH 7.4; 2 M Saccharose; 1 M Saccharose / 0,1 mM CaCl 2 ; Und 0,1 mM CaCl &amp; sub2 ; (siehe Tabelle 1 ). Chill die Lösungen auf Eis. </li><li> SaFünf Mäuse durch zervikale Versetzung beenden Entkapseln und schnell das Gehirn eines jeden Tieres entfernen. Die Hirnregion von Interesse (dh den Hippocampus, 0,25-0,35 g frisches Gewebe) zerlegen und in eine 5 mL Potter-Elvehjem-Glasröhre auf Eis mit 1 mL IB geben. </li><li> Homogenisieren des Gewebes mit einem Homogenisierungsrührer (10 Hübe bei 700-900 Umdrehungen pro Minute), vorzugsweise in einem Eisbad, um die Probenwärme auszuschließen. </li><li> Das homogenisierte Gewebe (1 ml) in ein 15 ml-Röhrchen geben, das 6 ml 2 M Saccharose und 2,5 ml 0,1 mM CaCl 2 bei 4 ° C enthält. Mischen Sie langsam durch Umkehren der Röhre. Anmerkung: Die Zugabe von Calcium ist wesentlich für die Aufrechterhaltung der adhäsiven Wechselwirkungen zwischen Organellen und damit zur Erhaltung der Struktur der verschiedenen &quot;Dichten&quot;. </li><li> Die Lösung wird in ein 12-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und langsam 2,5 ml 1 M Saccharose / 0,1 mM CaCl 2 auf die Oberseite jedes Röhrchens gegeben, um den Saccharosegradienten zu bilden. Hinweis: Beschriftung der Position oF die Gradientenschnittstelle auf dem Zentrifugenröhrchen mit einer permanenten Markierung. </li><li> Wiegen und Ausgleichen der Zentrifugenröhrchen mit IB-Lösung in ihren entsprechenden Stahlträgern und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 3 h bei 100.000 x g und 4 ° C mit einer Schwenkschaufelrotorzentrifuge. Füllen Sie den Rotor vollständig mit allen Stahlträgern aus (ggf. leer). </li><li> Verwerfe die oste Schicht, die Myelin enthält. Mit einer Pasteurpipette den weißen Ring zwischen der 1,25-M- und 1-M-Saccharose-Interphase entsprechend der Synaptosomenfraktion sammeln. </li><li> Verdünnen Sie die Synaptosomen mit 9X ihr Volumen mit IB in einem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wiegen und Ausgleichen der Zentrifugenröhrchen mit IB-Lösung in ihren entsprechenden Stahlträgern und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Die Röhrchen für 30 min bei 15.000 x g und 4 ° C mit einer Schwenkschaufelrotorzentrifuge zentrifugieren. </li><li> Den Überstand verwerfen und thE-Pellet mit 1,1 ml IB-Lösung. 100 μl dieser synaptosomalen Lösung sammeln und 5 min bei 11.000 x g und 4 ºC zentrifugieren. </li><li> Das synaptosomale Pellet in 5% igem Natriumdodecylsulfat (SDS) resuspendieren und diese Probe bei -20 ºC aufbewahren. Anmerkung: Diese Probe entspricht der gesamten Synaptosomenfraktion für die weitere Western-Blot-Analyse. Die verbleibende synaptosomale Fraktion (~ 1 ml) kann entweder bei -20 ºC bis zur Verwendung oder zur nachfolgenden subynaptischen Fraktionierung eingefroren werden. Die Synaptosomen oder gereinigten Synapsen repräsentieren zwischen 1 und 2% des gesamten Hippocampusvolumens 12 . </li></ol> 2. Vor-, Post- und Extrasynaptische Isolation <ol><li> 2x frischen Solubilisierungspuffer, pH 6,0, vorbereiten; 1x Solubilisierungspuffer, pH 6,0; Solubilisierungspuffer, pH 8,0; Und 0,1 mM CaCl &amp; sub2 ; (siehe Tabelle 1 ). Chill die Lösungen auf Eis. Hinweis: Der pH-Wert dieser Lösungen sollte genau seinY angepasst, um eine gute subsynaptische Fraktionierung zu erreichen. </li><li> Die 1-ml-resuspendierte synaptosomale Fraktion (siehe Schritt 1.12) mit 5 ml 0,1 mM CaCl 2 langsam verdünnen. </li><li> Füge das gleiche Volumen (5 ml) eiskaltes 2x Solubilisierungspuffer, pH 6,0, hinzu und inkubiere für 50 min auf Eis unter hohem Rühren in einem Becher auf Eis. Anmerkung: Während 1% Triton X-100 bei pH 6,0 alle Plasmamembranproteine ​​löst, bewahrt es Proteine ​​innerhalb der synaptischen Kontakte oder Übergänge ( dh vor- und postsynaptische Strukturen) 4 . </li><li> Die Lösung in ein Zentrifugenröhrchen geben. Wiegen und Äquilibrieren der Röhrchen mit äquivalenten Volumina von 0,1 mM CaCl 2 und 2x Solubilisierungspufferlösung, pH 6,0, innerhalb ihrer entsprechenden Stahlträger und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 min bei 40.000 x g und 4 ° C mit einer schwenkbaren Eimer-Rotor-Zentrifuge. Der entstehende Überstand stellt die extrasynaptische Fraktion dar,Und das Pellet entspricht den synaptischen Übergängen ( dh vor- und postsynaptischen Fraktionen). </li><li> Konzentrieren Sie den Überstand, der die extrasynaptische Fraktion enthält, auf ein endgültiges 200 &amp; mgr; l Volumen unter Verwendung eines 15 ml 10 k Filterrohrs, das bei 4000 × g und 4 ºC zentrifugiert wurde. </li><li> Die resultierende konzentrierte extrasynaptische Fraktion (200 ul) mit 5 Volumina (1 ml) vorgekühltem (-20ºC) Aceton über Nacht bei -20ºC abfließen. </li><li> Am nächsten Tag wird die extrasynaptische Fraktion für 30 min bei 18.000 x g und -15 ° C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation den Acetonüberstand verwerfen und das Pellet trocknen, um jegliche Spur von Aceton zu entfernen. </li><li> Schließlich wird das Pellet, das die extrasynaptischen Proteine ​​enthält, mit 200 &amp; mgr; l 5% SDS resuspendiert. Sonde das Pellet, falls erforderlich. </li><li> Ohne sie zu stören, das Pellet sorgfältig mit den vor- und postsynaptischen Fraktionen mit 2 ml 1x Solubilisierungspuffer, pH 6,0, abwaschen. Verwerfe den Puffer </li><li> ResuspendierenDas Pellet mit 10 ml 1x Solubilisierungspuffer, pH 8,0, unter Verwendung einer Glaspasteurpipette. Anmerkung: Während 1% Triton X-100 bei pH 8,0 die präsynaptische Spezialisierung löst, bewahrt es die unlösliche postsynaptische Dichte 4 . </li><li> Inkubieren Sie die Suspension für 50 min auf Eis unter hohem Rühren in einem Becher auf Eis. </li><li> Die Lösung in ein Zentrifugenröhrchen geben. Wiegen und Äquilibrieren der Röhrchen mit 1x Solubilisierungspufferlösung, pH 8,0, innerhalb ihrer entsprechenden Stahlstützen und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 min bei 40.000 x g und 4 ° C mit einer schwenkbaren Eimer-Rotor-Zentrifuge; Der resultierende Überstand entspricht der präsynaptischen Fraktion und dem Pellet der postsynaptischen Fraktion. </li><li> Verarbeiten Sie den Überstand, der die präsynaptische Fraktion enthält, wie in den Schritten 2.6-2.9 beschrieben. </li><li> Resuspendieren des Pellets mit postsynaptischen Fraktion mit 200 μl 5% SDS. Sonde das Pellet, ichF erforderlich </li></ol> 3. Analysieren Sie die Proben durch Immunoblot, um die Membranfraktionierung zu validieren <ol><li> Bestimmen Sie die Menge an Protein in jeder Fraktion ( dh die Gesamt-, Extra-, Pre- und Post-Synaptic-Fraktionen) unter Verwendung des Bicinchoninsäure-Protein-Assays. </li><li> Nehmen Sie 20 μg Protein aus jeder Fraktion und verdünnen Sie es auf ein Endvolumen von 50 μl in SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Probenpuffer. 5 min bei 100 ºC kochen. </li><li> Trennen Sie die Proteine ​​durch SDS-PAGE-Elektrophorese 10%, mit einem 4% konzentrierenden Gel unter reduzierenden Bedingungen. Elektrophorese bei konstanter Spannung von 80 V, bis der Farbstoff in das untere Gel eintritt und dann die Spannung auf 120 V erhöht. </li><li> Übertragen Sie die Proteine ​​auf eine PVDF-Membran und blockieren Sie mit IB-Blockierlösung für 45 min bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Inkubieren der Membran über Nacht bei 4 ºC mit dem angegebenen primären Antikörper ( dh anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, Anti-Synaptophysin oder Anti-GPR37) verdünnt in IB-Blockierungslösung unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Membran dreimal (jeweils 10 min) mit IB-Waschlösung, um ungebundenen primären Antikörper zu eliminieren. </li><li> Inkubieren mit dem angegebenen sekundären Antikörper für 90 min in dunklen Bedingungen bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Membran dreimal (jeweils 10 min) mit IB-Waschlösung, um ungebundenen sekundären Antikörper zu eliminieren. </li><li> Inkubieren Sie die Membran mit chemilumineszierendem Substrat (bereiten Sie die Mischung unter dunklen Bedingungen vor und folgen Sie dem 1: 1-Anteil der Lösung A und B, die vom Hersteller bereitgestellt wird). </li><li> Analysieren Sie die Membran in einer Chemilumineszenz-Detektionsvorrichtung. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

Die synaptische Übertragung beruht auf der physischen Integrität der Synapse, ein Konzept, das schon 1897 von Foster und Sherrington 1 vorgesehen war. Daher ist das Verständnis der Verteilung der Schlüsselneurotransmission-Komponenten ( z. B. Ionenkanäle, Rezeptoren usw. ) unerlässlich, um die synaptische Funktion sowohl bei normalen als auch bei pathologischen Zuständen aufzuklären. Die Elektronenmikroskopie (EM) hat enorm zur aktuellen ultrastrukturellen Vorstellung von Prototypen des zentralen Nervensystems (ZNS) beigetragen. Auf diese Weise hat EM die Unterschiede zwischen prä- und postsynaptischen Dichten, die durch eine Spalte mit einem ziemlich gleichmäßigen Abstand (~ 25 nm) getrennt sind, fein festgelegt. Interessanterweise weist die postsynaptische Apparatur eine relativ kontinuierliche, elektronendichte Verdickung unterhalb ihrer Plasmamembran, die sogenannte postsynaptische Dichte oder PSD 2 auf . Umgekehrt, bei der präsynaptischen Apparatur, eine bemerkenswerteE diskontinuierliches Cytomatrix-Netzwerk ist gerade unterhalb der Plasmamembran angeordnet, was für die Ausrichtung und das Andocken von synaptischen Vesikeln auf die aktive Zone der Plasmamembran wesentlich ist. Daher stellt EM den goldenen experimentellen Ansatz dar, um die Verteilung von Proteinen innerhalb strukturell konservierter ZNS-Synapsen zu untersuchen. Jedoch ist die Information, die durch Elektronenmikrographien bereitgestellt wird, statisch. In der Tat zeigen akkumulierende Beweise, dass in vivo Synapsen extrem dynamisch sind und so dramatische strukturelle Veränderungen bei anhaltender synaptischer Übertragung erleben. Darüber hinaus können sich die Morphologie und Zusammensetzung der Synapsen in verschiedenen ZNS-Regionen und bei der Entwicklung, Reifung, Alterung und der Entwicklung neuropathologischer Zustände ändern. Insgesamt stellt ein Protokoll zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten in physiologischen Zuständen gehören, ein wertvolles Werkzeug für eine umfassendere Untersuchung der synaptischen Funktion dar. <p cLass = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier beschreiben wir diese Art von komplementärem experimentellen Ansatz, der die präparative biochemische Anreicherung der verschiedenen synaptischen Membranfächer ermöglicht - nämlich extra-, vor- und postsynaptische Membrandomänen. Dieses Membranfraktionierungsverfahren, das zuerst von Philips et al . (2001) 4 beruht auf einer pH-Verschiebung, die die in der prä- und postsynaptischen Apparatur auftretenden adhäsiven Wechselwirkungen schwächt. Zunächst ist es durch die Verwendung von milden Reinigungsmitteln bei pH 6,0 möglich, den Adhäsionsübergang zu erkennen, der die prä- und postsynaptische Apparatur hält und der von der extrasynaptischen Membrandomäne gehalten wird, die solubilisiert ist und somit aus den synaptischen Kontakten extrahiert werden kann. Anschließend schwächt die Erhöhung des pH-Werts von 6,0 auf 8,0 in Gegenwart von milden Reinigungsmitteln die Festigkeit des adhärenten Übergangs, der die präsynaptische aktive Zone fest an die postsynaptische Dichte gebunden hält. Daher ist das präsynaptische Fach soLubilisiert und kann von der postsynaptischen Dichte getrennt werden, die meistens erhalten bleibt, weil die Konzentration des verwendeten Waschmittels ihre Solubilisierung nicht begünstigt 4 . Interessanterweise kann die Fraktionierungseffizienz, eventuell höher als 90%, durch verschiedene subsynaptische Marker bestätigt werden: i ) synaptosomal assoziiertes Protein 25 (SNAP-25) aus der präsynaptischen aktiven Zone; Ii ) Synaptophysin aus der extrasynaptischen Fraktion ( dh außerhalb der aktiven Zone und einschließlich Mikrosomen); Und iii ) postsynaptisches Dichteprotein 95 (PSD-95), aus der postsynaptischen Dichte. Bemerkenswert ist, dass diese Hirnmembranfraktionierungsmethode erfolgreich eingesetzt wurde. Dementsprechend war es möglich, die subsynaptische Lokalisierung verschiedener Rezeptoren, wie alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) -Rezeptoren 5 , Adenosin-A 1 -Rezeptor (A 1 R) 6 präzise zu bestimmen ,Adenosin-A 2A -Rezeptor (A 2A R) 7 , Adenosintriphosphat (ATP) P2-Rezeptoren 8 , Nikotinacetylcholinrezeptor-Untereinheiten 9 und Parkinson-assoziierter Rezeptor GPR37 10 . Eine Reihe von Beschränkungen kann jedoch eine angemessene Beurteilung der synaptischen Verteilung eines bestimmten neuronalen Proteins behindern. So beschreiben wir in diesem Verfahren nicht nur das gesamte Protokoll vollständig, sondern auch einige kritische Punkte, wie die relativ große Menge an benötigtem Gewebe, die geringe Proteinausbeute und die zwingende Anforderung, die Effizienz zu validieren Jede Trennung vor der Durchführung des definierten Experiments.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,316,211,211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>2,112,211,210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H2O</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,313,961,210</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail Set III</td><td>Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,311,651,604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Non fat dry milk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,216,591,211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,314,941,210</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,316,781,211</td><td></td></tr><tr><td>Basic 20 pH</td><td>Crison, Alella, Spain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td><td>VWR, Radnor, PA, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td>344059</td><td>Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Compact Balance EK-610</td><td>A&amp;amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GR 200 Precision Balance</td><td>A&amp;amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td><td></td><td>Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td></td><td>Primary antibodies diluted 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Secondary antibody diluted 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Secondary antibody diluted 1:30,000</td></tr></tbody></table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

Die Beurteilung der synaptischen Proteinzusammensetzung und -funktion stellt eine wichtige Herausforderung in der Neurowissenschaft dar. Allerdings ist es nicht einfach, die Neurotransmission, die in Synapsen auftritt, zu bewerten, da sie durch dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen und Phosphorylierungsereignisse stark reguliert wird. Dementsprechend ist es, wenn eine Methode verwendet wird, um synaptische Transmission zu studieren, ein wichtiges Ziel, diese vorübergehenden physiologischen Modifikationen zu bewahren. Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt. Mit anderen Worten beschreibt das Protokoll eine biochemische Methodik zur Durchführung der Proteinanreicherung aus präsynaptischen, postsynaptischen und extrasynaptischen Kompartimenten. Zuerst werden Synaptosomen oder synaptische Terminals aus Neuronen gewonnen, die alle synaptischen Kompartimente mit einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten enthalten. Bemerkenswert ist die Qualität dieser ersten synaptischen Membranvorbereitung cRituell Anschließend wird die Isolierung der verschiedenen subsynaptischen Kompartimente mit leichter Solubilisierung unter Verwendung von milden Reinigungsmitteln bei unterschiedlichen pH-Bedingungen erreicht. Dies ermöglicht eine Trennung durch Gradienten- und Isopycnic-Zentrifugationen. Schließlich wird die Proteinanreicherung an den verschiedenen subsynaptischen Kompartimenten ( dh vor-, post- und extrasynaptischen Membranfraktionen) mittels Immunoblotanalyse mittels gut charakterisierter synaptischer Proteinmarker ( dh SNAP-25, PSD-95 und Synaptophysin, ), So dass eine direkte Bewertung der synaptischen Verteilung eines bestimmten neuronalen Proteins ermöglicht wird.

Die beschriebene Methodik wurde weitgehend für die subsynaptische Analyse von neuronalen Proteinen im Allgemeinen und für die Isolierung und biochemische Charakterisierung der synaptischen Rezeptoren 5 , 6 , 7 , 8 , 9 insbesondere verwendet. Interessanterweise zeigt das hier dargestellte repräsentative Ergebnis die Nützlic...

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Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

10.3K Aufrufe.  Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat.  Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt. 

Serie: Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Forschung

Neurowissenschaften

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Hohe Auflösung Quantitative Synaptische Proteome Profilieren von Maus Hirnregionen Nach Auditory Diskriminierung Lernen

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS induces generalized tonic-clonic seizures with low mortality and neuronal death and is a widely-used model to screen anti-epileptic drugs. Here, we describe an ECS induction method in which a brief 55-mA current is delivered for 0.5 s to male rats 200 - 250 g in weight via ear-clip electrodes. Such bilateral stimulation produced stage 4 - 5 clonic seizures that lasted about 10 s. After the cessation of acute or chronic ECS, most rats recovered to be behaviorally indistinguishable from sham &#34;no seizure&#34; rats. Because ECS globally elevates brain activity, it has also been used to examine activity-dependent alterations of synaptic proteins and their effects on synaptic strength using multiple methods. In particular, subcellular fractionation of the postsynaptic density (PSD) in combination with Western blotting allows for the quantitative determination of the abundance of synaptic proteins at this specialized synaptic structure. In contrast to a previous fractionation method that requires large amount of rodent brains, we describe here a small-scale fractionation method to isolate the PSD from the hippocampi of a single rat, without sucrose gradient centrifugation. Using this method, we show that the isolated PSD fraction contains postsynaptic membrane proteins, including PSD95, GluN2B, and GluA2. Presynaptic marker synaptophysin and soluble cytoplasmic protein &#945;-tubulin were excluded from the PSD fraction, demonstrating successful PSD isolation. Furthermore, chronic ECS decreased GluN2B expression in the PSD, indicating that our small-scale PSD fractionation method can be applied to detect the changes in hippocampal PSD proteins from a single rat after genetic, pharmacological, or mechanical treatments.

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy for severe depression. ECS globally stimulates activity in the hippocampus, leading to synaptogenesis and synaptic plasticity. Here, we describe methods for ECS induction in rats and for subcellular fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in synaptic proteins.

Elektrokrampftherapie Anfälle bei Ratten und Fraktionierung von ihren Hippocampi Beschlagnahme verursachten Veränderungen in den Proteinen der postsynaptischen Dichte prüfen

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

Mikrotransplantation synaptischer Membranen zur Reaktivierung humaner synaptischer Rezeptoren für funktionelle Studien

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.

Subzelluläre Fraktionierung zur Isolierung synaptischer Komponenten aus dem murinen Gehirn

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Gehirn Membran Fraktionierung: An

Zusammenfassung

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