Name: dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum
Uploaded: 2017-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
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Esta pesquisa foi apoiada pelo Brigham &amp; Women&#39;s Hospital e March of Dimes. Os autores agradecem a todos os membros do Laboratório Whited por seu apoio e conselho.

Toda experimentação axolotl foi realizada de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Brigham and Women&#39;s Hospital (BWH). 1. Configurar Experiência de Perfusão <ol><li> Coloque um axolotl adulto em um recipiente de plástico preenchido com 0,1% de solução de tricaína (MS222) por 15-20 min ou até completamente anestesiado. Certifique-se de que o recipiente esteja cheio de solução de tricaína suficiente, de modo que o axolotl esteja completamente submerso. Nota: Todos os procedimentos devem ser realizados de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados com animais. Na BWH, um axolotl é considerado totalmente anestesiado quando falha em um teste de puxar os pés, o que significa que não há movimento reflexivo quando o pé é suavemente espremido. Atenção: Embora a tricaína seja um anestésico especificamente utilizado para organismos aquáticos, o contato direto com a pele com a solução de tricaína deve ser evitado. </li><li> Configure a estação de perfusão axolotl. <ol><li> Coloque oAlmofada absorvente em uma superfície plana e nivelada com o lado absorvente voltado para cima. </li><li> Corte um furo na estrutura de espuma de poliestireno que é o tamanho e a forma apropriados para que o axolotl anestesiado se apresente na posição supina. Coloque o quadro na almofada absorvente. Nota: algumas toalhas de papel adicionais podem ser colocadas imediatamente sob o quadro para absorção adicional. </li><li> Carregue a bomba peristáltica com o tubo de perfusão. Ajuste a bomba para um caudal de 0,7 ml / min, fluindo no sentido horário. </li><li> Faça a solução diluída com 0,7x de PBS e 5% de glicose numa mistura de 1: 4. </li><li> Misture 10 mL de solução diluente com 200 μL da solução de reserva DiI em um tubo cônico de 50 mL. Cap e misture por inversão. Cubra este tubo com papel de alumínio para proteger a solução de trabalho da exposição à luz. Nota: Os volumes devem ser alterados de acordo com o tamanho do axolotl proporcionalmente. Estes valores são para um axolotl de aproximadamente 15 cm (comprimento do focinho até a cauda). UMANimais deste tamanho podem não ter atingido a maturidade sexual completa, de modo que o sexo animal não pode ser determinado no momento. </li><li> Encha um tubo cônico de 50 mL com PBS 0,7x. Nota: PBS será usado para iniciar o loop e a exsanguinação axolotl. </li><li> Anexe a agulha de borboleta de calibre 27 até a extremidade de saída da tubulação de perfusão. Dobre as asas de borboleta uma sobre a outra e coloque no suporte de braçadeira. </li><li> Coloque a extremidade livre do tubo de perfusão no tubo cônico de 50 mL preenchido com 0,7x PBS e execute a bomba de perfusão até que a tubagem inteira seja preenchida com solução. Pausar a bomba uma vez que a tubagem inteira é preenchida com PBS. Nota: Certifique-se de que a tubagem está livre de bolhas de ar em todos os momentos, pois isso irá causar embolia de ar no axolotl e evitar a perfusão total. </li><li> Coloque uma toalha de papel no molde em forma de axolotl na armação de espuma de poliestireno. Usando uma pipeta de transferência, remova a toalha com solução tricaína. Nota: Corte um pequeno quadrado no meio do reboque de papelPara permitir a drenagem de fluidos durante o procedimento de perfusão. </li><li> Coloque o axolotl anestesiado supino sobre a toalha de papel dentro do quadro de espuma de poliestireno. </li></ol></li></ol> 2. Abertura do Cofre Axolotl <ol><li> Use fórceps cirúrgicos para beliscar a pele ao longo do eixo central do cofre do axolotl, logo abaixo da linha dos ombros. Puxar para cima. </li><li> Use um bisturi para fazer uma pequena incisão onde a pele foi puxada. </li><li> Remova um remendo quadrado de pele sobre o tórax para revelar duas placas de cartilagem. <ol><li> Remova a pele para abrir uma janela sobre a cavidade torácica grande o suficiente para ver claramente o coração e aproximadamente 5 mm da aorta se ramificando do coração. </li></ol></li><li> Rasgue cuidadosamente o tecido conjuntivo usando fórceps ou tesoura fechada para evitar o corte de vasos sanguíneos maiores. </li><li> Levar cada placa de cartilagem individualmente usando a pinça e consumá-lasCom as tesouras cirúrgicas. </li><li> Aperte cuidadosamente o pericárdio com a pinça, puxe-o e perfure-o usando as tesouras cirúrgicas; Esta incisão deve ser apenas profunda o suficiente para perfurar o pericárdio muito fino e deve ser grande o suficiente para permitir a remoção do pericárdio. Tenha cuidado para não cortar o coração. </li><li> Retire delicadamente o pericárdio para expor o coração e a aorta. Nota: Usando uma pipeta de transferência, escove periodicamente a cavidade torácica e as brânquias com solução tricaína para manter a área limpa e mantenha o axolotl anestesiado. </li></ol> 3. Perfusão do Axolotl <ol><li> Coloque o suporte de braçadeira com a agulha de borboleta carregada ao lado do quadro de espuma de poliestireno, de modo que o braço da braçadeira possa ser facilmente manipulado para inserir a agulha na aorta axolotl. Aponte a ponta da agulha em direção ao aspecto rostral do animal durante a inserção e mantenha a agulha paralela à aorta para evitar perfurá-la através da opLado positivo. </li><li> Ligue a bomba peristáltica. 0.7x PBS deve continuar a fluir através da tubulação. </li><li> Insira a agulha na aorta. <ol><li> Deslize a pinça sob o arco aórtico e puxe ligeiramente para permitir um fácil acesso. </li><li> Manobra a combinação da agulha-agulha de modo que a agulha percorre o comprimento da aorta, apontando para a cabeça. Insira a agulha enquanto usa a pinça para apoio por trás da aorta. Nota: A agulha deve ser inserida profundamente o suficiente na aorta para garantir que ela não escorregue durante a perfusão. Isso pode ser de cerca de 5 mm para um axolotl de 15 cm. Certifique-se de que a agulha esteja perfeitamente em linha com a aorta para evitar a perfuração completa do vaso. As perfurações através e passagem podem causar hemorragia maciça e diminuir as taxas de sucesso de perfusão. A inserção bem sucedida pode ser confirmada pelo aumento visível das auroras do coração. </li></ol></li><li> Rapidamente lacerar um átrio com a ciênciaSsors e deixe o sangue escorrer. <ol><li> Lavar com solução de tricaína para prevenir o acúmulo de sangue e formação de coágulos na cavidade torácica. </li></ol></li><li> Perfogue o axolotl com cerca de 20-30 mL de PBS. O animal deve mudar de cor rosa claro para branco em uma perfusão bem sucedida. </li><li> Pausar a bomba peristáltica e mover a extremidade livre da tubulação para o tubo de 15 ml da solução DiI. Reinicie a bomba, tome cuidado para evitar a criação de bolhas de ar na tubulação. </li><li> Perfogue o axolotl com todo o estoque de trabalho da DiI. Nota: Em uma perfusão bem sucedida, o axolotl com cor de mudança para o rosa brilhante do DiI. Isso será mais notável nas brânquias. </li><li> Pausar a bomba após a perfusão com DiI é completa e colocar a extremidade livre da tubulação em solução de Paraformaldeído a 4% (PFA) para consertar o tecido. Reinicie a bomba e perfuse pelo menos 10 mL de PFA. Atenção: o PFA é tóxico e deve ser tratado e dispoSed de forma apropriada. Devem ser usadas luvas e óculos de segurança, e as soluções devem ser feitas dentro de uma exaustão. A perfusão do axolotl com PFA para consertar o tecido resulta na morte do animal. </li></ol> 4. Finalização da Preparação de Perfusão e Visualização <ol><li> Pare a bomba peristáltica e remova a agulha da aorta axolotl. </li><li> Coloque o axolotl em uma placa de plástico. Nota: usar uma metade de uma grande placa de Petri funciona bem e permite derramar uma pequena quantidade de Tricaine ou PBS no axolotl para manter sua pele molhada e melhorar a qualidade da visualização. </li><li> Descarte todos os materiais usados ​​nas lixeiras apropriadas. Limpe as ferramentas cirúrgicas com etanol a 70%, desinfeteie usando um esterilizador de grânulos de vidro entre animais e esterilize-se por autoclave seguindo o procedimento. Elimine a tubulação com a solução PBS e, em seguida, drene, seque completamente e guarde para uso posterior. </li></ol> 5. Visualização do Axolotl Perfido <oL&gt; <li> Coloque o axolotl sob um microscópio confocal fluorescente. </li><li> Desligue as luzes quando a visualização dos vasos manchados com DiI é impedida pela luz. </li><li> Use um cubo verde de filtro de emissão de fluorescência ( eg ET-CY3) com o microscópio confocal para visualizar a vasculatura do axolotl. Use a luz de excitação do comprimento de onda 545 nm. Nota: Para obter uma imagem de alta qualidade, os seguintes parâmetros podem ser usados: exposição para 1.1 s, ganho de 1x, saturação de 1.0, ampliação de 2X. </li></ol>

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	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A visualização da vasculatura do axolotl pode ser realizada com sucesso através da perfusão com o corante de carbocyanina lipofílico, DiI. Neste estudo, descrevemos um novo protocolo para a perfusão do axolotl com DiI usando uma bomba peristáltica. Mostramos também a subsequente visualização da vasculatura axolotl utilizando um microscópio confocal fluorescente. Este protocolo foi uma adaptação do protocolo de perfusão Dii de roedores visto em Li et al. 7 , no entanto, as p...

A visualização da vasculatura desempenha um papel vital na compreensão da estrutura e função dos organismos em muitas espécies. A partir do século 16 com Leonardo da Vinci, foram estudados modelos e representações gráficas da circulação 1 . Usando ceras e moldes de borracha, os tecidos foram perfundidos para criar modelos tridimensionais da vasculatura, o que permitiu o estudo de organogênese e patogênese 1 , 2 . As resinas e as ceras foram coloridas com corantes, tais como a tinta da Índia ou vermelho carmin para permitir a sua fácil visualização 1 , 2 . No entanto, essas técnicas causaram muitas questões porque suas altas viscosidades impediram a perfusão total do tecido de interesse 1 . À medida que o campo se tornou mais sofisticado, o uso de microscópios confocais e eletrônicos entrou em jogo, movendo a tecnologia de perfusão<html> Longe dos moldes de fundição e para as perfusões líquidas da vasculatura, algumas das quais permitiram a perfusão e imagem de vasos sanguíneos sem destruir o tecido inicial 3 . DiI, um corante de carbocyanina fluorescente, é uma mancha que permite a perfusão de animais sem danos no tecido vascular. Os corantes de carbocyanina são corantes lipofílicos que incorporam nas membranas celulares após contato. Estes corantes permitem uma coloração fácil e instantânea de células endoteliais vasculares, que podem então ser vistas sob um microscópio confocal fluorescente. DiI move-se através da difusão lateral na membrana lipídica das células, como mostrado na rotulagem e rastreamento dos neurônios 4 . Quimicamente, as duas cadeias de alquilo de DiI dão ao corante sua alta afinidade para as membranas celulares, enquanto dois anéis conjugados a partir de um fluorochrome que é responsável por emitir um comprimento de onda vermelho quando excitado por filtros de luz verde fluorescente&gt; 4. O DiI tem sido utilizado em muitas capacidades, incluindo rotulagem bem sucedida da membrana plasmática e rotulagem anterógrada e retrógrada nos neurônios 5 , 6 . DiI já foi usado em protocolos de perfusão ao visualizar a vasculatura de camundongos 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) são salamandras que vivem exclusivamente em lagos saloquiais perto da Cidade do México, no México. Esses animais tornaram-se um modelo importante para a compreensão dos processos regenerativos, pois eles podem regenerar membros completos, cauda (incluindo corda nervosa), porções do coração e outros órgãos internos e partes do olho como adultos 8 , 9 . Além disso, com a recente aplicação de ferramentas genéticas em axolotls, uma visão sem precedentes das moléculas e células que conduzem esses processos agora é possível 8 . O regene de sucessoA ração de um membro inteiro requer um extenso processo de revascularização, que pode desempenhar um papel significativo na regeneração, além das simples funções tradicionais dos vasos sanguíneos no fornecimento de oxigênio e nutrientes. Compreender a revascularização no contexto da regeneração tecidual é imperativo. Os vasos sanguíneos de Axolotl foram previamente visualizados usando a tinta da Índia, e enquanto os resultados eram intrigantes, esse processo não foi revisitado nas décadas subseqüentes 10 . Buscamos adaptar um protocolo de perfusão DiI desenvolvido para uso em mamíferos para permitir uma perfusão completa e visualização da vasculatura axolotl 7 . Este protocolo descreve as etapas tomadas para perfurar com êxito e, posteriormente, visualizar a circulação axolotl com uma técnica de coloração DiI. Este procedimento permitirá uma visualização precisa dos vasos sanguíneos de patentes nos tecidos homeostáticos, bem como nos tecidos regeneradores e fornece um novo método de visualizaçãoN e análise do processo de revascularização no axolotl.

<table><tbody><tr><td>Peristaltic Pump&amp;nbsp;</td><td>Marshall Scientific&amp;nbsp;</td><td>RD-RP1</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion tubing</td><td>Excelon Lab &amp;amp; Vacuum Tubing</td><td>436901705</td><td>size S1A</td></tr><tr><td>27g butterfly needle</td><td>EXELint Medical Products</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AmericanBio</td><td>7747-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>AmericanBio</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ThermoFischer</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>1,1&amp;prime;-Dioctadecyl-3,3,3&amp;prime;,3&amp;prime;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (100% vol/vol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Surgical foreceps&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDG0748741</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene foam frame</td><td></td><td></td><td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&amp;nbsp; cut out</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Medline</td><td>DYND04025</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent underpad</td><td>Avacare Medical</td><td>PKUFSx</td><td></td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard disposable transfer pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>50216954</td><td></td></tr><tr><td>Clamp stand</td><td>Adafruit</td><td>291</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Tricaine powder</td></tr><tr><td>Adult axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tanks</td><td></td><td></td><td>Varying size appropriate for the axolotl</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3 Fluorescent Filter</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

As técnicas de perfusão têm sido utilizadas há séculos para visualizar a circulação de tecidos. Axolotl (Ambystoma mexicanum) é uma espécie de salamandra que emergiu como um modelo essencial para estudos de regeneração. Pouco se sabe sobre como a revascularização ocorre no contexto da regeneração nesses animais. Aqui, relatamos um método simples para a visualização da vasculatura no axolotl através da perfusão de perclorato de 1,1&#39;-dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindocarbocyanina (DiI). DiI é um corante de carbocyanina lipofílico que se insere instantaneamente na membrana plasmática de células endoteliais. A perfusão é feita usando uma bomba peristáltica, de modo que a DiI entre na circulação através da aorta. Durante a perfusão, o corante flui através dos vasos sanguíneos do axolotl e incorpora na bicamada lipídica das células endoteliais vasculares após o contato. O procedimento de perfusão leva aproximadamente uma hora para um axolotl de oito polegadas. Imediatamente após a perfusãoDiI, o axolotl pode ser visualizado com um microscópio fluorescente confocal. O DiI emite luz no intervalo vermelho-laranja quando excitado com um filtro fluorescente verde. Este procedimento de perfusão DiI pode ser usado para visualizar a estrutura vascular de axolotls ou para demonstrar padrões de revascularização em tecidos regeneradores.

<html> Com a coloração DiI, a vasculatura do axolotl pode ser facilmente visualizada. Os vasos sanguíneos de animais perfundidos com o corante lipofílico são imediatamente visíveis sob um microscópio confocal fluorescente. A Figura 1 .1-1.5 é uma representação esquemática do protocolo de perfusão. Após a perfusão com o corante rosa brilhante, um axolotl perfundido com sucesso aparecerá rosa. Usando um filtro fluorescente verde ...

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DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Utilizando uma técnica de coloração de perclorato de diisoxifenil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindocarbocianina lipofílica (DiI) lipofílica, o Ambystoma mexicanum pode sofrer perfusão vascular para permitir uma fácil visualização da vasculatura.

A perfusão DiI como método de visualização vascular em<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

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Research

JoVE Journal

Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.9K visualizações.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  Utilizando uma técnica de coloração de perclorato de diisoxifenil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina lipofílica (DiI) lipofílica, o Ambystoma mexicanum pode sofrer perfusão vascular para permitir uma fácil visualização da vasculatura. 

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Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Levantando o Tetra mexicano Astyanax mexicanus para análise dos fenótipos Post-larval e imuno-histoquímica toda a montagem

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Genética

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Biologia do Desenvolvimento

Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The cerebral vasculature dynamically responds to various pathophysiological states and it exhibits considerable differences between strains and under conditions of genetic manipulations. Essentially, a reliable technique for intracranial vessel staining is essential in order to study the pathogenesis of ischemic stroke. Until recently, a set of different techniques has been employed to visualize the cerebral vasculature including injection of low viscosity resin, araldite F, gelatin mixed with various dyes1 (i.e. carmine red, India ink) or latex with2 or without3 carbon black. Perfusion of white latex compound through the ascending aorta has been first reported by Coyle and Jokelainen3. Maeda et al.2 have modified the protocol by adding carbon black ink to the latex compound for improved contrast visualization of the vessels after saline perfusion of the brain. However, inefficient perfusion and inadequate filling of the vessels are frequently experienced due to high viscosity of the latex compound4. Therefore, we have described a simple and cost-effective technique using a mixture of two commercially available carbon black inks (CB1 and CB2) to visualize the cerebral vasculature in a reproducible manner5. We have shown that perfusion with CB1+CB2 in mice results in staining of significantly smaller cerebral vessels at a higher density in comparison to latex perfusion5. Here, we describe our protocol to identify the anastomotic points between the anterior (ACA) and middle cerebral arteries (MCA) to study vessel variations in mice with different genetic backgrounds. Finally, we demonstrate the feasibility of our technique in a transient focal cerebral ischemia model in mice by combining CB1+CB2-mediated vessel staining with TTC staining in various degrees of ischemic injuries.

Analysis of rodent cerebrovascular anatomy plays an important role in experimental stroke research. In this context, intravascular perfusion with colored latex has been considered as a standard tool for several years. However, this technique implies distinct technical limitations, which undermine its reproducibility. Here, we describe a simple method to visualize cerebral vessels in a reproducible manner. Injection of a mixture of two commercially available carbon black inks through the left myocardial ventricle results in adequate filling of cerebral vessels with high contrast visualization. We have successfully applied this technique to identify anastomotic points between cerebral vascular territories of mice with different genetic backgrounds. We finally give evidence that this novel and simple method for vessel staining can be combined with triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining - a widely used tool to observe and analyze infarct volumes in mice.

Perfusão intravenosa de tinta Carbon Black Permite visualização dos vasos cerebrais

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The ...

Neurociência

Preparando um modelo de microtumor humano vascularizado baseado em microfluídica

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

Autor em destaque: Criando microtumores vascularizados humanos como modelos para pesquisa translacional do câncer 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Pesquisa do câncer

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

Rotulagem de vasos sanguíneos no cérebro Teleost e pituitária usando a perfusão cardíaca com um DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bioengenharia

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model species such as zebrafish and salamanders that are capable of intrinsic heart regeneration hold promise for future regenerative therapies for human patients. To evaluate the outcome of cardioregenerative experiments it is imperative that heart function can be monitored. The axolotl salamander (A. mexicanum) represents a well-established model species in regenerative biology attaining sizes that allows for evaluation of cardiac function. The purpose of this protocol is to establish methods to reproducibly measure cardiac function in the axolotl using echocardiography. The application of different anesthetics (benzocaine, MS-222, and propofol) is demonstrated, and the acquisition of two-dimensional (2D) echocardiographic data in both anesthetized and unanesthetized axolotls is described. 2D echocardiography of the three-dimensional (3D) heart can suffer from imprecision and subjectivity of measurements, and to alleviate this phenomenon a solid method, namely intra/inter-operator/observer analysis, to measure and minimize this bias is demonstrated. Finally, a method to acquire 3D echocardiographic data of the beating axolotl heart at a very high spatiotemporal resolution and with pronounced blood-to-tissue contrast is described. Overall, this protocol should provide the necessary methods to evaluate cardiac function and model anatomy, and flow dynamics in the axolotl using ultrasound imaging with applications in both regenerative biology and general physiological experiments.

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl Ambystoma Mexicanum

Here we present echocardiography protocols for two-dimensional and three-dimensional image acquisition of the beating heart of the axolotl salamander (Ambystoma mexicanum), a model species in heart regeneration. These methods allow for longitudinal evaluation of cardiac function at a high spatiotemporal resolution.

Ecocardiografia 2D e 3D no Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model ...

Medicina

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A perfusão DiI como método de visualização vascular em

Resumo

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Levantando o Tetra mexicano Astyanax mexicanus para análise dos fenótipos Post-larval e imuno-histoquímica toda a montagem

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária

Perfusão intravenosa de tinta Carbon Black Permite visualização dos vasos cerebrais

Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

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Rotulagem de vasos sanguíneos no cérebro Teleost e pituitária usando a perfusão cardíaca com um DiI-fixative

Ecocardiografia 2D e 3D no Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine

Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster