Diese Forschung wurde vom Brigham &amp; Women&#39;s Hospital und dem March of Dimes unterstützt. Die Autoren danken allen Mitgliedern des Whited Labs für ihre Unterstützung und Beratung.

Alle Axolotl-Experimente wurden in Übereinstimmung mit Brigham und Women&#39;s Hospital (BWH) Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt. 1. Perfusionsexperiment einrichten <ol><li> Legen Sie ein erwachsenes Axolot in einen mit 0,1% Triacinlösung (MS222) gefüllten Plastikbehälter für 15-20 min oder bis vollständig anästhesiert. Stellen Sie sicher, dass der Behälter mit genügend Triacin-Lösung gefüllt ist, so dass das Axolotl vollständig untergetaucht ist. Hinweis: Alle Verfahren müssen gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierpflege durchgeführt werden. Bei BWH wird ein Axolotl als vollständig betäubt betrachtet, wenn es einen Fuß-Prise-Test versagt, dh es gibt keine reflexive Bewegung, wenn der Fuß sanft gequetscht wird. Achtung: Obwohl Tricaine ein Anästhetikum ist, das speziell für Wasserorganismen verwendet wird, sollte ein direkter Hautkontakt mit der Tricainlösung vermieden werden. </li><li> Richten Sie die Axolotl-Perfusionsstation ein. <ol><li> Setze dasAbsorbierende Auflage auf einer ebenen, ebenen Oberfläche mit der nach oben weisenden Seite. </li><li> Schneiden Sie ein Loch in den Polystyrol-Schaumrahmen, der die passende Größe und Form für das anästhesierte Axolotl ist, um in der Rückenlage zu liegen. Legen Sie den Rahmen auf das saugfähige Pad. Hinweis: Einige zusätzliche Papiertücher können sofort unter dem Rahmen für zusätzliche Saugfähigkeit platziert werden. </li><li> Die peristaltische Pumpe mit dem Perfusionsschlauch beladen. Stellen Sie die Pumpe auf eine Durchflussrate von 0,7 ml / min ein, die im Uhrzeigersinn fließt. </li><li> Mischen Sie die Verdünnungslösung mit 0,7x PBS und 5% Glukose in einer 1: 4 Mischung. </li><li> Mischen Sie 10 ml Verdünnungslösung mit 200 μl der DiI-Stammlösung in einem 50 ml konischen Röhrchen. Cap und Mix durch Inversion. Decken Sie diesen Schlauch mit Aluminiumfolienpapier ab, um die Arbeitslösung vor Lichteinwirkung zu schützen. Hinweis: Die Volumina sollten entsprechend der Größe des Axolotls proportional geändert werden. Diese Werte sind für eine ca. 15 cm axolotl (Schnauze-zu-Schwanz-Länge). EINNaturen dieser Größe haben möglicherweise nicht die volle Geschlechtsreife erreicht, so dass Tier Sex nicht zu diesem Zeitpunkt bestimmt werden kann. </li><li> Füllen Sie ein 50 mL konisches Rohr mit 0,7x PBS. Hinweis: PBS wird für die Priming der Schleife und Axolotl Exsanguination verwendet werden. </li><li> Befestigen Sie die 27-Gauge-Schmetterlingsnadel am Austrittsende des Perfusionsschlauches. Falten Sie die Schmetterlingsflügel aufeinander und legen Sie sie in den Klemmenständer. </li><li> Legen Sie das freie Ende des Perfusionsschlauches in das 50 mL konische Rohr, das mit 0,7x PBS gefüllt ist, und führen Sie die Perfusionspumpe, bis der gesamte Schlauch mit einer Lösung gefüllt ist. Pausieren Sie die Pumpe, sobald der gesamte Schlauch mit PBS gefüllt ist. Hinweis: Achten Sie darauf, dass der Schlauch jederzeit frei von Luftblasen ist, da diese Luft in den Axolotl bringen und eine vollständige Perfusion verhindern. </li><li> Legen Sie ein Papiertuch in die axolotlförmige Form im Polystyrol-Schaumstoffrahmen. Mit einer Transferpipette das Tuch mit Triacinlösung einweichen. Anmerkung: Schneiden Sie ein kleines Quadrat in der Mitte des PapiertuchesEl, um die Drainage von Flüssigkeiten während des Perfusionsverfahrens zu ermöglichen. </li><li> Legen Sie die anästhesierte Axolotl Rücken auf das Papiertuch im Polystyrol-Schaumstoffrahmen. </li></ol></li></ol> 2. Eröffnung der Axolotl Brust <ol><li> Benutze chirurgische Pinzette, um die Haut entlang der Mittelachse der Axolotl-Brust zu knacken, knapp unterhalb der Schulterlinie. Nach oben ziehen </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um einen kleinen Schnitt zu machen, wo die Haut gezogen wurde. </li><li> Entfernen Sie einen quadratischen Fleck der Haut über die Brust, um zwei Knorpelplatten zu enthüllen. <ol><li> Entfernen Sie die Haut, um ein Fenster über die Thoraxhöhle zu öffnen, das groß genug ist, um das Herz deutlich zu sehen und ungefähr 5 mm der Aorta, die vom Herzen abzweigt. </li></ol></li><li> Das Bindegewebe sorgfältig mit einer Pinzette oder der geschlossenen Schere zerreißen, um das Entfernen von größeren Blutgefäßen zu vermeiden. </li><li> Heben Sie jede Knorpelplatte einzeln mit der Pinzette an und verbrauchen sie wMit der chirurgischen Schere. </li><li> Sorgfältig das Perikard mit der Pinzette einklemmen, hochziehen und mit der chirurgischen Schere punktieren; Dieser Einschnitt sollte gerade tief genug sein, um das sehr dünne Perikard zu durchstechen und sollte groß genug sein, um die Entfernung des Perikards zu ermöglichen. Achten Sie darauf, das Herz nicht zu schneiden. </li><li> Zartes das Perikard entfernen, um das Herz und die Aorta auszusetzen. Hinweis: Verwenden Sie eine Transferpipette, periodisch spülen Sie die Brusthöhle und die Kiemen mit Tricain-Lösung, um den Bereich klar zu halten und halten Sie die Axolotl anästhesiert. </li></ol> 3. Perfusion des Axolotl <ol><li> Legen Sie den Klemmenständer mit der beladenen Schmetterlingsnadel neben dem Polystyrol-Schaumstoffrahmen, so dass der Arm der Klemme leicht manipuliert werden kann, um die Nadel in die Axolotl-Aorta einzuführen. Richten Sie die Nadelspitze auf den rostralen Aspekt des Tieres während der Insertion und halten Sie die Nadel parallel zur Aorta, um zu vermeiden, dass sie durch die opPosite Seite. </li><li> Schalten Sie die peristaltische Pumpe ein. 0,7x PBS sollte weiterhin durch Schlauch fließen. </li><li> Setzen Sie die Nadel in die Aorta ein. <ol><li> Schieben Sie die Pinzette unter den Aortenbogen und ziehen Sie leicht nach unten, um einen leichten Zugang zu ermöglichen. </li><li> Manövrieren Sie die Nadel-Klemm-Kombination, so dass die Nadel entlang der Länge der Aorta läuft und nach oben zum Kopf zeigt. Setzen Sie die Nadel ein, während Sie die Pinzette für die Unterstützung hinter der Aorta verwenden. Hinweis: Die Nadel sollte tief genug in die Aorta eingesetzt werden, um sicherzustellen, dass sie während der Perfusion nicht ausrutscht. Dies kann etwa 5 mm für ein 15 cm Axolotl sein. Stellen Sie sicher, dass die Nadel perfekt mit der Aorta in Einklang steht, um eine vollständige Punktion des Schiffes zu vermeiden. Durch-und-Durchgangsdurchgänge können massive Blutung verursachen und die Erfolgsquoten der Perfusion verringern. Eine erfolgreiche Einfügung kann durch eine sichtbare Vergrößerung der Herzmuster des Herzens bestätigt werden. </li></ol></li><li> Schnell zerreißt ein Atrium mit dem sciSsors und lassen Blut abtropfen lassen. <ol><li> Spülen Sie mit Tricain-Lösung, um Blutansammlung und Gerinnselbildung in der Brusthöhle zu verhindern. </li></ol></li><li> Perfekt das Axolot mit etwa 20-30 ml PBS. Das Tier sollte von hellrosa in Farbe zu Weiß in einer erfolgreichen Perfusion wechseln. </li><li> Pausieren Sie die peristaltische Pumpe und bewegen Sie das freie Ende des Schlauches in das 15 ml Rohr der DiI-Lösung. Starten Sie die Pumpe neu, achten Sie darauf, keine Luftblasen im Schlauch zu erzeugen. </li><li> Setzen Sie den Axolotl mit dem gesamten Arbeitsmaterial von DiI ein. Anmerkung: In einer erfolgreichen Perfusion, die Axolotl mit Veränderung Farbe auf die helle rosa der DiI. Das wird am deutlichsten in den Kiemen. </li><li> Pausieren Sie die Pumpe, nachdem die Perfusion mit DiI abgeschlossen ist und legen Sie das freie Ende des Schlauches in 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung, um das Gewebe zu fixieren. Starten Sie die Pumpe neu und benachrichtigen Sie mindestens 10 ml PFA. Achtung: PFA ist giftig und sollte gehandhabt und dispo seinSed von angemessenem. Handschuhe und Schutzbrillen sollten getragen werden, und Lösungen sollten in einer Dunstabzugshaube hergestellt werden. Die Perfusion des Axolotls mit PFA zur Fixierung des Gewebes führt zum Tod des Tieres. </li></ol> 4. Beenden der Perfusion und Visualisierung Vorbereitung <ol><li> Stoppen Sie die peristaltische Pumpe und entfernen Sie die Nadel aus der Axolotl-Aorta. </li><li> Legen Sie das Axolotl auf eine Plastikplatte. Anmerkung: Die Verwendung einer Hälfte einer großen Petrischale funktioniert gut und ermöglicht das Gießen einer kleinen Menge Tricaine oder PBS auf das Axolotl, um seine Haut nass zu halten und die Visualisierungsqualität zu verbessern. </li><li> Entsorgen Sie alle verwendeten Materialien in den entsprechenden Abfallbehältern. Saubere chirurgische Werkzeuge mit 70% Ethanol, desinfizieren mit einem Glasperlen-Sterilisator zwischen den Tieren und sterilisieren durch Autoklavieren nach dem Verfahren. Schlauch mit der PBS-Lösung spülen und abtropfen lassen, vollständig abtrocknen und zur weiteren Verwendung aufbewahren. </li></ol> 5. Visualisierung der perfundierten Axolotl <oL&gt; <li> Lege das Axolotl unter ein fluoreszierendes konfokales Mikroskop. </li><li> Schalten Sie die Lichter aus, da die Visualisierung der DiI-gefärbten Gefäße durch Licht beeinträchtigt wird. </li><li> Verwenden Sie einen grünen Fluoreszenz-Emissionsfilter-Würfel ( zB ET-CY3) mit dem konfokalen Mikroskop, um die Vaskulatur des Axolotls zu visualisieren. Verwenden Sie Anregungslicht der Wellenlänge 545 nm. Hinweis: Um ein Bild von hoher Qualität zu erhalten, können folgende Parameter verwendet werden: Belichtung für 1,1 s, Verstärkung von 1x, Sättigung von 1,0, Vergrößerung von 2X. </li></ol>

<ol>
	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Visualisierung der Vaskulatur des Axolotls kann erfolgreich durch Perfusion mit dem lipophilen Carbocyaninfarbstoff DiI erreicht werden. In dieser Studie beschreiben wir ein neuartiges Protokoll für die Perfusion des Axolotls mit DiI mit einer peristaltischen Pumpe. Wir zeigen auch die anschließende Visualisierung des Axolotl-Gefäßsystems mit einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop. Dieses Protokoll war eine Anpassung des Nagetier-DiI-Perfusionsprotokolls, das in Li et al. 7 ...

Die Visualisierung der Vaskulatur spielt eine wesentliche Rolle beim Verständnis der Struktur und Funktion von Organismen über viele Arten hinweg. Ab dem 16. Jahrhundert mit Leonardo da Vinci wurden Modelle und grafische Darstellungen der Zirkulation untersucht 1 . Mit Hilfe von Wachs und Gummi-Formen wurden Gewebe perfundiert, um dreidimensionale Modelle des Gefäßsystems zu schaffen, die das Studium der Organogenese und Pathogenese 1 , 2 erlaubten. Harze und Wachse wurden mit Farbstoffen wie Indien Tinte oder Karminrot gefärbt, um ihre einfache Visualisierung zu ermöglichen 1 , 2 . Allerdings verursachten diese Techniken viele Probleme, weil ihre hohen Viskositäten eine vollständige Perfusion des interessierenden Gewebes verhinderten. Als das Feld anspruchsvoller wurde, kam die Verwendung von konfokalen und Elektronenmikroskopen ins Spiel, indem er die Perfusionstechnologie bewegte<html> Ues weg von Gussformen und zu flüssigen Perfusionen des Gefäßsystems, von denen einige die Perfusion und Bildgebung von Blutgefäßen erlaubt haben, ohne das anfängliche Gewebe 3 zu zerstören. DiI, ein fluoreszierender Carbocyaninfarbstoff, ist ein solcher Fleck, der die Perfusion von Tieren ohne Beschädigung des Gefäßgewebes ermöglicht. Carbocyaninfarbstoffe sind lipophile Farbstoffe, die bei Kontakt in Zellmembranen einfließen. Diese Farbstoffe ermöglichen eine einfache und sofortige Färbung von vaskulären Endothelzellen, die dann unter einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop betrachtet werden können. DiI bewegt sich über laterale Diffusion in der Lipidmembran von Zellen, wie in der Markierung und Verfolgung von Neuronen gezeigt 4 . Chemikalisch geben die beiden Alkylketten von DiI dem Farbstoff seine hohe Affinität für Zellmembranen, während zwei konjugierte Ringe aus einem Fluorochrom, das für die Emission einer roten Wellenlänge verantwortlich ist, wenn es durch grüne Fluoreszenzlichtfilter angeregt wird&gt; 4 DiI wurde in vielen Kapazitäten eingesetzt, darunter die erfolgreiche Markierung der Plasmamembran und sowohl die anterograde als auch die retrograde Markierung in den Neuronen 5 , 6 . DiI wurde zuvor in Perfusionsprotokollen verwendet, während das Vaskulatur von Mäusen sichtbar gemacht wurde 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sind Salamander, die exklusiv in Brackseen in der Nähe von Mexiko-Stadt, Mexiko leben. Diese Tiere sind zu einem wichtigen Modell für das Verständnis von regenerativen Prozessen geworden, da sie ganze Gliedmaßen, Schwanz (einschließlich Nervenkabel), Teile des Herzens und anderer innerer Organe und Teile des Auges als Erwachsene 8 , 9 regenerieren können . Darüber hinaus ist mit der jüngsten Anwendung von genetischen Werkzeugen in Axolotten ein beispielloser Einblick in die Moleküle und Zellen, die diese Prozesse durchführen, nun möglich 8 . Das erfolgreiche regeneDie Ration eines ganzen Gliedes erfordert einen umfangreichen Revaskularisierungsprozess, der bei der Regeneration eine wesentliche Rolle spielen kann, die über die traditionellen Funktionen der Blutgefäße bei der Bereitstellung von Sauerstoff und Nährstoffen hinausgeht. Das Verständnis der Revaskularisierung im Kontext der Geweberegeneration ist zwingend erforderlich. Axolotl-Blutgefäße wurden zuvor mit India Ink visualisiert, und während die Ergebnisse faszinierend waren, wurde dieser Prozess in den folgenden Jahrzehnten nicht erneut besucht 10 . Wir suchten ein DiI-Perfusionsprotokoll anzupassen, das für den Einsatz in Säugetieren entwickelt wurde, um eine vollständige Perfusion und Visualisierung des Axolotl-Gefäßsystems zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erfolgreich durchgeführt wurden, um die Axolotl-Zirkulation erfolgreich mit einer DiI-Färbetechnik zu visualisieren und anschließend zu visualisieren. Diese Vorgehensweise ermöglicht eine genaue Visualisierung von Patentblutgefäßen in homöostatischen Geweben sowie in regenerierenden Geweben und stellt eine neuartige Methode zur Visualisierung zur VerfügungN und Analyse des Revaskularisierungsprozesses im Axolotl.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1583">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:405px;">Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Marshall Scientific&#160;</td>
			<td style="width:152px;">RD-RP1</td>
			<td style="width:831px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Perfusion tubing</td>
			<td style="width:195px;">Excelon Lab &#38; Vacuum Tubing</td>
			<td>436901705</td>
			<td>size S1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">27g butterfly needle</td>
			<td style="width:195px;">EXELint Medical Products</td>
			<td>26709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">KCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7747-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Distilled water</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFischer</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ethanol (100% vol/vol)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical foreceps&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDG0748741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Polystyrene foam frame</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&#160; cut out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>DYND04025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Scalpel&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDS15210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Absorbent underpad</td>
			<td style="width:195px;">Avacare Medical</td>
			<td>PKUFSx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paper towels</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Standard disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:195px;">Fisherbrand</td>
			<td>50216954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Clamp stand</td>
			<td style="width:195px;">Adafruit</td>
			<td style="width:152px;">291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Tricaine powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Adult axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">MgSO4</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">CaCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Plastic tanks</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Varying size appropriate for the axolotl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Leica Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">ET-CY3 Fluorescent Filter</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

Perfusionstechniken wurden seit Jahrhunderten verwendet, um die Zirkulation von Geweben zu visualisieren. Axolotl (Ambystoma mexicanum) ist eine Spezies von Salamander, die als ein wesentliches Modell für Regenerationsstudien entstanden ist. Es ist wenig bekannt, wie die Revaskularisierung im Zusammenhang mit der Regeneration bei diesen Tieren auftritt. Hier berichten wir über eine einfache Methode zur Visualisierung des Gefäßsystems in Axolotl über Perfusion von 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanin perchlorat (DiI). DiI ist ein lipophiler Carbocyaninfarbstoff, der sofort in die Plasmamembran von Endothelzellen eindringt. Die Perfusion erfolgt mit einer peristaltischen Pumpe, so dass DiI durch die Aorta in die Zirkulation gelangt. Während der Perfusion fließt der Farbstoff durch die Blutgefäße des Axolotls und schließt sich bei Kontakt in die Lipiddoppelschicht von vaskulären Endothelzellen ein. Das Perfusionsverfahren dauert etwa eine Stunde für ein Acht-Zoll-Axolotl. Unmittelbar nach Perfusion wiDas Diolotl kann mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop visualisiert werden. Der DiI emittiert Licht im rot-orange Bereich, wenn er mit einem grünen Fluoreszenzfilter angeregt wird. Dieses DiI-Perfusionsverfahren kann verwendet werden, um die vaskuläre Struktur von Axolotten zu visualisieren oder Muster der Revaskularisierung in regenerierenden Geweben zu demonstrieren.

<html> Mit der DiI-Färbung kann die Vaskulatur des Axolotls leicht sichtbar gemacht werden. Blutgefäße von Tieren, die mit dem lipophilen Farbstoff perfundiert wurden, sind sofort unter einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop sichtbar. Abbildung 1: 1-1.5 ist eine schematische Darstellung des Perfusionsprotokolls. Nach der Perfusion mit dem hellen rosa Farbstoff wird ein erfolgreich perfundiertes Axolotl rosa erscheinen...

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DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Unter Verwendung einer lipophilen 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat (DiI) -Färbetechnik kann Ambystoma mexicanum eine vaskuläre Perfusion durchlaufen, um eine leichte Visualisierung des Gefäßsystems zu ermöglichen.

DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

dii-perfusion-as-method-for-vascular-visualization-ambystoma

Research

JoVE Journal

Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.9K Aufrufe.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  Unter Verwendung einer lipophilen 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat (DiI) -Färbetechnik kann Ambystoma mexicanum eine vaskuläre Perfusion durchlaufen, um eine leichte Visualisierung des Gefäßsystems zu ermöglichen. 

Serie: DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Forschung

Biologie

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

Verwendung von Drehstabtest als Methode für die qualitative Analyse von Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Eine einfache Methode zur Bildgebung Arabidopsis Leaves Mit Perfluordecalin als Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualization of Vascular Ca 2 + Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Netzhaut Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem Vorbereitungen für immunhistochemische Visualisierung von Mikrovaskulären Perizyten