Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) Subvenciones U54CA143798 y U54CA143907 para establecer Ciencias Físicas-Oncología Centros (PS-OC) en el Dana-Farber Cancer Institute y la Universidad del Sur de California, respectivamente. SM Mumenthaler recibió un premio de transnetwork de PS-OC que apoyó parte de este trabajo. Quisiéramos expresar nuestra más profunda gratitud a nuestros partidarios filantrópicos, en particular a la familia Stephenson, Emmet, Toni y Tessa, por su donación de la plataforma Operetta HCS. También queremos agradecer a J. Foo por orientación, y al Centro de Medicina Aplicada miembros del equipo de Medicina: D. Agus para la orientación clínica y mentoría, K. Patsch para las discusiones significativas con el diseño experimental, R. Rawat para la ayuda en los protocolos de análisis de imágenes , J. Katz para la asistencia técnica con la Operetta, y P. Macklin y D. Ruderman para las discusiones provechosas y la regeneración.

1. Cultivo celular NOTA: Aquí se investigaron las respuestas fenotípicas de células NSCLC (H3255) al agente de direccionamiento de EGFR, erlotinib, cuando se co-cultivaron con fibroblastos pulmonares (CCD-19Lu GFP). Para el mismo conjunto de datos, basada en la fluorescencia y la clasificación basada en la morfología de las dos poblaciones de células (H3255 y CCD-19Lu GFP) para ejemplificar su concordancia se realizó. Sin embargo, sólo se debe utilizar un método de clasificación y debe elegirse sobre la base de la aplicación. <ol><li> Preparar 500 ml de RPMI-1640 suplementado con FBS inactivado por calor al 10% y penicilina / estreptomicina al 1%. NOTA: El medio de crecimiento y los suplementos se pueden reemplazar según sea necesario para otros tipos de células. </li><li> Cultivar células en placas de 10 cm 3 como poblaciones puras en CO 2 al 5% a 37 ° C y pasar a una proporción apropiada cada 3-4 días. </li></ol> 2. Preparación de células <ol><li> Para preparar una suspensión celular, eliminar cEll y las células de lavado con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS). </li><li> Aspirar fuera del PBS, añadir 1 mL de 0,05% de tripsina calentada a 37 ° C e incubar durante 5 min (o hasta que las células ya no se adhieren a la placa) a 37 ° C. </li><li> Para neutralizar la tripsina, añadir 4 ml de RPMI a las placas H3255 y CCD-19Lu GFP y pipetear las soluciones celulares en tubos cónicos de 15 ml. </li><li> Centrifugar las células a 150 xg durante 5 minutos a RT. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender los sedimentos celulares en 10 ml de medio RPMI en tubos cónicos para preparar la siembra. </li></ol> 3. Revestimiento de células <ol><li> Cuente las células para estandarizar la siembra. <ol><li> Invertir tubos para mezclar las células en solución. Pipetear 10 μl de cada suspensión de células en un tubo de microcentrífuga y añadir 10 μl de azul de tripano. </li><li> Pipetee 10 μL de esta solución en una diapositiva de conteo de células e inserte en un contador de células automatizado. NOTA: Otros métodos de recuento celular ( es decir,. Hemocitómetro). </li><li> Repita el recuento de células por lo menos tres veces, o hasta que los recuentos obtenidos sean consistentes. </li></ol></li><li> Las células de semilla en una placa de varios pocillos NOTA: El número de placas a sembrar depende del número de puntos de tiempo que se visualizarán. Alternativamente, una placa se puede volver a imaginar con el tiempo si las células se transducen con histona-2B-GFP (u otras tinciones nucleares lentivirales estables que proporcionan una segmentación nuclear adecuada). <ol><li> Semilla de un total de 1.500 células / pocillo en 100 μ l de RPMI. Preparar tres suspensiones de células para la placa de tres poblaciones de células: H3255, CCD-19Lu GFP, y 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Realice cada uno por triplicado con configuraciones de placa idénticas para cada punto de tiempo. NOTA: Las densidades de siembra iniciales se deben optimizar para cada línea celular y tamaño de placa. </li><li> Seed células en placas de 3 x 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Incubar las células O / N a 37 ° C, 5% de CO 2 . </li></ol> &lt;Li </ol> 4. Dosificación de fármacos <ol><li> Añadir DMSO a erlotinib en polvo para hacer una solución madre de erlotinib final de 10 mM de concentración. NOTA: El fármaco puede ser sustituido como se desee. </li><li> Diluir el fármaco con medio de cultivo celular a 2x la concentración final con la concentración final más alta a 10 μM y diluir en serie cuatro veces a una relación 1:10, para un total de cinco concentraciones de fármaco y un control sin fármaco. NOTA: Si la concentración de DMSO es igual o superior a 0,1% v / v a la dosis de fármaco más alta, el control de fármaco no debe contener una cantidad equivalente de DMSO para asegurar que los efectos observados observados no se deban a la toxicidad de DMSO. </li><li> Pipetear 100 μl de solución de fármaco en el pocillo apropiado para una concentración final de fármaco de 1x diluido en medio. </li></ol> 5. Adquisición de imágenes NOTA: Las imágenes fueron adquiridas en los días 0, 2 y 3. Dependiendo de los tipos celulares y de los procesos celulares estudiados, oSe pueden estudiar los puntos temporales deseados. <ol><li> Mancha las células para preparar la imagen. <ol><li> Preparar la solución de colorante a las siguientes concentraciones finales. <ol><li> Para la clasificación basada en fluorescencia, preparar tinción nuclear de 5 μg / mL y tinción de células muertas 5 μM en PBS (ver Tabla de Materiales ). </li><li> Para la clasificación basada en la morfología, preparar tinción nuclear de 5 μg / mL, tinción de células muertas 5 μM y tinción celular 5 μM en PBS (ver Tabla de Materiales ). </li></ol></li><li> Añadir 20 μL de solución de colorante a cada pocillo. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C protegido de la luz. </li></ol></li><li> Optimizar y adquirir imágenes. <ol><li> Retire la placa del pozo de la incubadora, limpie la parte inferior de la placa con EtOH al 70% y coloque la placa en la cámara de imagen. </li><li> En la pestaña &#39;Configuración&#39;, haga clic en el botón &#39;+&#39; en &#39;Selección de canales&#39; para agregar canales(Es decir , campos brillantes, tinción nuclear, tinción de células muertas, GFP y señales RFP). </li><li> Haga clic en &#39;Layout Selection&#39; (selección de disposición) y tome imágenes de prueba empiladas en z cada 2 μm comenzando en 0 μm y terminando en 20 μm para identificar el plano de enfoque. Introduzca esta distancia para cada canal bajo &#39;Altura&#39;. </li><li> Haga clic en &quot;Instantánea&quot; en cada canal para evaluar las intensidades y optimizar los tiempos de exposición. Ingrese valores más altos o más bajos en &quot;Hora&quot; según sea necesario. </li><li> En el lado derecho de la pantalla, resalte los pozos apropiados (que se van a visualizar) en el esquema de la placa. En el esquema de pozos a continuación, resalte los veinticinco campos que se van a tomar imágenes de una manera similar. </li><li> En &quot;Ejecutar experimento&quot;, identifique la placa en &quot;Nombre de placa&quot; en la pestaña izquierda y haga clic en el botón &quot;Inicio&quot; (debajo) para ejecutar el protocolo de adquisición de imágenes con un objetivo 10X para generar imágenes TIFF en escala de grises en los canales mencionados. NOTA: paso a paso instRucciones para el protocolo de imagen pueden diferir entre los instrumentos, pero los valores de los parámetros deben ser optimizados. </li><li> Repita la proyección de imagen en los días dos y tres. </li></ol></li></ol> 6. Análisis de imágenes NOTA: Todo el análisis de imagen se realizó utilizando software propietario. Sin embargo, debido a que esto no es disponible públicamente, los análisis comparables también fueron diseñados en CellProfiler 2.2 y CellProfiler Analyst 2.0, con un breve protocolo listado a continuación y un protocolo detallado proporcionado como material complementario (las imágenes de prueba ya están cargadas en las tuberías para probar el flujo de trabajo). Las imágenes de este experimento se agruparon en una base por pozo para que cada pocillo pudiera cargarse individualmente. Los pipelines de CellProfiler a continuación contienen una expresión regular que analiza la información de metadatos de cada nombre de archivo de imagen y permite que las imágenes se agrupan aún más por canal. <ol><li> Descargue e instale el software de código abierto: &#39;CellProfiler9; Y &#39;CellProfiler Analyst&#39;. Acepte todas las opciones y complementos predeterminados durante la instalación. </li><li> Clasificar los cultivos heterocelulares en subpoblaciones. <ol><li> Abra el software &#39;CellProfiler&#39;, haga clic en &#39;Archivo&#39; | &#39;Pipeline de importación&#39; | &#39;From File&#39; y seleccione el archivo apropiado (&quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; para la clasificación basada en fluorescencia , o &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot; para la clasificación basada en morfología). NOTA: Estos archivos contienen protocolos para procesamiento básico de imágenes y segmentación de núcleos / células. Debido a la irregular mancha Hoechst presente a través de estas células, los núcleos se segmentaron y agrandaron, y luego se utiliza para enmascarar la imagen para permitir la segmentación de núcleos con intensidades más bajas. <ol><li> Seleccione el gasoducto de clasificación basado en fluorescencia para clasificar las células como H3255 o CCD-19Lu sobre la base de la intensidad eGFP y para calcular las características morfológicas. NOTA: CCD-19Lu células fueron transducidas con GFP. </li><li> Seleccione el gasoducto de clasificación basado en morfología para segmentar núcleos y células y para calcular características morfológicas. NOTA: Para la clasificación es necesario realizar análisis adicionales en el &#39;CellProfiler Analyst&#39;. Las células muertas se clasifican mediante clasificación basada en fluorescencia. </li></ol></li><li> Haga clic en &quot;Ver configuración de salida&quot; en la parte inferior izquierda de la pantalla. Seleccione la ubicación de los archivos de imagen para análisis (&#39;Default Input Folder&#39;) y el destino de los datos extraídos (&#39;Default Output Folder&#39;). </li><li> Haga clic en &#39;Analizar imágenes&#39; para comenzar el análisis. Una vez finalizado el análisis, haga clic en &quot;Aceptar&quot; y vaya a la &quot;Carpeta de salida predeterminada&quot; para ver los datos calculados. NOTA: Los valores de los parámetros de ejemplo y las imágenes están disponibles en el archivo suplementario 1-CellProfilerProtocol.pdf . </li><li> Para la clasificación basada en morfología (solamente) haga lo siguiente. <ol><li> Abra el software &#39;CellProfiler Analyst&#39;, seleccione el archivo de propiedades de la base de datos generado en CellProfiler y haga clic en &#39;Abrir&#39;. </li><li> Haga clic en la pestaña &#39;Clasificador&#39; en la parte superior izquierda de la pantalla. Para llamar a las imágenes celulares aleatorias del experimento, haga clic en &#39;Buscar&#39;; Las imágenes aparecerán en la ventana sin clasificar. </li></ol></li><li> Clasifique manualmente las células como positivas (H3255) o negativas (CCD-19Lu) seleccionando y arrastrando las celdas a la casilla correspondiente (vea el archivo suplementario 2-Pipeline.pdf : Figura B ). Después de clasificar al menos 50 células por subpoblación, haga clic en &#39;Train Classifier&#39; y, a continuación, en &#39;Check Progress&#39;. NOTA: Las celdas se clasifican a través de un algoritmo de aprendizaje de máquina forestal aleatoria supervisada por el usuario [ 12] . Si la precisión no está por encima del umbral aprobado (&gt; 90%), puede ser necesario retroceder y optimizar la segmentación celular en &#39;CellProfiler&#39;, o las células pueden no ser ideales para classiFying por la morfología. </li><li> Haga clic en &quot;Puntuación completa&quot; para generar una tabla con recuentos de celdas para cada subpoblación. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kanemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+proliferative+activity+of+human+fetal+neural+stem/progenitor+cells+using+indirect+measurements+of+viable+cells+based+on+cellular+metabolic+activity.">Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity.</a> J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).</li><li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+pH+dependence+of+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay.">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li><li>Hsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+polyphenols+induce+differentiation+and+proliferation+in+epidermal+keratinocytes.">Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).</li><li>Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+image-based+profiling+of+perturbations.">Applications in image-based profiling of perturbations.</a> Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).</li><li>Sero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+the+microenvironment+regulate+nuclear+translocation+of+NF-kappaB+in+breast+epithelial+and+tumor+cells.">Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells.</a> Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).</li><li>Chen, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclassification+of+prostate+cancer+circulating+tumor+cells+by+nuclear+size+reveals+very+small+nuclear+circulating+tumor+cells+in+patients+with+visceral+metastases.">Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases.</a> Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).</li><li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound.">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li><li>Paraiso, K. H., Smalley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast-mediated+drug+resistance+in+cancer.">Fibroblast-mediated drug resistance in cancer.</a> Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).</li><li>Dao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+interactive+data+exploration,+analysis+and+classification+of+large+biological+image+sets.">CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).</li><li>Garvey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+image-based+method+for+quantitatively+studying+context-dependent+cell+population+dynamics.">A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics.</a> Sci Rep. 6, 29752 (2016).</li><li>Juarez, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+differences+in+cell+line+population+dynamics+using+CellPD.">Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD.</a> BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).</li><li>Mumenthaler, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Microenvironmental+Heterogeneity+on+the+Evolution+of+Drug+Resistance+in+Cancer+Cells.">The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells.</a> Cancer Inform. 14, 19-31 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

Ensayos basados ​​en células han sido un caballo de batalla en la investigación básica y la configuración del desarrollo de drogas. Sin embargo, las limitaciones de estos ensayos estándar se han hecho cada vez más evidentes con la discordancia entre los datos in vitro y clínicos y el fracaso de la mayoría de los fármacos para recibir la aprobación de la FDA. Aquí, presentamos un nuevo método para la utilización de imágenes cuantitativas para analizar simultáneamente los fenotipos heterocelulares en respuesta a los estímulos ambientales pertinentes co-occurring. Los ensayos basados ​​en células tradicionales que se usan para medir la viabilidad celular incluyen: ensayos de exclusión de azul de tripán, tinción con citometría de flujo con MTT / MTS y anexina V-FITC. Trypan azul exclusión ensayos, mientras que simple y barato, requieren un gran número de células, son mucho tiempo, y son a menudo influenciados por el usuario sesgo 1 . MTT y MTS indirectamente medir la viabilidad celular a través de mediciones de la tasa metabólica mitocondrial. Sin embargo, la actividad metabólica(Por ejemplo, los medios de comunicación o la concentración de oxígeno), lo que conduce a resultados imprecisos y evita la estandarización entre los tipos y condiciones de las células 2 , 3 . Otra desventaja principal de estas técnicas es su incapacidad para distinguir entre tipos de células múltiples - la mayoría de los sistemas biológicos son heterocelulares. Aunque los métodos de citometría de flujo tienen la capacidad de distinguir entre poblaciones de células múltiples, se requieren etiquetas de células, el muestreo dinámico es desafiante y cuando se usan células adherentes, esta aplicación se convierte en mucho tiempo y propensa a errores. Otros importantes fenotipos celulares, incluyendo los cambios morfológicos, se producen en respuesta a los estímulos ambientales, pero no son capturados por los ensayos basados ​​en células tradicionales. La elaboración de perfiles de los estados de las células a través de la caracterización morfológica y las similitudes de mapeo entre muestras es una herramienta poderosa e imparcial con el aBility para proveer nuevas ideas sobre muchos aspectos de la investigación básica y traslacional, incluyendo la biología celular básica y el descubrimiento de fármacos 4 . Además, se ha demostrado que la morfología de las células tumorales se correlaciona con los subtipos tumorales 5 y la agresividad 6 . Por lo tanto, es de gran interés estudiar estas características celulares y cómo se relacionan con perturbaciones ambientales específicas. Además, se pueden utilizar diferencias en las características morfológicas para discriminar entre subpoblaciones en sistemas de co-cultivo. Las células marcadoras fluorescentes tienen caídas ( es decir, alteran las propiedades celulares inherentes, consumen tiempo) y, por lo tanto, son ventajosos métodos adicionales para clasificar tipos celulares. La imagen basada en microscopía es un método alternativo para perfilar los fenotipos celulares de una manera multiplexada, cuantitativa y robusta. En este manuscrito, aplicamos nuestra tubería de imagen cuantitativa para destacar la evoluciónDinámica de las poblaciones de células heterogéneas dentro de un tumor. Nos centramos en la interacción entre células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y Fibroblastos Asociados al Cáncer (CAF), el tipo de células estromales más prevalente en tumores. Las CAF han sido implicadas en la iniciación tumoral, la progresión y la respuesta terapéutica; Por lo tanto, la realización de ensayos fenotípicos en las células tumorales en ausencia de CAF puede ser engañosa [ 7 , 8 , 9] . Específicamente, evaluamos los efectos de las CAFs en las células tumorales en respuesta al erlotinib, una molécula pequeña dirigida al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) que se usa a menudo en el tratamiento clínico del NSCLC. Utilizamos una plataforma de cribado de alto contenido y su software de análisis de imagen que acompaña a la evaluación; Sin embargo, en un intento de hacer accesible esta metodología a otros investigadores, también hemos desarrollado un protocolo comparable de downstream usando el software de código abierto:CellProfiler 10 y CellProfiler Analyst 11 . La mayoría de los ensayos de detección de alto contenido basados ​​en imágenes se analizan con software comercializado específico para un modelo de instrumento dado. Los resultados son difíciles de replicar en otros laboratorios con software diferente porque los algoritmos subyacentes son a menudo propietarios. Usando este oleoducto basado en imágenes, se midió la proliferación celular, la muerte y la morfología de cada subpoblación de un cultivo heterocelular en respuesta al tratamiento con fármaco utilizando tanto la clasificación basada en fluorescencia como en la morfología. El siguiente protocolo proporciona una metodología robusta para probar procesos celulares complejos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:191px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">FBS</td>
			<td style="width:127px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15-140-122</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20 slides with trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450003</td>
			<td>cell counter slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">96-well plates</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td>clear bottom black plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Erlotinib</td>
			<td style="width:127px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">E-4007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">DMSO</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">317275-100ML</td>
			<td>solution to resuspend drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Hoechst</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">H21491</td>
			<td>nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td>dead cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Cell Tracker Orange CMRA</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
			<td>whole cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Operetta high content imaging system</td>
			<td style="width:127px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:127px;">Broad Institue</td>
			<td style="width:119px;">version 2.2.0 (rev 9969f42)</td>
			<td>http://cellprofiler.org/releases/</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &#186;C at 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:240px;">10 cm2 cell culture plates</td>
			<td style="width:127px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

Los procesos celulares son complejos y resultan de la interacción entre múltiples tipos de células y su entorno. Las técnicas existentes de biología celular a menudo no permiten una interpretación precisa de esta interacción. Utilizando un enfoque basado en imágenes cuantitativas, presentamos un protocolo de alto contenido para caracterizar las respuestas fenotípicas dinámicas ( es decir , cambios morfológicos, proliferación, apoptosis) de poblaciones de células heterogéneas a cambios en los estímulos ambientales. Destacamos nuestra capacidad para distinguir entre tipos de células basadas en la intensidad de fluorescencia o características morfológicas inherentes dependiendo de la aplicación. Esta plataforma permite una caracterización más completa de la respuesta de la subpoblación a la perturbación mientras que utiliza tiempo más corto, cantidades más pequeñas de reactivos, y menor probabilidad de error que los ensayos tradicionales de biología celular. Sin embargo, en algunos casos, las poblaciones celulares pueden ser difíciles de identificar y cuantificar basándose en células complejasY requerirá una solución de problemas adicional; Destacamos algunas de estas circunstancias en el protocolo. Demostramos esta aplicación usando la respuesta al fármaco en un modelo de cáncer; Sin embargo, se puede aplicar con mayor facilidad a otros procesos fisiológicos. Este protocolo permite identificar subpoblaciones dentro de un sistema de co-cultivo y caracterizar la respuesta particular de cada uno a estímulos externos.

Se generó un conjunto de imágenes compuesto por 25 campos / pocillo, 54 pocillos / placa (3 poblaciones de células x 6 concentraciones de fármaco x 3 repeticiones), a través de tres placas para un total de 4.050 imágenes individuales. Los conjuntos de imágenes generadas a lo largo del experimento se analizaron utilizando un software propietario (véase tabla de materiales) para extraer varias propiedades cuantitativas de células ( es decir , morfología, fluorescencia) que podrían utilizarse para clasificar subpoblaciones celulares. Sin embargo, debido a que el software comercial utilizado tiene acceso limitado, se crearon ductos descendentes comparables en CellProfiler y CellProfiler Analyst. Clasificación heterocelular en subpoblaciones Los núcleos fueron identificados y segmentados en base a la tinción de ADN (aquí Hoechst) y las poblaciones de células se clasificaron basados ​​en fluorescencia o mo( Figura 1 ). Para la clasificación basada en la fluorescencia, los fibroblastos (CCD-19Lu) se transdujeron previamente con GFP-lentivirus. Los niveles de intensidad GFP se midieron para cada núcleo, y los que se calcularon por encima del umbral aceptado (basado en la señal de fondo) se clasificaron como CCD-19Lu mientras que los siguientes fueron identificados como células tumorales (H3255). Para la clasificación basada en morfología, las células se tiñeron previamente con una tinción celular no tóxica (véase la tabla de materiales) y se utilizó para identificar y segmentar el citoplasma. Un algoritmo de aprendizaje de la máquina fue entrenado con ~ 50-100 células de cada población. Se identificaron características morfológicas que eran significativamente diferentes entre las poblaciones, que se utilizaron entonces para diseñar un clasificador lineal para distinguir entre células CCD-19Lu y H3255. Los protocolos de clasificación de fluorescencia y morfología fueron 97,4% (n = 1403) concordantes en distinguir entre las dos poblaciones de célulasEn condiciones no tratadas y 92,5% (n = 916) concordante en las condiciones tratadas con fármacos (erlotinib 1 μM) ( Figura 2 ). Análisis fenotípicos de subpoblaciones Además de la discriminación entre los tipos de células, se trató de caracterizar las propiedades fenotípicas de cada subpoblación. Los ensayos de multiplexación ahorran tiempo y reactivos, aportan consistencia y proporcionan información adicional sobre el sistema que se está estudiando. Hay muchos potenciales resultados fenotípicos y uno debe elegir basados ​​en las preguntas de interés. Aquí, se investigaron los cambios en la morfología celular y el estado de viabilidad en respuesta al tratamiento con erlotinib. Después de tres días de tratamiento con fármaco, se observó una disminución en el área nuclear y un aumento en el área celular de las células H3255 ( Figura 3A ). La diferencia media en el área nuclear entreSe encontró que las poblaciones tratadas con &quot;fármaco sin fármaco&quot; y &quot;fármaco&quot; eran estadísticamente significativas a través de una prueba t de dos caras tipo 2 (varianza igual) ( p = 7,92 x 10 -16 ). Se plantea la hipótesis de que esta observación es una respuesta celular al estrés impuesto por el tratamiento farmacológico. También es de interés estudiar si un fármaco tiene un efecto citotóxico ( es decir, aumento del número de células muertas en el tiempo) o citostático ( es decir, disminución del número de nacimientos celulares en el tiempo), ya que esto tiene un impacto clínico profundo. Por ejemplo, un efecto citostático de fármaco induce la detención del crecimiento pero no elimina las células del tumor, por lo que existe el potencial de que las células cancerosas reinicien la proliferación celular una vez que se elimina el fármaco. Los efectos de la droga a menudo pueden ser el contexto, la concentración y el tipo de células dependientes. Anteriormente se observó erlotinib provocando una respuesta citotóxica en un tipo de célula, mientras que mostrando acRespuesta ytostática en otro 13 . Los ensayos de viabilidad tradicional producen el número relativo de células y, por tanto, no discriminan entre los arrestos por crecimiento y la muerte celular. En este documento, se identificaron células muertas basadas en tinción de yoduro de propidio ( Figura 3B ). Se observaron efectos citotóxicos y citostáticos del erlotinib sobre las células H3255, con un aumento en el número de muertes y una disminución en el número de nacimientos después del tratamiento con fármacos ( Figura 3C ). Vale la pena señalar que el número de células muertas disminuye después del día 1 probablemente debido a la depuración celular. Las células CCD-19Lu no se vieron afectadas por el fármaco. Una ventaja adicional de esta plataforma es la generación de datos cuantitativos. Por ejemplo, en nuestro experimento de co-cultivo, se encontró que una subpoblación inicial de 1.118 (75.8%) células H3255 era 2.817 (87.9%) o 396 (57.2%) después de tres días sin o con erlotinaIb, respectivamente ( Figura 4 ). Debido a que podemos generar recuentos de células reales en lugar de porcentaje relativo (como con los métodos de citometría de flujo), concluimos que el cambio en la composición durante el tratamiento con fármacos se debe a una disminución de las células H3255 y no a un aumento de CCD-19Lu. No vale la pena que las tasas de mortalidad se pueden subestimar debido a la depuración celular, que es difícil de evaluar experimentalmente y probablemente difiere entre los tipos de células. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> Figura 1: Visión general del Protocolo de análisis de imágenes. Dos posibles tuberías de análisis de imagen aguas abajo para clasificar las poblaciones heterocelulares utilizando una clasificación basada en morfología o basada en fluorescencia. Barras de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic en ella</a>E para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> Figura 2: Concordancia entre la Morfología y la Clasificación basada en la Fluorescencia. ( A ) Gráfico de concordancia que muestra la superposición de los dos protocolos de clasificación. Las mismas células se clasificaron como H3255 utilizando tanto la morfología y la fluorescencia basada en la clasificación. Los dos protocolos estuvieron de acuerdo, con clasificación de 97,4% (n = 1403) de células no tratadas y 92,5% (n = 916) de células tratadas con erlotinib (Nota: el área blanca es demasiado pequeña para visualizarse). ( B ) imágenes 10X que representan ejemplos de buena y mala concordancia entre la clasificación basada en la fluorescencia y la morfología basada. Las flechas blancas apuntan a las celdas que fueron clasificadas inconsistentemente entre las plataformas. Imagen de entrada: núcleos azules (Hoechst); Verde - CCD19Lu (GFP). ClassiImágenes de marcado: Rojo - H3255; Verde - CCD-19Lu. Barra de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> Figura 3: Mediciones fenotípicas multiplexadas de una sola configuración experimental. ( A ) Se calcularon características morfológicas, tales como núcleos y área celular, en el nivel de célula única en presencia y ausencia de fármaco. Nota: Las áreas celulares que miden menos de 100 μm 2 se consideraron escombros y se excluyeron de los análisis. La gráfica de la caja representa la mediana con los rangos del primer y tercer cuartil y las barras de error del intervalo de confianza del 95%. ( B ) Se co-cultivaron células H3255 (azul) y CCD-19Lu (verde) y se identificaron células muertas basándose en la intensidad de las células propídicasIum iodide mancha (rojo) y imágenes utilizando un objetivo 10X. Barra de escala = 1 mm (panel superior); 100 μm (imágenes del fondo). ( C ) Se calculó el número total de células vivas y muertas durante tres días con o sin tratamiento con fármaco, con una disminución obvia en el número de células vivas y aumento de células muertas con la adición de erlotinib. Las barras de error representan el error estándar de la media basada en tres repeticiones. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> Figura 4: Dinámica de la Subpoblación en el Tiempo. Imágenes representativas 10X de pocillos que contienen H3255 (azul) y CCD-19Lu (verde) el día 0 o el día 3 con y sin fármaco. Se contaron las células pertenecientes a cada subpoblación y los gráficos circulares proporcionales muestran la aCambios en la composición de la población en las muestras. Barras de escala = 1 mm (paneles centrales, shpwn en el panel más alto), 1 mm (imagen superior), 100 μm (imágenes del fondo). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques at JoVE.com

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Hemos desarrollado un nuevo protocolo para estudiar la dinámica de la población heterocelular en respuesta a las perturbaciones. Este manuscrito describe una plataforma basada en imágenes que produce conjuntos de datos cuantitativos para la caracterización simultánea de múltiples fenotipos celulares de poblaciones heterocelulares de una manera robusta.

Discriminación y Caracterización de las Poblaciones Heterocelulares Usando Técnicas de Imagen Cuantitativa

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

discrimination-characterization-heterocellular-populations-using

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K vistas.  University of Southern California (USC).  Hemos desarrollado un nuevo protocolo para estudiar la dinámica de la población heterocelular en respuesta a las perturbaciones. Este manuscrito describe una plataforma basada en imágenes que produce conjuntos de datos cuantitativos para la caracterización simultánea de múltiples fenotipos celulares de poblaciones heterocelulares de una manera robusta. 

Video: Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Investigación

Biología

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Técnicas de Imagen Ca 2 + Señalización en el esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Medición de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Desarrollo y caracterización de<em&gt; In Vitro</em&gt; Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Y la producción de óxido nítrico

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Técnicas de Imagen y Prometafase metafase de la meiosis I en fijo<em&gt; Drosophila</emLos ovocitos&gt;

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caracterización de la calcificación Eventos en vivo mediante técnicas ópticas y microscopía electrónica en un Gusano Tubícola Marina

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...