עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לסרטן (NCI) מענקים U54CA143798 ו U54CA143907 להקים מדעי הפיסיקה- אונקולוגיה מרכזי (PS-OCs) במכון הסרטן דנה-פרבר ואוניברסיטת דרום קליפורניה, בהתאמה. SM Mumenthaler קיבל פרס PS-OC transnetwork שתמכה חלק מהעבודה הזאת. ברצוננו להביע את תודתנו העמוקה לתומכים הפילנתרופיים שלנו, בייחוד למשפחת סטפנסון, לאמט, לטוני ולטסה, על תרומתם לפלטפורמת האופרטה HCS. כמו כן, ברצוננו להודות לג&#39;ו פו על ההדרכה ועל המרכז לחברי רפואה יישומית מולקולרית: ד &#39;אגוס על הדרכה קלינית וחונכות, ק&#39; פאטש לשיחות משמעותיות עם עיצוב ניסיוני, ר &#39;ראוואט לסיוע בפרוטוקולי ניתוח תמונות , ג &#39;כץ לעזרה טכנית עם האופרטה, ופ&#39; מקלין וד &#39;רודרמן לדיונים מועילים ומשוב.

1. תרבות התא הערה: כאן תגובות פנוטיפיות של תאים NSCLC (H3255) לסוכן EGFR מיקוד, erlotinib, כאשר שיתוף בתרבית עם fibroblasts הריאה (CCD-19Lu GFP) נחקרו. עבור אותו נתונים להגדיר, מבוסס על הקרינה מבוסס מורפולוגיה סיווג של שתי אוכלוסיות תאים (H3255 ו CCD-19Lu GFP) כדי להדגים את הקונקורדנס שלהם בוצע. עם זאת, יש להשתמש בשיטת סיווג אחת בלבד ויש לבחור אותה בהתאם ליישום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מ&quot;ל של RPMI-1640 בתוספת 10% חום FAB-inactivated ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין. הערה: בינוני הצמיחה ותוספים ניתן להחליף כנדרש עבור סוגי תאים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תרבותיים 10 ס&quot;מ 3 צלחות כמו אוכלוסיות טהור 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס ומעבר יחס המתאים בכל 3-4 ימים. </li></ol> 2. הכנת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין ההשעיה התא, להסיר cEll התקשורת לשטוף תאים עם 5 מ&quot;ל 1X פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את PBS, מוסיפים 1 מ&quot;ל של 0.05% טריפסין מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ו דגירה של 5 דקות (או עד התאים הם כבר לא דבק צלחת) ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנטרל טריפסין, להוסיף 4 מ&quot;ל של RPMI ל H3255 ו CCD-19Lu צלחות GFP ו pipet פתרונות התא לתוך 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ב XG 150 במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את supernatant ו resuspend תא כדורי 10 מ&quot;ל של התקשורת RPMI צינורות חרוטיים כדי להתכונן זריעה. </li></ol> 3. ציפוי תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את התאים כדי סטנדרטיזציה זריעה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך צינורות לערבב תאים בפתרון. פיפטה 10 μL של ההשעיה התא לתוך צינור microcentrifuge ולהוסיף 10 כחול טריפאן μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μL של פתרון זה לתוך תא ספירה שקופית להכניס לתוך מונה תא אוטומטי. הערה: שיטות אחרות לספירת תאים ( כלומר. הממוציטומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ספירת התאים לפחות שלוש פעמים, או עד לספירות שהתקבלו עקביות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים זרעים על צלחת רב הערה: מספר הצלחות לזרע תלוי במספר נקודות הזמן שיוצגו. לחלופין, צלחת אחת ניתן מחדש הדמיה לאורך זמן אם התאים transduced עם היסטון -2B-GFP (או כתמים גרעיניים lentiviral יציבים אחרים המספקים פילוח גרעיני נאות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע סך של 1,500 תאים / גם 100 μL של RPMI. הכן שלושה השעיות תא לצלחת שלוש אוכלוסיות תאים: H3255, CCD-19Lu GFP, ו 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. בצע כל בשלושה עותקים עם הגדרות צלחת זהה עבור כל נקודת זמן. הערה: צפיפות זריעה ראשונית צריך להיות מותאם לכל שורה התא וגודל הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים זרע 3 x 96 צלחות היטב באמצעות פיפטה רב. דגירה תאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 . </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 4. מינון סמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DMSO כדי erlotinib אבקה לעשות פתרון הסופי erlotinib המניות של ריכוז 10 מ&quot;מ. הערה: התרופה יכולה להיות מוחלפת לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרופה עם בינוני תרבות התא 2x הריכוז הסופי עם הריכוז הסופי הגבוה ביותר ב 10 מיקרומטר ו סדרתי לדלל ארבע פעמים ביחס 1:10, עבור סכום כולל של חמישה ריכוזי סמים ללא בקרת סמים. הערה: אם הריכוז של DMSO שווה או עולה על 0.1% v / v במינון התרופות הגבוה ביותר, אין בקרת סמים צריכה להכיל כמות שווה של DMSO על מנת להבטיח את ההשפעות הנצפות שנצפו אינן בשל רעילות DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100 μL של תמיסת התרופה לתוך המתאים גם לריכוז סמים הסופי של 1x מדולל בתקשורת. </li></ol> 5. רכישת תמונה הערה: התמונות נרכשו בימים 0, 2 ו -3. בהתאם לסוגי התא והתהליכים הסלולריים הנלמדים, oניתן לבדוק את נקודות הזמן הרצויות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאים להתכונן הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמציא את הפתרון לצבוע בריכוז הסופי הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור סיווג מבוסס פלואורסצנטי, להכין 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​כתם גרעיני ו 5 מיקרומטר כתם תאים מתים PBS (ראה טבלה של חומרים ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור סיווג מורפולוגיה מבוסס, להכין 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​כתם גרעיני, 5 מיקרומטר כתם תאים מתים, כתם 5 מיקרומטר תא ב PBS (ראה טבלה של חומרים ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 פתרון צבע μL היטב כל אחד. דגירה במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני האור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל ולרכוש תמונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת היטב מאינקובטור, לנגב את החלק התחתון של הצלחת עם EtOH 70%, ומניחים את הצלחת בחדר הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &#39;הגדרות&#39;, לחץ על הלחצן &#39;+&#39; תחת &#39;בחירת ערוץ&#39; כדי להוסיף ערוצים מתאימים( כלומר , brightfield, כתם גרעיני, כתם מתים, GFP, אותות RFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;פריסה בחירה&#39;, ולקחת z- מוערמים תמונות הבדיקה כל 2 מיקרומטר החל ב 0 מיקרומטר וכלה ב 20 מיקרומטר לזהות את המטוס של המוקד. הזן מרחק זה עבור כל ערוץ תחת &#39;גובה&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;תצלום&#39; מתחת לכל ערוץ כדי להעריך את העוצמות ולמטב את זמני החשיפה. הזן ערכים גבוהים יותר או תחתונים תחת &#39;זמן&#39; כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצד ימין של המסך, הדגש בארות מתאימות (כדי להיות צילמו) על הצלחת סכמטי. בבארות הסכימטיות שלהלן, הדגש את עשרים וחמישה השדות שצולמו בצורה דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;הפעל ניסוי&#39;, לזהות את הצלחת ב &#39;שם לוח&#39; על הכרטיסייה השמאלית, ולחץ על כפתור &#39;התחל&#39; (מתחת) כדי להפעיל את פרוטוקול רכישת התמונה עם המטרה 10X כדי ליצור בקנה מידה אפור תמונות TIFF בערוצים הנ&quot;ל. הערה: שלב אחר שלבהרס עבור פרוטוקול הדמיה עשוי להיות שונה בין מכשירים, אבל ערכי הפרמטר עדיין צריך להיות מותאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ההדמיה בימים שתיים ושלוש. </li></ol></li></ol> 6. ניתוח תמונה הערה: כל ניתוח התמונה בוצע באמצעות תוכנה קניינית. עם זאת, בגלל זה לא זמין לציבור, ניתוחים דומים תוכננו גם על CellProfiler 2.2 ו CellProfiler אנליסט 2.0, עם פרוטוקול קצר המפורטים להלן פרוטוקול מפורט בתנאי חומר משלים (תמונות הבדיקה כבר נטען לתוך צינורות כדי לבדוק את זרימת העבודה). התמונות מניסוי זה היו מקובצים יחד על בסיס היטב, כך שכל טוב יכול להיות נטען בנפרד. צינורות ה- CellProfiler שלהלן מכילים ביטוי רגולרי המנתח מידע מטה-נתונים מכל שם קובץ תמונה ומאפשר לקבץ את התמונות לפי ערוצים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד והתקן את תוכנת הקוד הפתוח: &#39;CellProfiler&#39;9; ו &#39;CellProfiler אנליסט&#39;. קבל את כל אפשרויות ברירת המחדל וההרחבות במהלך ההתקנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסווג תרבויות הטרוקלריות לתוך subpopulations. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה &#39;CellProfiler&#39;, לחץ על &#39;קובץ&#39; | &#39;ייבוא ​​צינור&#39; | &quot;מתוך קובץ&quot;, ובחר את הקובץ המתאים (&quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; עבור סיווג מבוסס פלואורסצנציה , או &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot; לסיווג מבוסס מורפולוגיה). הערה: קבצים אלה מכילים פרוטוקולים לעיבוד תמונה בסיסיים ופילוח גרעיני / תא. בגלל כתם Hoechst אחיד הנוכחי על פני תאים אלה, גרעינים היו מפולח ומגודל, ולאחר מכן השתמשו כדי להסוות את התמונה כדי לאפשר פילוח של גרעינים עם עוצמות נמוכות יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את צינור סיווג מבוסס פלואורסצנטי לסווג תאים כמו גם H3255 או CCD-19Lu מבוסס על עוצמת eGFP, וכדי לחשב תכונות המורפולוגיה. הערה: CCDתאים Lu -19 היו transduce עם GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הצינור מורפולוגיה מבוסס סיווג לפלח גרעינים ותאים, וכדי לחשב תכונות מורפולוגיה. הערה: ניתוח נוסף במורד הזרם ב &#39;CellProfiler אנליסט&#39; נדרש לסיווג. תאים מתים מסווגים באמצעות סיווג מבוסס פלואורסצנטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;הצג הגדרות פלט&#39; בפינה השמאלית התחתונה של המסך. בחר את המיקום של קבצי התמונה לניתוח (&#39;תיקיית קלט ברירת המחדל&#39;) ואת היעד לנתונים שחולצו (&#39;תיקיית פלט ברירת המחדל&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;ניתוח תמונות&#39; כדי להתחיל את הניתוח. כאשר הניתוח הושלם, לחץ על &#39;אישור&#39; ועבור אל &#39;תיקיית פלט ברירת המחדל&#39; כדי להציג את הנתונים המחושבים. הערה: ערכים ותמונות פרמטרים לדוגמה זמינים בקובץ משלים 1-CellProfilerProtocol.pdf . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור סיווג מבוסס מורפולוגיה (בלבד) לעשות את הפעולות הבאות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח &#39;CellProfiler אנליסט&#39; תוכנה, בחר את המאפיינים קובץ מסד נתונים שנוצר CellProfiler, ולחץ על &#39;פתח&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכרטיסייה &#39;מסווג&#39; בפינה השמאלית העליונה של המסך. כדי להתקשר לתמונות אקראיות מהתא, לחץ על &#39;אחזור&#39;; תמונות יופיעו בחלון ללא סיווג. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסווג את התאים באופן חיובי (H3255) או שלילי (CCD-19Lu) על ידי בחירה וגרירת תאים לסל המתאים (ראה קובץ משלים 2-Pipeline.pdf : איור B ). לאחר סיווג לפחות 50 תאים לכל תת-אוכלוסייה, לחץ על &#39;רכבת מסווג&#39; ולאחר מכן לחץ על &#39;בדוק התקדמות&#39;. הערה: התאים מסווגים באמצעות אלגוריתם למידה אקראי של מכונה. אם הדיוק אינו מעל סף מאושר (&gt; 90%), ייתכן שיהיה צורך לחזור ולבצע אופטימיזציה של פילוח תאים על &#39;CellProfiler&#39;, או שהתאים לא יהיו אידיאליים עבור classiגוסס על ידי מורפולוגיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;ציון הכל&#39; כדי ליצור טבלה עם ספירת תאים עבור כל תת-אוכלוסייה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kanemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+proliferative+activity+of+human+fetal+neural+stem/progenitor+cells+using+indirect+measurements+of+viable+cells+based+on+cellular+metabolic+activity.">Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity.</a> J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).</li><li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+pH+dependence+of+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay.">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li><li>Hsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+polyphenols+induce+differentiation+and+proliferation+in+epidermal+keratinocytes.">Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).</li><li>Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+image-based+profiling+of+perturbations.">Applications in image-based profiling of perturbations.</a> Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).</li><li>Sero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+the+microenvironment+regulate+nuclear+translocation+of+NF-kappaB+in+breast+epithelial+and+tumor+cells.">Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells.</a> Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).</li><li>Chen, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclassification+of+prostate+cancer+circulating+tumor+cells+by+nuclear+size+reveals+very+small+nuclear+circulating+tumor+cells+in+patients+with+visceral+metastases.">Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases.</a> Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).</li><li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound.">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li><li>Paraiso, K. H., Smalley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast-mediated+drug+resistance+in+cancer.">Fibroblast-mediated drug resistance in cancer.</a> Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).</li><li>Dao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+interactive+data+exploration,+analysis+and+classification+of+large+biological+image+sets.">CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).</li><li>Garvey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+image-based+method+for+quantitatively+studying+context-dependent+cell+population+dynamics.">A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics.</a> Sci Rep. 6, 29752 (2016).</li><li>Juarez, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+differences+in+cell+line+population+dynamics+using+CellPD.">Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD.</a> BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).</li><li>Mumenthaler, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Microenvironmental+Heterogeneity+on+the+Evolution+of+Drug+Resistance+in+Cancer+Cells.">The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells.</a> Cancer Inform. 14, 19-31 (2015).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

מבחני תאים מבוססי כבר workhorse במחקר בסיסי ופיתוח סמים הגדרות. עם זאת, המגבלות של מבחני תקן אלה הפכו בולטים יותר ויותר עם חוסר התאמה בין נתונים חוץ גופית לבין נתונים קליניים וכישלון של רוב התרופות לקבל אישור ה- FDA. כאן, אנו מציגים שיטה חדשה לשימוש הדמיה כמותית בו זמנית לנתח פנוטיפים heterocellular בתגובה לגירויים סביבתיים רלוונטיים, שיתוף המתרחשים. מבחני מסורתיים המבוססים על תא המשמשים למדוד כדאיות התא כוללים: מבחני הרחקה כחול טריפאן, MTT / MTS, ו Annexin V-FITC זרימת cytometry מכתים. Trypan כחול מבחני הרחקה, בעוד פשוט וזול, דורשים מספר גדול של תאים, הם זמן רב, והם מושפעים לעתים קרובות על ידי המשתמש הטיה 1 . MTT ו MTS מבחני בעקיפין למדוד כדאיות התא באמצעות מדידות של קצב חילוף החומרים המיטוכונדריאלי. עם זאת, פעילות מטבוליתTy של תאים יכול להיות מושפע מתנאי תרבות שונים (כגון מדיה או ריכוז חמצן), אשר מוביל לתוצאות לא מדויקות ומונע סטנדרטיזציה על פני סוגי תאים ותנאים 2 , 3 . חסרון גדול נוסף של טכניקות אלה הוא חוסר היכולת שלהם להבחין בין סוגי תאים מרובים - רוב המערכות הביולוגיות הן הטרוסלולרית. בעוד שיטות cytometry הזרימה יש את היכולת להבחין בין אוכלוסיות תאים מרובים, תוויות תאים נדרשים, הדגימה דינמי הוא מאתגר, וכאשר משתמשים בתאים חסיד, יישום זה הופך להיות זמן רב שגיאה נוטה. פנוטיפים סלולריים חשובים אחרים, כולל שינויים מורפולוגיים, מתרחשים בתגובה לגירויים סביבתיים, אך אינם נלכדים על ידי מבחני תא מסורתיים. פרופילים תא פרופיל באמצעות אפיון מורפולוגי מיפוי הדמיון על פני דגימות הוא כלי רב עוצמה, משוחדת עם aכדי לספק תובנות חדשות לתוך היבטים רבים של מחקר בסיסי ו translational, כולל ביולוגיה תא בסיסי וגילוי סמים 4 . יתר על כן, מורפולוגיה תא הגידול הוצגה כדי לתאם עם תת סוגי הגידול 5 תוקפנות 6 . לפיכך, יש עניין רב ללמוד תכונות אלה הסלולר וכיצד הם מתייחסים perturbations סביבתיים ספציפיים. בנוסף, ניתן להשתמש בהבדלים בתכונות מורפולוגיות כדי להפלות בין subpopulations במערכות שיתוף תרבות. תאים תיוג fluorescently יש downfalls ( כלומר שינוי מאפייני התא הגלום, זמן רב) ולכן שיטות נוספות כדי לסווג סוגי תאים הם יתרון. מיקרוסקופיה מבוססי הדמיה היא שיטה חלופית עבור פרופיל פנוטיפים הסלולר בצורה מרובעת, כמותית, וחזקה. בכתב יד זה, אנו מיישמים צינור הדמיה כמותי שלנו כדי להדגיש את evolutioדינאמיקה nary של אוכלוסיות תאים הטרוגניות בתוך הגידול. אנו מתמקדים באינטראקציה בין תאי סרטן ריאות לא-קטנים (NSCLC) ובין סרטן פיברובלסטים (CAF), סרטן השד הנפוץ ביותר שנמצא בגידולים. CAFs היו מעורבים ייזום הגידול, התקדמות, תגובה טיפולית; לכן, ביצוע מבחני פנוטיפי על תאים סרטניים בהעדר CAFs יכול להיות מטעה 7 , 8 , 9 . באופן ספציפי, הערכנו השפעות של CAFs על תאים סרטניים בתגובה ל- erlotinib, מולקולה קטנה המכוונת את ה- Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) המשמש לעתים קרובות בטיפול קליני ב- NSCLC. השתמשנו בפלטפורמת סינון תוכן גבוהה ובתוכנות ניתוח התמונה הנלוות שלה לצורך הערכה; עם זאת, בניסיון להפוך את המתודולוגיה לזמינה עבור חוקרים אחרים פיתחנו גם פרוטוקול במורד הזרם באמצעות תוכנת קוד פתוח:אנליסטים סלופרופיל 10 ו - CellProfiler 11 . רוב מבוססי תמונה גבוהה תוכן מבחני ההקרנה מנותחים עם תוכנה ממוסחר ספציפי למודל מכשיר נתון. תוצאות קשה לשכפל במעבדות אחרות עם תוכנות שונות, כי האלגוריתמים הבסיסיים הם לעתים קרובות קניינית. באמצעות הצינור מבוסס התמונה, התפשטות תאים, מוות, מורפולוגיה של כל subpopulation של תרבות הטרוקלולרית בתגובה לטיפול תרופתי באמצעות פלואורסצנציה וגם מורפולוגיה מבוססי סיווג נמדדו. הפרוטוקול הבא מספק מתודולוגיה איתנה לחקר תהליכים תאיים מורכבים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:191px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">FBS</td>
			<td style="width:127px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15-140-122</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20 slides with trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450003</td>
			<td>cell counter slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">96-well plates</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td>clear bottom black plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Erlotinib</td>
			<td style="width:127px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">E-4007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">DMSO</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">317275-100ML</td>
			<td>solution to resuspend drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Hoechst</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">H21491</td>
			<td>nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td>dead cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Cell Tracker Orange CMRA</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
			<td>whole cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Operetta high content imaging system</td>
			<td style="width:127px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:127px;">Broad Institue</td>
			<td style="width:119px;">version 2.2.0 (rev 9969f42)</td>
			<td>http://cellprofiler.org/releases/</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &#186;C at 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:240px;">10 cm2 cell culture plates</td>
			<td style="width:127px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

תהליכים סלולריים הם מורכבים הנובעים משחק הגומלין בין סוגי תאים מרובים וסביבתם. קיימות ביולוגיה תא טכניקות לעתים קרובות אינם מאפשרים פרשנות מדויקת של משחק זה. באמצעות גישה כמותית מבוסס הדמיה, אנו מציגים פרוטוקול תוכן גבוהה לאפיון התגובות פנוטיפי דינמי ( כלומר מורפולוגיה שינויים, התפשטות, אפופטוזיס) של אוכלוסיות תאים הטרוגנית לשינויים גירויים סביבתיים. אנו מדגישים את היכולת שלנו להבחין בין סוגי תאים בהתבסס על עוצמת הקרינה או תכונות המורפולוגיה הטמון בהתאם ליישום. פלטפורמה זו מאפשרת אפיון מקיף יותר של התגובה subpopulation כדי הפרעות תוך ניצול זמן קצר יותר, כמויות קטנות יותר של ריאגנטים, ואת הסיכוי הנמוך יותר של שגיאה מאשר מבחני התא המסורתית ביולוגיה. עם זאת, במקרים מסוימים, אוכלוסיות תאים עשוי להיות קשה לזהות לכמת מבוסס על cellu מורכביםLar תכונות ידרוש פתרון בעיות נוספות; אנו מדגישים חלק מהנסיבות הללו בפרוטוקול. אנו מדגימים יישום זה באמצעות תגובה לתרופה במודל הסרטן; עם זאת, זה יכול בקלות להיות מיושם באופן רחב יותר על תהליכים פיזיולוגיים אחרים. פרוטוקול זה מאפשר אחד לזהות subpopulations בתוך מערכת תרבות משותפת ולאפיין את התגובה של כל אחד לגירויים חיצוניים.

יצרנו תמונה להגדיר המורכב של 25 שדות / טוב, 54 בארות / צלחת (3 אוכלוסיות תאים x 6 ריכוז סמים x 3 משכפל), על פני שלוש צלחות עבור סך של 4,050 תמונות בודדות. התמונה קבוצות שנוצרו במהלך הניסוי נותחו באמצעות תוכנה קניינית (ראה טבלה של חומרים) כדי לחלץ תכונות כמותיות שונות של תאים ( כלומר מורפולוגיה, הקרינה) אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לסווג subpopulations תא. עם זאת, בגלל התוכנה המסחריים בשימוש יש גישה מוגבלת, צינורות downstream דומה CellProfiler ו CellProfiler אנליסטים נוצרו. סיווג הטרוקלרי לתוך תת אוכלוסיות גרעינים זוהו ופלוח על בסיס כתם ה- DNA (כאן Hoechst) ואוכלוסיות תאים סווגו או מבוסס על פלואורסצנציה או מוRphology ( איור 1 ). עבור סיווג מבוסס פלואורסצנציה, fibroblasts (CCD-19Lu) היו transduced בעבר עם lentivirus GFP. רמות העוצמה של ה- GFP נמדדו עבור כל גרעין, ואלה שחושבו מעל הסף המקובל (על סמך אות הרקע) סווגו כ- CCD-19Lu בעוד שאלו מתחת לזיהוי תאי הגידול (H3255). עבור סיווג מבוסס מורפולוגיה, תאים היו מוכתמים בעבר עם כתם הסלולר הלא רעיל (ראה טבלה של חומרים) וזה שימש כדי לזהות קטע את הציטופלסמה. אלגוריתם לומדת מכונה הוכשר עם ~ 50-100 תאים מכל האוכלוסייה. זיהו תכונות מורפולוגיות שהיו שונות באופן משמעותי בין האוכלוסיות, אשר שימשו לאחר מכן לעיצוב מסווג ליניארי כדי להבחין בין CCD-19Lu לבין תאים H3255. הקרינה ו מורפולוגיה סיווג פרוטוקולים היו 97.4% (n = 1403) concordant להבחין בין שני popul תאAtions בתנאים מטופלים ו 92.5% (n = 916) קונקורדנט בתנאים טיפול תרופתי (1 מיקרומטר erlotinib) ( איור 2 ). אנליזה פנוטיפית של תת אוכלוסיות בנוסף להפלות בין סוגי תאים, אנו מכוונים לאפיין תכונות פנוטיפיות של כל subpopulation. מבחני מרבב חוסך זמן ריאגנטים, מוסיף עקביות, ומספק מידע נוסף לגבי המערכת הנלמדת. ישנם רבים פוטנציאליים פנוטיפי פלטי ואחד צריך לבחור אותם בהתבסס על שאלות של עניין. כאן, נחקרו שינויים במורפולוגיה התא ובמצב החיוניות בתגובה לטיפול ארלוטיניב. לאחר שלושה ימים של טיפול תרופתי, ירידה באזור הגרעיני וגידול באזור הסלולר של תאים H3255 ( איור 3 א ) נצפתה. ההבדל הממוצע באזור הגרעיני ביןאוכלוסיית &quot;לא סמים&quot; ו &quot;סמים&quot; נמצאה מובהקת סטטיסטית באמצעות מבחן דו - צדדי דו - צדדי (שוני) ( p = 7.92 x 10 -16 ). אנו משערים כי תצפית זו היא תגובה סלולרית ללחץ שהוטל על ידי טיפול תרופתי. זה גם מעניין ללמוד האם לתרופה יש ציטוטוקסי ( כלומר עלייה במספר התאים המתים לאורך זמן) או cytostatic ( כלומר ירידה במספר לידות תאים לאורך זמן) השפעה על תאים, שכן יש לכך השפעה קלינית עמוקה. לדוגמה, אפקט התרופה cytostatic גורם מעצר הצמיחה עדיין לא לחסל את התאים מן הגידול, ולכן יש פוטנציאל תאים סרטניים כדי לתגמל את התפשטות תאים לאחר התרופה מוסר. תופעות לוואי יכולות להיות לעיתים קרובות הקשר, ריכוז ותלות בסוג התא. ראינו בעבר erlotinib לעורר תגובה ציטוטוקסית בסוג תא אחד, תוך הצגת ACתגובה ytostatic אחרת 13 . מבחני הכדאיות המסורתית פלט מספר תא יחסית ולכן, לא להפלות בין מעצרים הצמיחה למוות התא. כאן, תאים מתים זוהו על בסיס propidium יודיד כתם ( איור 3 ב ). ההשפעות ציטוטוקסיות ו cytostatic של erlotinib על H3255 תאים נצפו, עם עלייה במספר מקרי המוות וירידה במספר הלידות לאחר טיפול תרופתי ( איור 3 ג ). ראוי לציין כי מספר התאים המתים טיפות לאחר יום 1 כנראה בשל פינוי התא. תאי CCD-19Lu לא הושפעו מהתרופה. יתרון נוסף של פלטפורמה זו הוא יצירת נתונים כמותיים. לדוגמה, בניסוי המשותף שלנו, תת-תזונה ראשונית של 1,118 (75.8%) H3255 תאים נמצאה 2,817 (87.9%) או 396 (57.2%) לאחר שלושה ימים ללא או עם erlotinאיב, בהתאמה ( איור 4 ). מכיוון שאנו יכולים לייצר ספירת תאים בפועל במקום אחוז יחסי (כמו בשיטות cytometry זרימה), אנו מסיקים כי השינוי בהרכב במהלך הטיפול התרופתי נובע לירידה בתאי H3255 ולא עלייה CCD-19Lu. זה לא שווה שום דבר כי שיעורי המוות ניתן לזלזל בשל פינוי התא, אשר קשה להעריך ניסויי סביר שונה בין סוגי תאים. <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול ניתוח התמונות. שני פוטנציאל ניתוח הזרם התמונה צינורות כדי לסווג אוכלוסיות heterocellular באמצעות או סיווג מבוסס מורפולוגיה או סיווג מבוסס פלואורסצנטי. סולם ברים = 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">לחץ עליה</a>דואר כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> איור 2: קונקורדנציה בין מורפולוגיה סיווג מבוסס פלואורסצנטי. ( א ) קונקורדנציה העלילה המציג את החפיפה של שני פרוטוקולים סיווג. תאים אלה סווגו כמו H3255 באמצעות סיווג הן מורפולוגיה ו פלואורסצנטי מבוסס. שני הפרוטוקולים היו בהסכמה, עם סיווג עבור 97.4% (n = 1403) של תאים לא מטופלים ו 92.5% (n = 916) של תאים שטופלו erlotinib (הערה: שטח לבן קטן מדי כדי לדמיין). ( ב ) 10X תמונות המתארות דוגמאות של קונקורדנציה טובה וענייה בין מבוססי פלואורסצנציה מבוססי סיווג מורפולוגיה. החצים הלבנים מצביעים על תאים שלא היו מסווגים בין פלטפורמות. קלט תמונה: כחול - גרעינים (Hoechst); ירוק - CCD19Lu (GFP). קלאסיתמונות פיקציה: אדום - H3255; ירוק - CCD-19Lu. סולם בר = 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> איור 3: מדידות Pnotypic מרבב מתוך התקנה ניסויית יחיד. ( א ) תכונות מורפולוגיות, כגון גרעינים ואזור התא, חושבו ברמת התא אחת בנוכחות ובהיעדר התרופה. הערה: אזורים סלולריים שגודלם קטן מ -100 מיקרומטר 2 נחשבו לפסולת ולא נכללו בניתוחים. תיבות של קופסאות בחציון חציון עם טווחי רבעונים ראשון ושלישי ו- 95% סרגלי שגיאות בביטחון. ( B ) H3255 (כחול) ו CCD-19Lu (ירוק) תאים היו שיתוף בתרבית תאים מתים זוהו על בסיס עוצמת propidIumide iumide כתם (אדום) ו צילמו באמצעות מטרה 10X. סרגל קנה מידה = 1 מ&quot;מ (לוח עליון); 100 מיקרומטר (תמונות תחתית). ( ג ) סך הכל של תאים חיים ומתים חושבו במשך שלושה ימים עם או ללא טיפול תרופתי, עם ירידה ברורה במספר תאים חיים להגדיל תאים מתים עם תוספת של erlotinib. ברים שגיאה מייצגים שגיאת תקן של הממוצע מבוסס על שלושה משכפל. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> איור 4: דינמיקה subpopulation לאורך זמן. נציג 10X תמונות של בארות המכילות H3255 (כחול) ו CCD-19Lu (ירוק) ביום 0 או יום 3 עם וללא תרופה. תאים השייכים לכל subpopulation נספרים תרשימים עוגה יחסית להראות אתשינוי טוטאלי בהרכב האוכלוסייה על פני דגימות. סולם ברים = 1 מ&quot;מ (לוחות באמצע, shpwn ב, eftmost פאנל), 1 מ&quot;מ (תמונה עליונה), 100 מיקרומטר (תמונות תחתית). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques at JoVE.com

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

פיתחנו פרוטוקול חדש לחקר הדינמיקה האוכלוסייה הטרוקלולרית בתגובה הפרעות. כתב יד זה מתאר פלטפורמה מבוססת הדמיה המייצרת מערכי נתונים כמותיים לאפיון סימולטני של פנוטיפים סלולריים מרובים של אוכלוסיות הטרוסלריות בצורה חזקה.

אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

discrimination-characterization-heterocellular-populations-using

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Views.  University of Southern California (USC).  פיתחנו פרוטוקול חדש לחקר הדינמיקה האוכלוסייה הטרוקלולרית בתגובה הפרעות. כתב יד זה מתאר פלטפורמה מבוססת הדמיה המייצרת מערכי נתונים כמותיים לאפיון סימולטני של פנוטיפים סלולריים מרובים של אוכלוסיות הטרוסלריות בצורה חזקה. 

Video: Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

טכניקות הדמיה Ca 2 + איתות זרע אנושי

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

מדידת תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביציות

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

אפיון של אירועים קלציפיקציה שימוש אופטי חיה מיקרוסקופית אלקטרונים טכניקות בתוך ימית תולעת-שפופרת

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...