Bu çalışma, Ekonomi ve Sürdürülebilirlik Enstitüsü (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 ve PIE14 / 00034) tarafından desteklenen Institucio Catalana de Recerca Estudis Avançats (ICREA Academia-2010) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, X.M, VF-D ve FC, &quot;Nörofarmakoloji ve Ağrı&quot; akredite araştırma grubuna (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) aittir ve FC için Innovatie kapısı Wetenschap en Technologie (SBO-140028) . Bu çalışma aynı zamanda CAPES (Brezilya )&#39;dan FC&#39;ye &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot; tarafından da desteklendi

Tüm hayvanlara ait deneysel prosedürler, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Rehber 11 ve Avrupa Topluluğunun 86/609 / EEC sayılı kanunları uyarınca, Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi (CEEA) tarafından University of Barcelona tarafından onaylanmıştır. CCE, FELASA ve ARRIVE kuralları. Böylece, fareler gıda ve suya ad libitum erişimi olan standart kafeslerde barındırılır ve kontrollü standart koşullar altında tutulur (7:30 AM, 22 ° C sıcaklık ve% 66 nemden başlayan 12 saat karanlık / hafif döngü). 1. Kesintili Bir Şeker Gradyan Kullanarak Fare Beyin Synaptosomları Alınması Not: Bu yöntem daha önce 10 bildirildi. <ol><li> Yeni izolasyon tamponu (IB), pH 7.4 hazırlayın; 2 M sukroz; 1 M sukroz / 0.1 mM CaCI2; Ve 0.1 mM CaCI2 ( tablo 1&#39;e bakınız). Çözeltileri buzda soğutun. </li><li> SaServikal dislokasyonla beş fare çocuğunu öldürürler. Her bir hayvanın beynini kesip hızla çıkarın. İlgi alanındaki beyin bölgesini (örneğin, hipokampus, 0.25-0.35 g taze doku) parçalara ayırın ve 1 mL IB ile buz üzerinde 5 mL Potter-Elvehjem cam tübüne yerleştirin. </li><li> Dokuyu ısınmayı önlemek için homojenleştirici bir karıştırıcı (dakikada 700-900 devirde 10 vuruşla), tercihen bir buz banyosu içinde dokuyu homojenize edin. </li><li> Homojenize edilmiş dokuyu (1 mL) 6 mL 2 M sukroz ve 2.5 mL 0.1 mM CaCl 2 içeren 15 mL tüp içine yerleştirin. ° C. Tüpü ters çevirerek yavaş yavaş karıştırın. Not: Kalsiyum ilavesi, organeller arasındaki yapışkan etkileşimlerin korunması ve böylece farklı &quot;yoğunlukların&quot; yapısının korunması için gereklidir. </li><li> Çözeltiyi 12 mL&#39;lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve sakroz gradyanı oluşturmak için yavaş yavaş her tüpün üstüne 2,5 mL 1 M sükroz / 0,1 mM CaCl2 ekleyin. Not: Konum etiketleme oKalıcı bir işaretleyici kullanarak santrifüj tüpündeki eğim arabirimi. </li><li> Santrifüj tüplerini IB çözeltisi ile karşılık gelen çelik destekler ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin. </li><li> Tüpleri, 100.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 3 saat boyunca santrifüjleyin. Rotoru tüm çelik desteklerle (gerekirse boş olsa) doldurun. </li><li> Miyelin içeren üst tabakayı atın. Bir Pasteur pipetiyle, synaptosome fraksiyonuna tekabül eden 1.25-M ve 1-M sakroz ara fazları arasındaki beyaz halkayı toplayın. </li><li> Bir santrifüj tüpünde IB kullanarak sinaptozomları 9X hacim ile seyreltin. </li><li> Santrifüj tüplerini IB çözeltisi ile karşılık gelen çelik destekler ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin. </li><li> Tamburları, 15.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı atın ve tekrar süspansiyon haline getirin.1.1 mL İB çözeltisi ile pellet. Bu sinaptozomal çözeltiden 100 uL toplayın ve 11,000 x g ve 4 ° C&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. </li><li> Sinaptosomal pelleti% 5 sodyum dodesil sülfat (SDS) içinde tekrar süspanse edin ve bu numuneyi -20 ºC&#39;de saklayın. Not: Bu numune daha fazla Western blot analizi için toplam synaptosome fraksiyonuna tekabül edecektir. Geriye kalan sinaptozom fraksiyonu (~ 1 mL) ya kullanılıncaya kadar -20 ºC&#39;de dondurulabilir veya daha sonraki sübsimaptik fraksiyonasyon için işlenebilir. Sinaptozomlar veya saflaştırılmış sinapslar, toplam hipokampal hacimde% 1 ila% 2&#39;yi temsil eder. </li></ol> 2. Pre-, Post- ve Ekstrasinaptik-izolasyon <ol><li> 2x taze çözündürme tamponu, pH 6.0; 1x çözündürme tamponu, pH 6.0; Çözünürlük tamponu, pH 8.0; Ve 0.1 mM CaCI2 ( tablo 1&#39;e bakınız). Çözeltileri buzda soğutun. Not: Bu solüsyonların pH değeri doğru olmalıdırİyi bir subsynaptik fraksiyonlamayı elde etmek için ayarlanır. </li><li> 1 mL&#39;lik yeniden askıya alınan sinaptosom fraksiyonunu yavaş yavaş seyreltin (adım 1.12&#39;ye bakın), 5 mL, 0.1 mM CaCl2 ile seyreltin. </li><li> Aynı hacimde (5 mL) buzda soğutulmuş 2x çözünürlük tamponu (pH 6.0) ilave edin ve buz üzerinde bir kapta yüksek çalkalama altında buz üzerinde 50 dakika inkübe edin. Not: pH 6.0&#39;da Triton X-100&#39;in% 1&#39;i tüm plazma membran proteinlerini çözünürken, sinaptik kontaklar veya kavşaklar ( örn . Pre ve postsinaptik yapılar) içindeki proteinleri korur. </li><li> Solüsyonu bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpleri, eşdeğer hacimde 0.1 mM CaCl2 ve 2x çözünürlük tamponu çözeltisi (pH 6.0) ile karşılık gelen çelik destekler içinde ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin. </li><li> Tüpleri, 40.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Nihai süpernatan, ekstrasinaptik fraksiyonu temsil eder,Ve pelet sinaptik kavşaklara ( yani pre ve postsinaptik fraksiyonlara) karşılık gelir. </li><li> Ekstrasinaptik fraksiyonu içeren süpernatanı, 4,000 xg ve 4 ° C&#39;de santrifüje tabi tutulan bir 15 mL 10K filtre tüpü kullanarak nihai 200 μL hacme konsantre edin. </li><li> Elde edilen konsantre ekstrasinaptik fraksiyonu (200 μL), 5 hacim (1 mL) önceden soğutulmuş (-20 ° C) aseton ile -20 ° C&#39;de bir gece boyunca çöktürün. </li><li> Ertesi gün, extrasinaptik fraksiyonu 18,000 x g ve -15 ° C&#39;de 30 dakika santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, aseton süpernatantını atın ve herhangi bir aseton izini kaldırmak için peleti kurutun. </li><li> Son olarak,% 5 SDS 200 mcL ile ekstrasinaptik protein içeren pelletini tekrar süspanse edin. Gerekirse peleti son haline getirin. </li><li> Bunu bozmadan, pre ve postsinaptik fraksiyonları içeren pelleti 2 mL 1x çözünürlük tamponu, pH 6.0 ile dikkatlice yıkayın. Tamponu atın. </li><li> süspanse edinPellet, bir cam Pasteur pipet kullanılarak 10 mL 1x çözünürlük tamponu, pH 8.0 ile karıştırılır. Not: pH 8.0&#39;da Triton X-100&#39;in% 1&#39;i presinaptik uzmanlaşmayı çözünürken, çözünmeyen postsinaptik yoğunluğu 4 korur. </li><li> Süspansiyonu buz üzerinde bir kabın içindeki yüksek çalkalamayla 50 dakika inkübe edin. </li><li> Solüsyonu bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpleri, karşılık gelen çelik destekler içine ve kapatma kapaklarına 1x çözünürlük tamponu çözeltisi, pH 8.0 ile tartın ve dengeye getirin. </li><li> Tüpleri, 40.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin; Elde edilen süpernatant presinaptik fraksiyona ve pelletin postsinaptik fraksiyona karşılık gelir. </li><li> Adımlar 2.6-2.9&#39;da tarif edildiği gibi, presinaptik fraksiyonu içeren süpernatanın işlemden geçirilmesi. </li><li> 200 μL% 5 SDS ile postsinaptik fraksiyon içeren pelleti tekrar süspanse edin. Peleti sonlandır, iF gerekli. </li></ol> 3. Membran fraksiyonlamasını doğrulamak için numuneleri immunoblot ile analiz edin <ol><li> Her bir fraksiyondaki protein miktarını ( yani toplam, ekstra, ön, ve son sinaptik fraksiyonlar), biyinkoninik asit protein testini kullanarak belirleyin. </li><li> Her bir fraksiyondan 20 μg protein alın ve SDS-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) numune tamponu içerisinde 50 μL&#39;lik nihai bir hacme kadar seyreltin. 100 ºC&#39;de 5 dakika kaynatın. </li><li> Proteinleri SDS-PAGE elektroforezi% 10 ile, indirgeyici koşullar altında% 4 konsantre jel ile ayırın. Elektrofor, 80 V&#39;luk sabit gerilimle boyanın alt jöse girene kadar voltajını 120 V&#39;a çıkarın. </li><li> Proteinleri bir PVDF zarına aktarın ve sürekli dalgalanma altında oda sıcaklığında 45 dakika için IB engelleme çözeltisiyle bloke edin. </li><li> Memeyi, belirtilen primer antikor ile gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin ( örn. Anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-sinaptofizin veya anti-GPR37) ile seyreltildi. </li><li> Bağlanmamış birincil antikoru ortadan kaldırmak için membran yıkama çözeltisi ile üç kez (her biri 10 dakika) yıkanır. </li><li> Karışık koşullar altında oda sıcaklığında sürekli çalkalama altında belirtilen ikincil antikor ile inkübe edin. </li><li> Bağlanmamış sekonder antikor ortadan kaldırmak için membran yıkama çözeltisi ile üç kez (her biri 10 dakika) yıkanır. </li><li> Membranı kimyasal parlak substratla inkübe edin (karanlık koşullar altında ve üretici tarafından sağlanan A ve B oranının 1: 1&#39;ini takiben karışımı hazırlayın). </li><li> Membranı bir kemilüminesan algılama cihazında analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+III:+The+Central+Nervous+System.">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , (1897).</li><li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The fine structure of the nervous system. , (1991).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li><li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presynaptic+particle+web:+ultrastructure,+composition,+dissolution,+and+reconstitution.">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li><li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus.">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li><li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+adenosine+A(1)+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus.">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li><li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat.">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li><li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1,+P2X2/3,+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1,+P2Y2,+and/or+P2Y4+Receptors+in+the+Rat.">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li><li>Gar&#231;&#227;o, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits:+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum.">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li><li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parkinson's+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus:+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system.">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li><li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+Report:+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li><li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart:+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications.">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li><li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain.">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li><li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization.">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li><li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37.">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li><li>Gand&#236;a, J., Fern&#225;ndez-Due&#241;as, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain.">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li><li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin.">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li><li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pael+receptor,+endoplasmic+reticulum+stress,+and+Parkinson's+disease.">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9 (2003).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

Sinaptik yayın, sinapsın fiziksel bütünlüğüne, Foster ve Sherrington&#39;ın 1897&#39;de erken öngördüğü bir kavrama dayanır. Bu nedenle, hem normal hem de patolojik koşullardaki sinaptik fonksiyonu aydınlatmak için temel sinir iletim bileşenlerini ( örn. Iyon kanalı, reseptör vb. ) Dağılımını anlamak önemlidir. Elektron mikroskobu (EM), prototipik merkezi sinir sistemi (CNS) sinapslarının mevcut ultrastrüktürel görüşüne muazzam katkılarda bulunmuştur. Öyle ki, EM, oldukça düzgün bir mesafeden (~ 25 nm) 2 bir yarık ile ayrılan pre-ve postsinaptik yoğunluklar arasındaki farkları ince bir şekilde belirledi. İlginç olarak, postsinaptik aparat, plazma membranının altında, postsinaptik yoğunluk veya PSD 2 olarak adlandırılan nispeten sürekli, elektron-yoğun bir kalınlaşma sergilemektedir. Tersine, presinaptik cihazda,E süreksiz sitomatrix ağı, sinaptik veziküllerin plazma membran aktif bölgesine 3 hizalanması ve docklanması için gerekli plazma membranının hemen altında düzenlenmiştir. Bu nedenle, EM, yapısal olarak korunmuş SSS sinapsları içindeki protein dağılımını araştırmak için altın deneysel yaklaşımı oluşturmaktadır. Bununla birlikte, elektron mikrografları tarafından sağlanan bilgiler statiktir. Gerçekten de, biriken kanıtlar in vivo sinapsların son derece dinamik olduğunu ve böylece sürekli sinaptik bulaşmada dramatik yapısal değişikliklerin yaşandığını göstermektedir. Buna ek olarak, sinapsların morfolojisi ve bileşimi, farklı CNS bölgelerinde ve gelişim, olgunlaşma, yaşlanma ve nöropatolojik koşulların gelişimi üzerine değişebilir. Genel olarak, fizyolojik koşullarda farklı sinaptik bölmelere ait proteinlerin izole edilmesine odaklanan bir protokol, sinaptik işleyişin daha kapsamlı bir çalışması için değerli bir araçtır. <p cLass = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada, farklı sinaptik membran bölmelerinin, yani ekstra, ön ve postsinaptik zar alanlarının hazırlayıcı biyokimyasal zenginleşmesine izin veren, bu tür tamamlayıcı deneysel yaklaşımı açıklıyoruz. Bu membran fraksiyonasyon yöntemi, önce Philips ve ark . (2001) 4 , pre ve postsinaptik aparat içinde oluşan yapışkan etkileşimleri zayıflatan bir pH kaymasına dayalıdır. İlk olarak, pH 6.0&#39;da hafif deterjanlar kullanarak, pre ve postsinaptik aparatı tutan ve çözünürleştirilen ve böylelikle sinaptik kontaklardan ekstraksiyona tabi tutulabilen ekstrasinaptik membran alanından muhafaza edilen adherens kavşağını ayırt etmek mümkündür. Daha sonra, yumuşak deterjanlar varlığında pH&#39;ı 6.0&#39;dan 8.0&#39;a yükseltmek, presynaptik aktif bölgeyi postsinaptik yoğunluğa sıkıca bağlayan adherens bileşkesinin mukavemetini zayıflatır. Bu nedenle, presinaptik bölme öyleYağlanmış ve çoğunlukla korunan postsinaptik yoğunluktan ayrılabilir, çünkü kullanılan deterjan konsantrasyonu çözünürlüğünü arttırmaz 4 . İlginç bir şekilde, fraksiyonasyon etkinliği, sonunda% 90&#39;dan daha yüksek olarak, farklı alt sinaptik belirteçler tarafından teyit edilebilir: i ) presinaptik aktif bölgeden sinaptozomal bağlantılı protein 25 (SNAP-25); Ii ) synaptophysin, extrasinaptik fraksiyondan ( yani, aktif bölge dışındadır ve mikrozomlar dahil); Ve iii ) postsinaptik yoğunluğa göre postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD-95). Özellikle, bu beyin zar fraksiyonasyon yöntemi başarıyla kullanılmıştır. Buna göre, alfa-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolpropionik asit (AMPA) reseptörleri 5 , adenosin A 1 reseptörü (A 1 R) 6 gibi farklı reseptörlerin alt sinaptik lokalizasyonunu kesin olarak saptamak mümkün olmuştur ,Adenosin A 2A reseptörü (A 2A R) 7 , adenosin trifosfat (ATP) P2 reseptörleri 8 , nikotinik asetilkolin reseptör altbirimleri 9 ve Parkinson hastalığına bağlı reseptör GPR37 10&#39;dur . Bununla birlikte, birtakım sınırlamalar, belirli bir nöronal proteinin sinaptik dağılımının doğru bir şekilde değerlendirilmesini engelleyebilir. Dolayısıyla, bu prosedürde, tüm protokolü tam olarak tanımlamakla kalmamakla birlikte, oldukça fazla miktarda doku, düşük protein verimliliği ve verimliliğin doğrulanması için zorunlu gereksinim gibi dikkate alınması gereken bazı kritik noktaları vurguluyoruz Kesin ayrımı yapmadan önce her ayrım.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sucrose</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,211,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">CaCl2</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">2,112,211,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,313,961,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Protease inhibitor cocktail Set III</td>
			<td style="width:249px;">Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">535140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,236,541,209</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">SDS</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">L3771</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Glycerol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">G5516</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,311,651,604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">D0632</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tween 20</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:249px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">NaCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,216,591,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,314,941,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:249px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">4873</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,781,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Basic 20 pH</td>
			<td style="width:249px;">Crison, Alella, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:128px;">Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;">344059</td>
			<td style="width:167px;">Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td>
			<td style="width:249px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">UFC901008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Centrifuge 5430R</td>
			<td style="width:249px;">Eppendorf, Hamburgo, Germany</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sonifier 250</td>
			<td style="width:249px;">Branson, Danbury, Connecticut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:249px;">GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td style="width:160px;">612-1702</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Compact Balance EK-610</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:249px;">Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">GR 200 Precision Balance</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-GPR37</td>
			<td style="width:249px;">Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td>
			<td style="width:249px;">Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:30000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

Sinaptik protein kompozisyonunun ve fonksiyonunun değerlendirilmesi sinirbiliminde önemli bir zorluk oluşturmaktadır. Bununla birlikte, sinapslarda oluşan sinir iletimini değerlendirmek kolay değildir çünkü dinamik protein-protein etkileşimleri ve fosforilasyon olayları tarafından yüksek derecede düzenlenir. Buna göre, sinaptik bulaşmayı incelemek için herhangi bir yöntem kullanıldığında, bu geçici fizyolojik değişiklikleri korumak temel hedeftir. Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz. Başka bir deyişle, protokol, presinaptik, postsinaptik ve extrasinaptik bölmelerden protein zenginleştirmesini gerçekleştirmek için bir biyokimyasal metodoloji açıklamaktadır. Birincisi, sinaptozomlar veya sinaptik terminaller, kesintili bir sükroz gradyeni aracılığıyla tüm sinaptik bölmeleri içeren sinir hücrelerinden elde edilir. Not, bu başlangıç ​​sinaptik zar hazırlığının kalitesi critical. Ardından farklı subynaptik bölmelerin izolasyonu, diferansiyel pH koşullarında hafif deterjanlar kullanılarak hafif çözünürlükle elde edilir. Bu gradyan ve izopiklik santrifüjlerle ayrılmaya izin verir. Son olarak, farklı subjunaptik bölmelerdeki protein zenginleştirmesi ( yani, öncesi, sonrası ve ekstrasinaptik membran fraksiyonları), iyi karakterize edilmiş sinaptik protein işaretleyicileri ( örn., SNAP-25, PSD-95 ve sinaptofizin) kullanılarak imünoblot analizi ile doğrulanır Sırasıyla), böylece belirli bir nöronal proteininin sinaptik dağılımının doğrudan değerlendirilmesini sağlar.

Tanımlanan metodoloji genel olarak sinirsel proteinlerin alt sinaptik analizi için ve özellikle sinaptik reseptörlerin 5 , 6 , 7 , 8 , 9 izolasyonu ve biyokimyasal olarak karakterize edilmesi için büyük ölçüde kullanılmaktadır. İlginçtir, burada gösterilen temsili sonuç, yetim bir G proteinine bağlı reseptör...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization at JoVE.com

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

10.3K Görüntüleme.  Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat.  Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz. 

Video: Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biyokimya

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...