Questa ricerca è stata sostenuta dal Brigham &amp; Women&#39;s Hospital e dalla Marcia di Dimes. Gli autori vorrebbero ringraziare tutti i membri del Lab Whited per il loro supporto e consulenza.

Tutta la sperimentazione dell&#39;assolotl è stata eseguita in accordo con il comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali di Brigham e dell&#39;ospedale femminile (BWH). 1. Impostare Esperimento di Perfusion <ol><li> Posizionare un axolotl adulto in un contenitore di plastica riempito con soluzione 0,1% di tricina (MS222) per 15-20 min o fino a quando completamente anestetizzato. Assicurarsi che il contenitore sia riempito con sufficiente soluzione di triciclici in modo che l&#39;axolotl sia completamente sommerso. Nota: Tutte le procedure devono essere eseguite in conformità alle istruzioni istituzionali per la cura degli animali. A BWH, un axolotl è considerato completamente anestetizzato quando non riesce a provare un pizzicotto, il che significa che non c&#39;è movimento riflessivo quando il piede viene spremuto dolcemente. Attenzione: Anche se la tricina è un anestetico specificamente utilizzato per gli organismi acquatici, è necessario evitare il contatto diretto della pelle con la soluzione tricina. </li><li> Impostare la stazione di perfusione axolotl. <ol><li> Posiziona ilRilievo assorbente su una superficie piana e livellata con il lato assorbente rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Tagliare un foro nel telaio in polistirolo espanso che è la dimensione e la forma appropriati per l&#39;assolotolo anestetizzato per giacere in posizione supina. Posizionare il telaio sul tampone assorbente. Nota: alcuni tovaglioli di carta supplementari possono essere posizionati immediatamente sotto il telaio per ulteriori assorbimenti. </li><li> Caricare la pompa peristaltica con il tubo di perfusione. Impostare la pompa ad una portata di 0,7 ml / min, che scorre in senso orario. </li><li> Preparare la soluzione diluita con 0,7x PBS e 5% di glucosio in una miscela 1: 4. </li><li> Mescolare 10 ml di soluzione diluente con 200 μL della soluzione di base DiI in un tubo conico da 50 ml. Coprire e mescolare per inversione. Coprire questo tubo con carta in alluminio per proteggere la soluzione di lavoro dall&#39;esposizione alla luce. Nota: i volumi dovrebbero essere modificati in base alla dimensione dell&#39;assolotl proporzionalmente. Questi valori sono per un axolotl di circa 15 cm (lunghezza da coda a coda). UNI nomi di questa dimensione non possono avere raggiunto la piena maturità sessuale, quindi il sesso animale non può essere determinato in questo momento. </li><li> Riempire un tubo conico da 50 ml con 0,7x PBS. Nota: PBS verrà utilizzato per l&#39;innesco del ciclo e dell&#39;exolinguizzazione dell&#39;assolotl. </li><li> Fissare l&#39;ago a farfalla a 27 gauge all&#39;estremità di uscita del tubo di perfusione. Piegare le ali delle farfalle su un altro e collocare nel supporto del morsetto. </li><li> Posizionare l&#39;estremità libera del tubo di perfusione nel tubo conico da 50 ml riempito di 0,7x PBS e eseguire la pompa di perfusione fino a quando l&#39;intero tubo è riempito di soluzione. Sospendi la pompa una volta che l&#39;intero tubo è riempito con PBS. Nota: assicurarsi che il tubo sia privo di bolle d&#39;aria in qualsiasi momento, in quanto ciò provocherà l&#39;embolia nell&#39;assolotl e impedisce la perfusione completa. </li><li> Mettere un tovagliolo di carta nello stampo a forma di axolotl nel telaio in polistirolo espanso. Usando una pipetta di trasferimento, immergere l&#39;asciugamano con la soluzione di tricaine. Nota: Tagliare un piccolo quadrato in mezzo alla trama della cartaEl per consentire il drenaggio dei fluidi durante la procedura di perfusione. </li><li> Posizionare l&#39;axolotl anestetizzato supino sul tovagliolo di carta all&#39;interno del telaio in polistirene espanso. </li></ol></li></ol> 2. Apertura della cassa dell&#39;Asolotl <ol><li> Utilizzare pinze chirurgiche per pizzicare la pelle lungo l&#39;asse centrale del petto dell&#39;assolotl, appena sotto la linea delle spalle. Tirare in su. </li><li> Usa un bisturi per fare una piccola incisione dove la pelle è stata tirata. </li><li> Rimuovere una patch quadrata di pelle sopra il torace per rivelare due piastre di cartilagine. <ol><li> Rimuovi la pelle per aprire una finestra sulla cavità toracica abbastanza grande da vedere chiaramente il cuore e circa 5 mm dell&#39;aletta che si ramifica dal cuore. </li></ol></li><li> Attentamente strappare il tessuto connettivo con pinze o forbici chiuse per evitare di tagliare i vasi sanguigni più importanti. </li><li> Sollevare ciascuna piastra di cartilagine singolarmente usando le pinze e scambiandoleCon le forbici chirurgiche. </li><li> Stringere con cautela il pericardio con le pinze, sollevare e forzarlo con le forbici chirurgiche; Questa incisione dovrebbe essere abbastanza profonda da percuotere il pericardio molto sottile e dovrebbe essere abbastanza grande da permettere la rimozione del pericardio. Fare attenzione a non tagliare il cuore. </li><li> Rimuovere delicatamente il pericardio per esporre il cuore e l&#39;aorta. Nota: Usando una pipetta di trasferimento, periodicamente sciacquare la cavità toracica e le gole con la soluzione tricaine per mantenere l&#39;area chiara e mantenere l&#39;axolotl anestetizzato. </li></ol> 3. Perfusione dell&#39;Asolotl <ol><li> Posizionare lo staffa con l&#39;ago a farfalla caricato accanto al telaio in polistirolo espanso, in modo tale che il braccio del morsetto possa essere facilmente manipolato per inserire l&#39;ago nell&#39;aletto axolotl. Puntare la punta dell&#39;ago verso l&#39;aspetto rostralo dell&#39;animale durante l&#39;inserimento e mantenere l&#39;ago parallelo all&#39;aorta per evitare di perforarla attraverso l&#39;opLato positiva. </li><li> Accendere la pompa peristaltica. 0.7x PBS dovrebbe continuare a fluire attraverso il tubo. </li><li> Inserire l&#39;ago nell&#39;aletta. <ol><li> Far scivolare la pinza sotto l&#39;arco aortico e sollevare leggermente per consentire un facile accesso. </li><li> Manovrare la combinazione di aghi-ago in modo tale che l&#39;ago corre lungo la lunghezza dell&#39;arto, rivolto verso la testa. Inserire l&#39;ago durante l&#39;uso della pinza per il supporto dietro l&#39;aorta. Nota: L&#39;ago deve essere inserito abbastanza profondamente nell&#39;aorta per assicurarsi che non scivoli durante la perfusione. Questo può essere di circa 5 mm per un axolotl da 15 cm. Assicurarsi che l&#39;ago sia perfettamente in linea con l&#39;aorta per evitare la completa foratura del vaso. Le puncture attraverso-e-through possono causare emorragie massicce e diminuire i tassi di successo della perfusione. L&#39;inserimento riuscito può essere confermato dall&#39;allargamento visibile dell&#39;atria del cuore. </li></ol></li><li> Rapidamente lacerate un atrio con la sciSsors e consentire il sangue di scarico. <ol><li> Sciacquare con la soluzione tricaina per prevenire l&#39;accumulo di sangue e la formazione di coaguli nella cavità toracica. </li></ol></li><li> Perfuse l&#39;axolotl con circa 20-30 mL di PBS. L&#39;animale dovrebbe cambiare da rosa chiaro in colore a bianco in una perfusione di successo. </li><li> Sospendi la pompa peristaltica e sposta l&#39;estremità libera del tubo nel tubo da 15 ml di soluzione DiI. Riavviare la pompa, fai attenzione a non creare delle bolle d&#39;aria nel tubo. </li><li> Perfuse l&#39;axolotl con l&#39;intero stock di DiI. Nota: in una perfetta perfusione, l&#39;axolotl con colore cambiato al rosa brillante della DiI. Questo sarà più evidente nelle cavità. </li><li> Sospendi la pompa dopo la perfusione con DiI è completa e metta l&#39;estremità libera del tubo in soluzione 4% di paraformaldeide (PFA) per fissare il tessuto. Riavviare la pompa e perfezionare almeno 10 mL di PFA. Attenzione: il PFA è tossico e deve essere manipolato e dispoSed di appropriato. Guanti e occhiali di protezione devono essere indossati e soluzioni devono essere fatte all&#39;interno di un cappuccio. La perfusione dell&#39;assolotl con PFA per fissare i tessuti provoca la morte dell&#39;animale. </li></ol> 4. Terminare la preparazione della perfusione e della visualizzazione <ol><li> Arrestare la pompa peristaltica e rimuovere l&#39;ago dall&#39;alettone axolotl. </li><li> Posizionare l&#39;axolotl su una piastra di plastica. Nota: Utilizzando una metà di un grande piatto di Petri funziona bene e permette di versare una piccola quantità di Tricaine o PBS sull&#39;assolotl per mantenere la pelle bagnata e migliorare la qualità della visualizzazione. </li><li> Smaltire tutti i materiali utilizzati nei contenitori idonei. Pulire gli attrezzi chirurgici con il 70% di etanolo, disinfettare con uno sterilizzatore di vetro tra gli animali e sterilizzare mediante autoclave seguendo la procedura. Infilare il tubo con la soluzione PBS e quindi scolare, asciugare completamente e conservare per ulteriori impieghi. </li></ol> 5. Visualizzare l&#39;Axolotl Perfuso <ol&gt; <li> Posizionare l&#39;axolotl sotto un microscopio confocale fluorescente. </li><li> Spegni le luci come la visualizzazione delle navi trattate con DiI è ostacolata dalla luce. </li><li> Utilizzare un cubo di filtro per emissione di fluorescenza verde ( ad es. ET-CY3) con il microscopio confocale per visualizzare la vascolarizzazione dell&#39;assolotl. Utilizzare la luce di eccitazione della lunghezza d&#39;onda 545 nm. Nota: Per ottenere un&#39;immagine di alta qualità, è possibile utilizzare i seguenti parametri: esposizione per 1,1 s, guadagno di 1x, saturazione di 1,0, ingrandimento di 2X. </li></ol>

<ol>
	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

La visualizzazione della vasculatura dell&#39;assolotl può essere ottenuta con perfezionamento con il colorante lipocilico di carbocyanina, DiI. In questo studio descriviamo un nuovo protocollo per la perfusione dell&#39;assolotl con DiI usando una pompa peristaltica. Mostriamo anche la successiva visualizzazione della vasculatura axolotl utilizzando un microscopio confocale fluorescente. Questo protocollo è stato un adattamento del protocollo di perfusione di roditore DiI visto in Li et al. <sup class="xref"...

La visualizzazione della vascolarizzazione svolge un ruolo fondamentale nella comprensione della struttura e della funzione degli organismi in molte specie. A partire dal XVI secolo con Leonardo da Vinci sono stati studiati modelli e rappresentazioni grafiche della circolazione 1 . Utilizzando cere e stampi di gomma, i tessuti sono stati perfusi per creare modelli tridimensionali della vasculatura, che hanno permesso lo studio dell&#39;organogenesis e della patogenesi 1 , 2 . Le resine e le cere sono state colorate con coloranti come India Ink o rosso carminio per consentire la loro facile visualizzazione 1 , 2 . Tuttavia, queste tecniche hanno causato molti problemi perché le loro elevate viscosità impediscono la perfusione completa del tessuto di interesse 1 . Poiché il campo è diventato più sofisticato, l&#39;uso di microscopi confocali ed elettronici è entrato in gioco, spostando la tecnica di perfusione<html> Lontano dagli stampi e verso perfusioni liquide della vasculatura, alcune delle quali permettevano la perfusione e l&#39;imaging dei vasi sanguigni senza distruggere il tessuto iniziale 3 . DiI, un colorante fluorescente di carbocyanina, è una tale macchia che permette la perfusione di animali senza danneggiare il tessuto vascolare. I coloranti di carbocianina sono coloranti lipofili che incorporano nelle membrane cellulari al contatto. Questi coloranti permettono la colorazione facile e istantanea di cellule endoteliali vascolari, che possono essere visualizzate sotto un microscopio confocale fluorescente. DiI si muove attraverso la diffusione laterale nella membrana lipidica delle cellule, come mostrato nell&#39;etichettatura e nella traccia dei neuroni 4 . Chemically, le due catene alchiliche di Di conferiscono al colorante la sua elevata affinità per le membrane cellulari, mentre due anelli coniugati da un fluorochrome che è responsabile di emettere una lunghezza d&#39;onda rossa quando eccitato dai filtri di luce fluorescenti verdi&gt; 4. DiI è stato utilizzato in molte capacità, tra cui l&#39;etichettatura di successo della membrana plasmatica e l&#39;etichettatura anterograda e retrograda nei neuroni 5 , 6 . DiI è stato precedentemente utilizzato nei protocolli di perfusione mentre visualizza la vasculatura dei topi 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sono salamandri che vivono esclusivamente in laghetti salmastre vicino a Città del Messico, in Messico. Questi animali sono diventati un importante modello per comprendere processi rigenerativi in ​​quanto possono regenerare gli arti completi, la coda (compreso il cavo nervo), le parti del cuore e altri organi interni e le parti dell&#39;occhio come adulti 8 , 9 . Inoltre, con la recente applicazione di strumenti genetici in axolotls, è ora possibile conoscere senza precedenti le molecole e le cellule che guidano questi processi 8 . Il regene di successoLa razione di un arto intero richiede un ampio processo di rivascolarizzazione, che può svolgere un ruolo significativo nella rigenerazione oltre le semplici funzioni dei vasi sanguigni nel fornire ossigeno e sostanze nutritive. La comprensione della rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione dei tessuti è indispensabile. I vasi sanguigni Axolotl sono stati precedentemente visualizzati usando l&#39;India Ink e, mentre i risultati erano intriganti, questo processo non è stato rivisto nei decenni successivi 10 . Abbiamo cercato di adattare un protocollo di perfezionamento DiI sviluppato per essere utilizzato nei mammiferi per consentire una completa perfusione e visualizzazione della vasculatura axolotl 7 . Questo protocollo descrive le fasi adottate per perfezionare e successivamente visualizzare la circolazione dell&#39;assolotlina con una tecnica di colorazione DiI. Questa procedura consentirà una visualizzazione precisa dei vasi sanguigni di brevetto nei tessuti omeostatici, nonché nel rigenerare i tessuti e fornisce un nuovo metodo di visualizatioN e l&#39;analisi del processo di rivascolarizzazione nell&#39;assolotl.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1583">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:405px;">Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Marshall Scientific&#160;</td>
			<td style="width:152px;">RD-RP1</td>
			<td style="width:831px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Perfusion tubing</td>
			<td style="width:195px;">Excelon Lab &#38; Vacuum Tubing</td>
			<td>436901705</td>
			<td>size S1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">27g butterfly needle</td>
			<td style="width:195px;">EXELint Medical Products</td>
			<td>26709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">KCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7747-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Distilled water</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFischer</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ethanol (100% vol/vol)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical foreceps&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDG0748741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Polystyrene foam frame</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&#160; cut out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>DYND04025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Scalpel&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDS15210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Absorbent underpad</td>
			<td style="width:195px;">Avacare Medical</td>
			<td>PKUFSx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paper towels</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Standard disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:195px;">Fisherbrand</td>
			<td>50216954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Clamp stand</td>
			<td style="width:195px;">Adafruit</td>
			<td style="width:152px;">291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Tricaine powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Adult axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">MgSO4</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">CaCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Plastic tanks</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Varying size appropriate for the axolotl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Leica Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">ET-CY3 Fluorescent Filter</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

Le tecniche di perfusione sono state utilizzate da secoli per visualizzare la circolazione dei tessuti. Axolotl (Ambystoma mexicanum) è una specie di salamandra che è emersa come un modello essenziale per gli studi di rigenerazione. Poco si sa circa come si verifica la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione in questi animali. Qui riportiamo un metodo semplice per la visualizzazione della vasculatura in axolotl attraverso la perfusione di 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindocarbocyanin perchlorato (DiI). DiI è un colorante lipocilico di carbocyanina che inserisce istantaneamente nella membrana plasmatica delle cellule endoteliali. La perfusione avviene usando una pompa peristaltica in modo che DiI entri nella circolazione attraverso l&#39;aorta. Durante la perfusione, il colorante scorre attraverso i vasi sanguigni dell&#39;assolotl e si incorpora nel bilayer lipidico delle cellule endoteliali vascolari al contatto. La procedura di perfusione dura circa un&#39;ora per un axolotl da otto pollici. Immediatamente dopo la perfusione wiTh DiI, l&#39;axolotl può essere visualizzata con un microscopio fluocentrico confocale. Il DiI emette luce nella gamma rossa-arancione quando viene eccitato con un filtro fluorescente verde. Questa procedura di perfusione DiI può essere usata per visualizzare la struttura vascolare degli assoloti o per dimostrare modelli di rivascolarizzazione nei tessuti rigeneranti.

<html> Con la colorazione DiI, la vasculatura dell&#39;assolotl può essere facilmente visualizzata. I vasi sanguigni di animali perfusi con il colorante lipofile sono immediatamente visibili sotto un microscopio confocale fluorescente. La Figura 1 .1-1.5 è una rappresentazione schematica del protocollo di perfusione. Dopo la perfusione con il colorante rosa brillante, un axolotl perfuso perfettamente apparirà rosa. Usando un filtro fluores...

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DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Utilizzando una tecnica di colorazione perplata di Di-tetraetilindocarbocyanina perchlorato (DiI) lipofilica, l&#39; Ambystoma mexicanum può essere sottoposta a perfusione vascolare per consentire una facile visualizzazione della vasculatura.

DiI Perfusion come metodo per la visualizzazione vascolare in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

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DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.9K Views.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  Utilizzando una tecnica di colorazione perplata di Di-tetraetilindocarbocyanina perchlorato (DiI) lipofilica, l' Ambystoma mexicanum può essere sottoposta a perfusione vascolare per consentire una facile visualizzazione della vasculatura. 

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

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Biologia

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

L&#39;uso di Rotorod come un metodo per l&#39;analisi qualitativa del Camminare in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualizzazione di Caenorhabditis Elegans Strutture cuticola Utilizzando il Dye lipofili Vital, Dii

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Un metodo semplice per l&#39;imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging in idrogel tridimensionali

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Cryo-sezioni della retina, intero-monta e ipotonico Vasculature isolato preparazioni per la visualizzazione di Immunohistochemical dei Pericytes microvascolare