この研究は、サンパウロ・カルロス3世大臣（SAF2014-55700-P、PCIN-2013-019-C03-03およびPIE14 / 00034）、カタリナ・デ・レクレッサー・エスティス・アバナッツ（ICREA Academia-2010）また、X. M、VF-D。、およびFCは、「神経薬理学および疼痛」認定研究グループ（Catalunya Generaletat de Catalunya、2014 SGR 1251）に属しています。 。この作品はまた、CAPES（ブラジル）からFCへの &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciênciasem Fronteiras&quot;

全ての動物実験手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドライン11および欧州共同体に従ったガイドライン86/609/5に記載されているガイドラインに従って、バルセロナ大学動物実験委員会（CEEA） CCE、FELASA、およびARRIVEのガイドライン。したがって、マウスを標準的なケージに入れ、食物および水を自由に摂取させ、制御された標準条件下（7時間30分、22℃の温度および66％の湿度から始まる12時間の暗/明サイクル）で維持する。 1.不連続なスクロース勾配を用いたマウス脳シナプトソームの取得注：この方法は以前に報告された10 。 <ol><li>新鮮な分離バッファー（IB）、pH 7.4を調製する。 2Mスクロース; 1Mショ糖/0.1mM CaCl 2 ; 0.1mM CaCl 2 （ 表1を参照のこと）。溶液を氷上で冷やす。 </li><li> Sa子宮頸管脱臼により5匹のマウスを裂く。各動物の脳を断ち切って迅速に除去する。目的の脳領域（すなわち、海馬、新鮮な組織0.25~0.35g）を摘出し、1mLのIBを含む氷上の5mL Potter-Elvehjemガラス管に入れる。 </li><li>ホモジナイジングスターラー（1分間に700〜900回転で10ストローク）を使用して、好ましくは氷浴中で組織をホモジナイズし、サンプルの加温を防止する。 </li><li> 4℃で2Mスクロース6 mLと0.1 mM CaCl 2 2.5 mLを含む15 mLチューブにホモジナイズした組織（1 mL）を入れます。チューブを逆さにしてゆっくりと混合する。 注：カルシウムの添加は、オルガネラ間の接着相互作用を維持し、それによって異なる「密度」の構造を維持するために不可欠です。 </li><li>溶液を12mLの遠心チューブに入れ、スクロースグラジエントを形成するために各チューブの上に2.5mLの1Mショ糖/0.1mMのCaCl 2をゆっくり加える。 注：ラベルの位置o恒久的なマーカーを用いて遠心チューブ上の勾配界面。 </li><li>対応するスチールサポート内のIB溶液と閉鎖蓋で遠心チューブを計量して平衡させます。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを100,000× gおよび4℃で3時間遠心分離する。すべてのスチールサポート（必要に応じて空の場合もあります）でロータを完全に充填します。 </li><li>ミエリンを含む最上層を捨てる。パスツールピペットで、シナプトソーム画分に対応する1.25-Mと1-Mスクロース間期の間に白いリングを集める。 </li><li>遠心管内でIBを用いてシナプソームを9倍に希釈する。 </li><li>対応するスチールサポート内のIB溶液と閉鎖蓋で遠心チューブを計量して平衡させます。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して15,000 x g 、4℃で30分間チューブを遠心分離する。 </li><li>上清を捨てて再懸濁する1.1mLのIB溶液を添加した。このシナプトソーム溶液100μLを集め、11,000 x gと4°Cで5分間遠心します。 </li><li>シナプトソームペレットを5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に再懸濁し、-20℃で保存します。 注：このサンプルは、さらなるウェスタンブロット解析のための総シナプトソーム画分に対応します。残りのシナプトソーム画分（〜1 mL）は、使用するまで-20℃で凍結するか、その後のシナプス後分画のために処理することができます。シナプトソームまたは精製されたシナプスは、総海馬体積の1〜2％を占める。 </li></ol> 2.前シナプス後シナプスおよび後シナプス間の分離<ol><li>新鮮な可溶化緩衝液（pH6.0）を2倍調製する; 1×可溶化緩衝液、pH6.0;可溶化緩衝液、pH8.0; 0.1mM CaCl 2 （ 表1を参照のこと）。溶液を氷上で冷やす。 注：これらの溶液のpHは正確でなければならない良好な亜シナプス分画を達成するように調整した。 </li><li> 1mLの再懸濁したシナプトソーム画分（ステップ1.12参照）を5mLの0.1mM CaCl 2でゆっくり希釈する。 </li><li>同じ容量（5mL）の氷冷2倍可溶化緩衝液（pH6.0）を添加し、氷上でビーカー内で高攪拌しながら氷上で50分間インキュベートする。 注意：pH6.0のTriton X-100の1％はすべての原形質膜タンパク質を可溶化しますが、シナプスの接点または接合部（ すなわちシナプス前およびシナプス後）にタンパク質を保存します4 。 </li><li>溶液を遠心管に入れる。それらの対応するスチール支持体内およびそれらの閉じたふたの中で、0.1mMのCaCl 2および2倍の可溶化緩衝液pH6.0の等容量の試験管を秤量し、平衡化する。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを40,000 x gで4℃で30分間遠心します。得られた上清は、シナプス外画分を表し、ペレットはシナプス接合部（ すなわちシナプス前およびシナプス分画）に対応する。 </li><li> 4000 xgと4℃で遠心分離した15 mL 10Kフィルターチューブを使用して、シナプス外分画を含む上清を最終200μL容量に濃縮する。 </li><li>得られた濃縮シナプス外画分（200μL）を予冷（-20℃）アセトン5倍量（1mL）で-20℃で一晩沈殿させる。 </li><li>翌日、シナプス外画分を18,000× gおよび-15℃で30分間遠心する。遠心分離後、アセトン上清を捨て、ペレットを乾燥させてアセトンの痕跡を除去する。 </li><li>最後に、シナプス外タンパク質を含むペレットを200μLの5％SDSで再懸濁する。必要であればペレットを超音波処理する。 </li><li>それを混乱させることなく、前及びシナプス後画分を含むペレットを2mLの1×可溶化緩衝液、pH6.0で注意深く洗う。バッファを破棄します。 </li><li> Resuspendガラス製パスツールピペットを用いて、10mLの1×可溶化緩衝液（pH8.0）でペレットを洗浄する。 注：pH 8.0のTriton X-100の1％はシナプス前特殊化を可溶化しますが、不溶性のシナプス密度4を維持します。 </li><li>氷上でビーカー内で高攪拌下、懸濁液を氷上で50分間インキュベートする。 </li><li>溶液を遠心管に入れる。それらの対応するスチール支持体内およびそれらの閉じた蓋で、チューブを1x可溶化緩衝液（pH8.0）で計量して平衡化する。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを40,000× gおよび4℃で30分間遠心分離する。得られた上清はシナプス前分画に対応し、ペレットはシナプス後分画に対応する。 </li><li>ステップ2.6-2.9で説明したように、シナプス前分画を含む上清を処理する。 </li><li>シナプス後画分を含むペレットを200μLの5％SDSで再懸濁する。ペレットを超音波処理する、私はfが必要です。 </li></ol> 3.膜の分画を確認するためにイムノブロットでサンプルを分析する。 <ol><li>ビシンコニン酸タンパク質アッセイを用いて、各画分中のタンパク質の量（ すなわち、全シナプス、シナプス前およびシナプスの画分）を決定する。 </li><li>各画分から20μgのタンパク質を取り、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）サンプルバッファーで50μLの最終容量に希釈します。 100℃で5分間沸騰させる。 </li><li>還元条件下で4％濃縮ゲルを用いてSDS-PAGE電気泳動により10％のタンパク質を分離する。色素が下部ゲルに入り、電圧を120Vに上昇させるまで、80Vの定電圧で電気泳動する。 </li><li>タンパク質をPVDFメンブレンに移し、IBブロッキング溶液で45分間、室温で連続的に振盪しながらブロックする。 </li><li>示された一次抗体（ すなわち、抗SNAP-25、抗PSD-95、抗シナプトフィジン、または抗GPR37）を、IBブロッキング溶液中で希釈して、連続的に振とうする。 </li><li>結合していない一次抗体を除去するために、IB洗浄液で膜を3回（それぞれ10分間）洗浄する。 </li><li>示された二次抗体と一緒に、連続的に振とうしながら暗所で室温で90分間インキュベートする。 </li><li>結合していない二次抗体を除去するために、IB洗浄液で膜を3回（それぞれ10分間）洗浄する。 </li><li>メンブレンを化学発光基質とインキュベートする（暗条件下で、溶液Aと溶液Bの1：1の割合でメーカーが提供する）。 </li><li>化学発光検出装置で膜を分析する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+III:+The+Central+Nervous+System.">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , (1897).</li><li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The fine structure of the nervous system. , (1991).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li><li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presynaptic+particle+web:+ultrastructure,+composition,+dissolution,+and+reconstitution.">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li><li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus.">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li><li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+adenosine+A(1)+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus.">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li><li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat.">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li><li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1,+P2X2/3,+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1,+P2Y2,+and/or+P2Y4+Receptors+in+the+Rat.">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li><li>Gar&#231;&#227;o, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits:+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum.">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li><li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parkinson's+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus:+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system.">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li><li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+Report:+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li><li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart:+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications.">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li><li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain.">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li><li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization.">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li><li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37.">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li><li>Gand&#236;a, J., Fern&#225;ndez-Due&#241;as, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain.">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li><li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin.">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li><li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pael+receptor,+endoplasmic+reticulum+stress,+and+Parkinson's+disease.">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9 (2003).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

シナプス伝達はシナプスの物理的完全性に依存しており、これはフォスターとシェリントンによって1897年に早期に構想された概念である。したがって、重要な神経伝達成分（ 例えば、イオンチャネル、受容体など ）の分布を理解することは、正常状態および病理学的状態の両方におけるシナプス機能を解明するために不可欠である。電子顕微鏡（EM）は、プロトタイプの中枢神経系（CNS）シナプスの現在の超微細構造の概念に非常に貢献している。そのようなやり方で、EMは、プレ・シナプス密度とシナプス後密度との間の差異を細かく確立しており、これはかなり均一な距離（約25nm）の裂け目で分けられている。興味深いことに、シナプス後の装置は、その原形質膜の下に比較的連続した電子密度の高い肥厚、いわゆるシナプス後密度、すなわちPSD2を示す 。逆に、シナプス前の装置では、不連続細胞マトリックスネットワークは原形質膜のすぐ下に配置され、シナプス小胞の細胞膜活性ゾーン3への整列およびドッキングに必須である。したがって、EMは、構造的に保存されたCNSシナプス内のタンパク質の分布を調査するための黄金実験アプローチを構成する。しかしながら、電子顕微鏡写真によって提供される情報は静的である。事実、蓄積する証拠は、in vivoシナプスが非常に動的であることを示し、したがって、持続的なシナプス伝達に劇的な構造変化を経験する。さらに、シナプスの形態および組成は、様々なCNS領域の全体にわたって、ならびに発達、成熟、老化および神経病理学的状態の発生によって変化し得る。全体として、生理学的条件における異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離することに焦点を当てたプロトコルは、シナプス機能のより包括的な研究のための貴重なツールである。 らによって最初に記載されたこの膜分画法は、 （2001） 4は、シナプス前およびシナプス後の装置内で生じる接着相互作用を弱めるpHシフトに基づいている。第1に、pH6.0の中性洗剤を用いることにより、シナプス前および後シナプスの装置を保持し、可溶化されてシナプス接触から抽出されるシナプス外膜ドメインから維持される付着接合を識別することが可能である。続いて、中性洗剤の存在下でpHを6.0から8.0に上げると接着結合の強度が弱まり、シナプス前活性領域がシナプス密度に強く結合した状態に保たれる。したがって、シナプス前区画は、潤滑され、シナプス密度から分離することができ、これは使用される界面活性剤の濃度がその可溶化を促進しないためにほとんど保存される4 。興味深いことに、最終的に90％より高い分画効率は、異なるシナプス後マーカーによって確認することができる： i ）シナプス前活性ゾーンからのシナプトソーム関連タンパク質25（SNAP-25）; ii ）シナプス間隙画分（ すなわち、活性領域の外側およびミクロソームを含む）からのシナプトフィジン。およびiii ）シナプス密度からのシナプス後密度タンパク質95（PSD-95）。特に、この脳膜分画法はうまく使用されています。したがって、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸（AMPA）受容体5 、アデノシンA 1受容体（A 1 R） 6 （AMPA）受容体などの様々な受容体の副シナプスの局在を正確に決定することが可能であった。 、アデノシンA 2A受容体（A 2A R） 7 、アデノシン三リン酸（ATP）P2受容体8 、ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット9 、およびパーキンソン病関連受容体GPR37 10 。しかしながら、多くの制限が、特定のニューロンタンパク質のシナプス分布の適切な評価を妨げる可能性がある。したがって、この手順では、プロトコール全体を完全に記述するだけでなく、必要とされる組織の量が多量であること、タンパク質の収量が低いこと、およびタンパク質の効率を検証するための必須要件など、明確な実験を行う前にそれぞれの分離。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sucrose</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,211,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">CaCl2</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">2,112,211,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,313,961,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Protease inhibitor cocktail Set III</td>
			<td style="width:249px;">Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">535140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,236,541,209</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">SDS</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">L3771</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Glycerol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">G5516</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,311,651,604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">D0632</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tween 20</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:249px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">NaCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,216,591,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,314,941,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:249px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">4873</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,781,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Basic 20 pH</td>
			<td style="width:249px;">Crison, Alella, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:128px;">Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;">344059</td>
			<td style="width:167px;">Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td>
			<td style="width:249px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">UFC901008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Centrifuge 5430R</td>
			<td style="width:249px;">Eppendorf, Hamburgo, Germany</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sonifier 250</td>
			<td style="width:249px;">Branson, Danbury, Connecticut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:249px;">GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td style="width:160px;">612-1702</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Compact Balance EK-610</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:249px;">Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">GR 200 Precision Balance</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-GPR37</td>
			<td style="width:249px;">Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td>
			<td style="width:249px;">Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:30000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

シナプスタンパク質の組成および機能を評価することは、神経科学において重要な課題である。しかし、シナプス内で起こる神経伝達を動的タンパク質 - タンパク質相互作用およびリン酸化事象によって高度に制御されるので評価することは容易ではない。したがって、シナプス伝達を研究するためにいずれかの方法が使用される場合、主要な目標は、これらの一時的な生理学的修飾を保存することである。ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。換言すれば、プロトコールは、シナプス前、シナプス後およびシナプス外区画からタンパク質濃縮を行うための生化学的方法論を記載している。第1に、シナプトソームまたはシナプス末端は、不連続なスクロース勾配を用いてすべてのシナプスコンパートメントを含むニューロンから得られる。注目すべきは、この初期シナプス膜調製物の品質はc儀式的。続いて、異なるpH条件下で穏やかな界面活性剤を用いて軽度の可溶化を行うことにより、種々の副シナプスコンパートメントの単離が達成される。これにより、勾配遠心分離および等密度遠心分離による分離が可能になる。最後に、様々なシナプスタンパク質マーカー（ すなわち、 SNAP-25、PSD-95、およびシナプトフィジン）を用いたイムノブロット分析により、異なるシナプス後区画（ すなわち、シナプス前およびシナプス後の膜画分）任意の特定のニューロンタンパク質のシナプス分布の直接評価を可能にする。

記載された方法論は、一般に、ニューロンタンパク質の潜在的なシナプス分析、および特にシナプス受容体の単離および生化学的特徴づけのために、主に使用されてきた5,6,7,8,9。興味深いことに、ここに表示された代表的な結果は、オーファンGタンパク質共役受容体、すなわちパーキンソン病関連受容体GPR37 10のシナプス下海馬分布の解析に対する?...

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Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

10.3K ビュー.  Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat. ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。 

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

生化学

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

小さい gtp アーゼ プレニル化および分子量 GTP 結合を使用して膜分画と gtp アーゼ抗体法の検出

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

膜上消化技術を用いてのタンパク質・タンパク質相互作用の評価

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

ネイティブ自己蛍光に基づくsFLIMによる植物切片における蛍光プローブとリグニン間の相互作用の測定

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

出芽酵母サッカロミセスセレビシエにおけるサブソキアドタンパク質の局在化の評価

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...