Esta investigación fue apoyada por el Brigham &amp; Women&#39;s Hospital y la March of Dimes. Los autores desean agradecer a todos los miembros del Whited Lab por su apoyo y asesoramiento.

Todos axolotl experimentación se realizó de acuerdo con Brigham y Women&#39;s Hospital (BWH) Institucional Cuidado de Animales y el Comité de Uso. 1. Configure Experimento de Perfusión <ol><li> Coloque un axolotl adulto en un recipiente de plástico lleno de solución de tricaína al 0,1% (MS222) durante 15-20 min o hasta anestesiar completamente. Asegúrese de que el recipiente esté lleno de suficiente solución de tricaína de modo que el axolotl esté completamente sumergido. Nota: Todos los procedimientos deben realizarse de acuerdo con las pautas institucionales de cuidado de los animales. En BWH, un axolotl se considera anestesiado completamente cuando falla una prueba de la pinzadura del pie, significando allí no es movimiento reflexivo cuando el pie es apretado suavemente. Precaución: Aunque tricaine es un anestésico específicamente utilizado para organismos acuáticos, se debe evitar el contacto directo de la piel con la solución de tricaína. </li><li> Establecer la estación de perfusión axolotl. <ol><li> Colocar elAbsorbente sobre una superficie plana y nivelada con el lado absorbente hacia arriba. </li><li> Cortar un agujero en el marco de espuma de poliestireno que es el tamaño y la forma adecuada para el axolotl anestesiado para establecer en posición supina. Coloque el marco sobre la almohadilla absorbente. Nota: Algunas toallas de papel adicionales se pueden colocar inmediatamente debajo del marco para una absorción adicional. </li><li> Cargue la bomba peristáltica con el tubo de perfusión. Ajuste la bomba a un caudal de 0,7 ml / min, fluyendo en el sentido de las agujas del reloj. </li><li> Hacer la solución diluida con 0,7x PBS y 5% de glucosa en una mezcla 1: 4. </li><li> Mezclar 10 ml de solución diluyente con 200 μl de la solución madre DiI en un tubo cónico de 50 ml. Tape y mezcle por inversión. Cubra este tubo con papel de aluminio para proteger la solución de trabajo de la exposición a la luz. Nota: Los volúmenes deben cambiarse proporcionalmente según el tamaño del axolotl. Estos valores son para un axolotl de aproximadamente 15 cm (longitud de hocico a cola). UNLos nimales de este tamaño pueden no haber alcanzado la madurez sexual completa, por lo que el sexo animal no se puede determinar en este momento. </li><li> Llenar un tubo cónico de 50 ml con PBS 0,7x. Nota: Se utilizará PBS para cebar el lazo y la exsanguinación axolotl. </li><li> Conecte la aguja de mariposa de calibre 27 al extremo de salida de la tubería de perfusión. Doble las alas de la mariposa sobre el otro y coloque en el soporte de la abrazadera. </li><li> Coloque el extremo libre de la tubería de perfusión en el tubo cónico de 50 ml lleno de PBS 0,7x y haga funcionar la bomba de perfusión hasta que se llene toda la tubería con solución. Detenga la bomba una vez que el tubo completo esté lleno de PBS. Nota: Asegúrese de que el tubo esté libre de burbujas de aire en todo momento, ya que causarán embolias aéreas en el axolotl y evitarán la perfusión completa. </li><li> Coloque una toalla de papel en el molde en forma de axolotl en el marco de espuma de poliestireno. Utilizando una pipeta de transferencia, remoje la toalla con solución de tricaína. Nota: Cortar un pequeño cuadrado en el medio del remolque de papelEl para permitir el drenaje de fluidos durante el procedimiento de perfusión. </li><li> Coloque el axolotl supinado anestesiado sobre la toalla de papel dentro del marco de espuma de poliestireno. </li></ol></li></ol> 2. Apertura del tórax Axolotl <ol><li> Utilice una pinza quirúrgica para pellizcar la piel a lo largo del eje central del tórax del axolotl, justo debajo de la línea de los hombros. Levantar. </li><li> Utilice un bisturí para hacer una pequeña incisión donde se ha retirado la piel. </li><li> Quitar un parche cuadrado de piel sobre el pecho para revelar dos placas de cartílago. <ol><li> Quitar la piel para abrir una ventana sobre la cavidad torácica lo suficientemente grande como para ver claramente el corazón y aproximadamente 5 mm de la aorta se ramifica fuera del corazón. </li></ol></li><li> Cuidadosamente romper el tejido conectivo con fórceps o las tijeras cerradas con el fin de evitar el corte de los vasos sanguíneos principales. </li><li> Levante cada placa de cartílago individualmente usando la pinza y sáquelaCon las tijeras quirúrgicas. </li><li> Cuidadosamente pellizque el pericardio con la pinza, tire hacia arriba y pinche con las tijeras quirúrgicas; Esta incisión debe ser lo suficientemente profunda como para perforar el pericardio muy delgado y debe ser lo suficientemente grande para permitir la eliminación del pericardio. Tenga cuidado de no cortar el corazón. </li><li> Delicadamente quitar el pericardio para exponer el corazón y la aorta. Nota: Utilizando una pipeta de transferencia, enjuague periódicamente la cavidad torácica y las branquias con solución de tricaína para mantener la zona libre y mantener el axolotl anestesiado. </li></ol> 3. Perfusión del Axolotl <ol><li> Coloque el soporte de la abrazadera con la aguja de mariposa cargada junto al bastidor de espuma de poliestireno, de manera que el brazo de la abrazadera pueda manipularse fácilmente para insertar la aguja en la aorta axolotl. Apunte la punta de la aguja hacia el aspecto rostral del animal durante la inserción y mantenga la aguja paralela a la aorta para evitar perforarla a través de la operaciónLado positivo </li><li> Encienda la bomba peristáltica. 0.7x PBS debe continuar fluyendo a través de la tubería. </li><li> Inserte la aguja en la aorta. <ol><li> Deslice la pinza bajo el arco aórtico y levántela ligeramente para permitir un fácil acceso. </li><li> Maniobrar la combinación de aguja-abrazadera de modo que la aguja se extienda a lo largo de la aorta, apuntando hacia la cabeza. Inserte la aguja mientras usa el fórceps para apoyo detrás de la aorta. Nota: La aguja debe insertarse lo suficientemente profundo en la aorta para asegurar que no se resbale durante la perfusión. Esto puede ser de aproximadamente 5 mm para un axolotl de 15 cm. Asegúrese de que la aguja esté perfectamente alineada con la aorta para evitar una punción completa del vaso. Los pinchazos directos pueden causar hemorragia masiva y disminuir las tasas de éxito de la perfusión. La inserción exitosa puede ser confirmada por la ampliación visible de las aurículas del corazón. </li></ol></li><li> Rápidamente lacerar un atrio con el sciSsors y permitir que la sangre se drene. <ol><li> Enjuague con solución de tricaína para prevenir la acumulación de sangre y la formación de coágulos en la cavidad torácica. </li></ol></li><li> Perfundir el axolotl con aproximadamente 20-30 mL de PBS. El animal debe cambiar de color rosa claro a blanco en una perfusión exitosa. </li><li> Haga una pausa en la bomba peristáltica y mueva el extremo libre del tubo en el tubo de 15 ml de solución DiI. Reinicie la bomba, tenga cuidado de no crear burbujas de aire en el tubo. </li><li> Perfundir el axolotl con todo el stock de trabajo de DiI. Nota: En una perfusión exitosa, el axolotl con cambio de color al rosa brillante del DiI. Esto será más notable en las branquias. </li><li> Pausa la bomba después de la perfusión con DiI es completa y coloque el extremo libre de la tubería en 4% paraformaldehído (PFA) solución para fijar el tejido. Reinicie la bomba y perfuse al menos 10 ml de PFA. Precaución: PFA es tóxico y debe ser manipulado y dispoSed de manera apropiada. Se deben usar guantes y gafas de seguridad, y las soluciones deben hacerse dentro de una campana extractora. La perfusión del axolotl con PFA para fijar el tejido resulta en la muerte del animal. </li></ol> 4. Finalización de la perfusión y preparación de visualización <ol><li> Detenga la bomba peristáltica y retire la aguja de la aorta axolotl. </li><li> Coloque el axolotl en una placa de plástico. Nota: El uso de una mitad de una placa de Petri grande funciona bien y permite verter una pequeña cantidad de Tricaine o PBS en el axolotl para mantener su piel húmeda y mejorar la calidad de visualización. </li><li> Deseche todos los materiales usados ​​en los contenedores de desechos apropiados. Limpiar las herramientas quirúrgicas con etanol al 70%, desinfectar con un esterilizador de vidrio entre animales y esterilizar en autoclave siguiendo el procedimiento. Enjuague el tubo con la solución de PBS y luego drene, seque completamente y guárdelo para su uso posterior. </li></ol> 5. Visualización del Axolotl Perfecto <oL <li> Coloque el axolotl bajo un microscopio confocal fluorescente. </li><li> Apague las luces, ya que la visualización de los vasos teñidos por DiI es impedida por la luz. </li><li> Utilice un cubo de filtro de emisión de fluorescencia verde ( por ejemplo, ET-CY3) con el microscopio confocal para visualizar la vasculatura del axolotl. Utilice una luz de excitación de 545 nm de longitud de onda. Nota: Para obtener una imagen de alta calidad, se pueden utilizar los siguientes parámetros: exposición de 1,1 s, ganancia de 1x, saturación de 1,0, aumento de 2X. </li></ol>

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	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La visualización de la vasculatura del axolotl puede lograrse con éxito mediante la perfusión con el colorante de carbocianina lipófilo, DiI. En este estudio se describe un nuevo protocolo para la perfusión del axolotl con DiI utilizando una bomba peristáltica. También se muestra la posterior visualización de la vasculatura axolotl utilizando un microscopio confocal fluorescente. Este protocolo fue una adaptación del protocolo de perfusión DiI de roedor observado en Li et al. 7...

La visualización de la vasculatura desempeña un papel vital en la comprensión de la estructura y función de los organismos a través de muchas especies. A partir del siglo XVI con Leonardo da Vinci, se han estudiado modelos y representaciones gráficas de la circulación 1 . Usando ceras y moldes de caucho, los tejidos fueron perfundidos para crear modelos tridimensionales de la vasculatura, lo que permitió el estudio de la organogénesis y la patogénesis [ 1 , 2] . Las resinas y las ceras se colorearon con tintes tales como tinta India o rojo carmín para permitir su fácil visualización 1 , 2 . Sin embargo, estas técnicas causaron muchos problemas debido a que sus altas viscosidades impidieron la perfusión total del tejido de interés 1 . A medida que el campo se hizo más sofisticado, el uso de microscopios confocales y electrónicos entró en juego, moviendo la técnica de perfusión<html> Lejos de los moldes y hacia perfusiones líquidas de la vasculatura, algunas de las cuales permitieron la perfusión y la imagen de los vasos sanguíneos sin destruir el tejido inicial 3 . DiI, un colorante de carbocianina fluorescente, es una de tales manchas que permite la perfusión de animales sin dañar el tejido vascular. Los colorantes de carbocianina son tintes lipófilos que se incorporan en las membranas celulares al contacto. Estos colorantes permiten una tinción fácil e instantánea de las células endoteliales vasculares, que pueden ser vistas después bajo un microscopio confocal fluorescente. DiI se mueve a través de la difusión lateral en la membrana lipídica de las células, como se muestra en el etiquetado y rastreo de las neuronas [ 4] . Quımicamente, las dos cadenas alquılicas de DiI dan al tinte su alta afinidad por las membranas celulares, mientras que dos anillos conjugados de un fluorocromo que es responsable de emitir una longitud de onda roja cuando son excitados por filtros de luz fluorescente verde&gt; 4. DiI se ha utilizado en muchas capacidades, incluyendo el etiquetado exitoso de la membrana plasmática y marcaje anterógrado y retrógrado en las neuronas [ 5 , 6] . DiI se ha utilizado previamente en los protocolos de perfusión, mientras que la visualización de la vasculatura de ratones [ 7] . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) son salamandras que viven exclusivamente en lagos salobres cerca de la Ciudad de México, México. Estos animales se han convertido en un modelo importante para la comprensión de los procesos regenerativos, ya que pueden regenerar los miembros completos, la cola (incluyendo el cordón nervioso), las porciones del corazón y otros órganos internos y las porciones del ojo como adultos 8 , 9 . Además, con la reciente aplicación de herramientas genéticas en axolotls, una visión sin precedentes en las moléculas y las células que conducen estos procesos es ahora posible 8 . El exitoso regeneRación de una extremidad entera requiere un proceso extensivo de la revascularización, que puede desempeñar un papel significativo en la regeneración más allá de las funciones tradicionales de los vasos sanguíneos en proporcionar el oxígeno y los alimentos. Entender la revascularización en el contexto de la regeneración tisular es imperativo. Axolotl vasos sanguíneos han sido previamente visualizados con India Ink, y si bien los resultados fueron intrigantes, este proceso no ha sido revisado en las décadas posteriores [ 10] . Se intentó adaptar un protocolo de perfusión DII desarrollado para su uso en mamíferos para permitir una completa perfusión y visualización de la axolotl vascular 7 . Este protocolo describe las medidas tomadas para perfusar con éxito y posteriormente visualizar la circulación del axolotl con una técnica de tinción DII. Este procedimiento permitirá una visualización precisa de los vasos sanguíneos patentes en tejidos homeostáticos, así como en tejidos regeneradores, y proporciona un nuevo método para la visualizaciónN y análisis del proceso de revascularización en axolotl.

<table><tbody><tr><td>Peristaltic Pump&amp;nbsp;</td><td>Marshall Scientific&amp;nbsp;</td><td>RD-RP1</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion tubing</td><td>Excelon Lab &amp;amp; Vacuum Tubing</td><td>436901705</td><td>size S1A</td></tr><tr><td>27g butterfly needle</td><td>EXELint Medical Products</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AmericanBio</td><td>7747-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>AmericanBio</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ThermoFischer</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>1,1&amp;prime;-Dioctadecyl-3,3,3&amp;prime;,3&amp;prime;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (100% vol/vol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Surgical foreceps&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDG0748741</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene foam frame</td><td></td><td></td><td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&amp;nbsp; cut out</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Medline</td><td>DYND04025</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent underpad</td><td>Avacare Medical</td><td>PKUFSx</td><td></td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard disposable transfer pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>50216954</td><td></td></tr><tr><td>Clamp stand</td><td>Adafruit</td><td>291</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Tricaine powder</td></tr><tr><td>Adult axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tanks</td><td></td><td></td><td>Varying size appropriate for the axolotl</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3 Fluorescent Filter</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

Las técnicas de perfusión se han utilizado durante siglos para visualizar la circulación de los tejidos. Axolotl (Ambystoma mexicanum) es una especie de salamandra que ha surgido como un modelo esencial para los estudios de regeneración. Poco se sabe acerca de cómo se produce la revascularización en el contexto de la regeneración en estos animales. Aquí presentamos un método simple para la visualización de la vasculatura en axolotl vía perfusión de 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI). DiI es un colorante de carbocianina lipofílico que se inserta en la membrana plasmática de las células endoteliales instantáneamente. La perfusión se realiza usando una bomba peristáltica de tal manera que DiI entra en la circulación a través de la aorta. Durante la perfusión, el colorante fluye a través de los vasos sanguíneos del axolotl e incorpora en la bicapa lipídica de las células endoteliales vasculares al contacto. El procedimiento de perfusión dura aproximadamente una hora para un axolotl de ocho pulgadas. Inmediatamente después de la perfusión,Th DiI, el axolotl se puede visualizar con un microscopio confocal fluorescente. El DiI emite luz en el rango naranja-rojo cuando se excita con un filtro fluorescente verde. Este procedimiento de perfusión DiI puede usarse para visualizar la estructura vascular de los axolotes o para demostrar patrones de revascularización en tejidos regeneradores.

<html> Con la tinción DiI, la vasculatura del axolotl se puede visualizar fácilmente. Los vasos sanguíneos de los animales perfundidos con el colorante lipófilo son inmediatamente visibles bajo un microscopio fluorescente confocal. La figura 1 .1-1.5 es una representación esquemática del protocolo de perfusión. Después de la perfusión con el colorante rosa brillante, un axolotl perfectamente perfundido aparecerá rosa. Usando un filt...

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DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Usando una técnica lipofílica de tinción de perclorato de 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindocarbocianina (DiI), Ambystoma mexicanum puede someterse a perfusión vascular para permitir una fácil visualización de la vasculatura.

La perfusión como un método para la visualización vascular<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

dii-perfusion-as-method-for-vascular-visualization-ambystoma

Research

JoVE Journal

Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.9K vistas.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  Usando una técnica lipofílica de tinción de perclorato de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina (DiI), Ambystoma mexicanum puede someterse a perfusión vascular para permitir una fácil visualización de la vasculatura. 

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Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Aumento de la Tetra mexicano Astyanax mexicanus para análisis de fenotipos Post-larval y Immunohistochemistry Whole-mount

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Investigación

Genética

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Biología del Desarrollo

Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The cerebral vasculature dynamically responds to various pathophysiological states and it exhibits considerable differences between strains and under conditions of genetic manipulations. Essentially, a reliable technique for intracranial vessel staining is essential in order to study the pathogenesis of ischemic stroke. Until recently, a set of different techniques has been employed to visualize the cerebral vasculature including injection of low viscosity resin, araldite F, gelatin mixed with various dyes1 (i.e. carmine red, India ink) or latex with2 or without3 carbon black. Perfusion of white latex compound through the ascending aorta has been first reported by Coyle and Jokelainen3. Maeda et al.2 have modified the protocol by adding carbon black ink to the latex compound for improved contrast visualization of the vessels after saline perfusion of the brain. However, inefficient perfusion and inadequate filling of the vessels are frequently experienced due to high viscosity of the latex compound4. Therefore, we have described a simple and cost-effective technique using a mixture of two commercially available carbon black inks (CB1 and CB2) to visualize the cerebral vasculature in a reproducible manner5. We have shown that perfusion with CB1+CB2 in mice results in staining of significantly smaller cerebral vessels at a higher density in comparison to latex perfusion5. Here, we describe our protocol to identify the anastomotic points between the anterior (ACA) and middle cerebral arteries (MCA) to study vessel variations in mice with different genetic backgrounds. Finally, we demonstrate the feasibility of our technique in a transient focal cerebral ischemia model in mice by combining CB1+CB2-mediated vessel staining with TTC staining in various degrees of ischemic injuries.

Analysis of rodent cerebrovascular anatomy plays an important role in experimental stroke research. In this context, intravascular perfusion with colored latex has been considered as a standard tool for several years. However, this technique implies distinct technical limitations, which undermine its reproducibility. Here, we describe a simple method to visualize cerebral vessels in a reproducible manner. Injection of a mixture of two commercially available carbon black inks through the left myocardial ventricle results in adequate filling of cerebral vessels with high contrast visualization. We have successfully applied this technique to identify anastomotic points between cerebral vascular territories of mice with different genetic backgrounds. We finally give evidence that this novel and simple method for vessel staining can be combined with triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining - a widely used tool to observe and analyze infarct volumes in mice.

La perfusión intravascular de Carbono Negro Tinta fiable permite la visualización de los vasos cerebrales

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The ...

Neurociencias

Preparación de un modelo de microtumor humano vascularizado basado en microfluídica

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

Autor destacado: Creación de microtumores vascularizados humanos como modelos para la investigación traslacional del cáncer 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

Establecimiento de un modelo fisiológico de microtumor vascularizado humano para la investigación del cáncer

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Investigación sobre el cáncer

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

Etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro Teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador DiI

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bioingeniería

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model species such as zebrafish and salamanders that are capable of intrinsic heart regeneration hold promise for future regenerative therapies for human patients. To evaluate the outcome of cardioregenerative experiments it is imperative that heart function can be monitored. The axolotl salamander (A. mexicanum) represents a well-established model species in regenerative biology attaining sizes that allows for evaluation of cardiac function. The purpose of this protocol is to establish methods to reproducibly measure cardiac function in the axolotl using echocardiography. The application of different anesthetics (benzocaine, MS-222, and propofol) is demonstrated, and the acquisition of two-dimensional (2D) echocardiographic data in both anesthetized and unanesthetized axolotls is described. 2D echocardiography of the three-dimensional (3D) heart can suffer from imprecision and subjectivity of measurements, and to alleviate this phenomenon a solid method, namely intra/inter-operator/observer analysis, to measure and minimize this bias is demonstrated. Finally, a method to acquire 3D echocardiographic data of the beating axolotl heart at a very high spatiotemporal resolution and with pronounced blood-to-tissue contrast is described. Overall, this protocol should provide the necessary methods to evaluate cardiac function and model anatomy, and flow dynamics in the axolotl using ultrasound imaging with applications in both regenerative biology and general physiological experiments.

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl Ambystoma Mexicanum

Here we present echocardiography protocols for two-dimensional and three-dimensional image acquisition of the beating heart of the axolotl salamander (Ambystoma mexicanum), a model species in heart regeneration. These methods allow for longitudinal evaluation of cardiac function at a high spatiotemporal resolution.

Ecocardiografía 2D y 3D en el ajolote (Ambystoma Mexicanum)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model ...

Medicina

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

Imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

La visualización y cuantificación de la Capa libre de células en las arteriolas del músculo cremáster Rata

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

La perfusión como un método para la visualización vascular

Resumen

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Establecimiento de un modelo fisiológico de microtumor vascularizado humano para la investigación del cáncer

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