Diese Arbeit wurde von National Cancer Institute (NCI) Grants U54CA143798 und U54CA143907 finanziert, um Physical Sciences-Oncology Centers (PS-OCs) am Dana-Farber Cancer Institute und der University of Southern California zu etablieren. SM Mumenthaler erhielt einen PS-OC-Transnetwork-Award, der einige dieser Arbeiten unterstützte. Wir danken unseren philanthropischen Unterstützern, besonders der Stephenson-Familie, Emmet, Toni und Tessa, für ihre Spende der Operetten-HCS-Plattform. Wir möchten uns auch bei J. Foo für die Beratung bedanken und das Team der Center for Applied Molecular Medicine: D. Agus für klinische Beratung und Mentoring, K. Patsch für aussagekräftige Diskussionen mit experimentellem Design, R. Rawat zur Unterstützung von Bildanalyseprotokollen , J. Katz für technische Unterstützung bei der Operette und P. Macklin und D. Ruderman für hilfreiche Diskussionen und Feedback.

1. Zellkultur HINWEIS: Hier wurden phänotypische Reaktionen von NSCLC-Zellen (H3255) auf das EGFR-Targeting-Agens, Erlotinib, bei Co-Kultivierung mit Lungenfibroblasten (CCD-19Lu GFP) untersucht. Für denselben Datensatz wurde eine fluoreszenzbasierte und morphologiebasierte Klassifikation der beiden Zellpopulationen (H3255 und CCD-19Lu GFP) durchgeführt, um ihre Konkordanz zu veranschaulichen. Es muss jedoch nur eine Klassifizierungsmethode verwendet werden, die auf der Grundlage der Anwendung ausgewählt werden sollte. <ol><li> Vorbereiten von 500 ml RPMI-1640, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS und 1% Penicillin / Streptomycin. HINWEIS: Das Wachstumsmedium und die Ergänzungen können nach Bedarf für andere Zelltypen ersetzt werden. </li><li> Kulturzellen in 10 cm 3 Platten als reine Populationen in 5% CO 2 bei 37 ° C und Durchgang in jedem geeigneten Verhältnis alle 3-4 Tage. </li></ol> 2. Vorbereitung der Zellen <ol><li> Um eine Zelle Suspension vorzubereiten, entfernen Sie cEll-Medien und Waschzellen mit 5 ml 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Absaugen des PBS, Zugabe von 1 ml 0,05% Trypsin auf 37 ° C erwärmt und 5 min inkubieren (oder bis die Zellen nicht mehr an der Platte haften) bei 37 ° C. </li><li> Um Trypsin zu neutralisieren, fügen Sie 4 ml RPMI zu H3255 und CCD-19Lu GFP Platten hinzu und pipettieren Sie die Zelllösungen in 15 ml konische Röhrchen. </li><li> Zentrifugen von Zellen bei 150 xg für 5 min bei RT. </li><li> Absaugen des Überstandes und Resuspendieren von Zellpellets in 10 ml RPMI-Medium in konischen Röhrchen, um sich auf die Aussaat vorzubereiten. </li></ol> 3. Zelle Beschichtung <ol><li> Zähle die Zellen, um die Aussaat zu standardisieren. <ol><li> Umdrehen von Röhrchen, um Zellen in Lösung zu mischen. 10 μl jeder Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und 10 μl Trypanblau hinzufügen. </li><li> 10 μl dieser Lösung in einen Zellzählschieber pipettieren und in den automatischen Zellzähler einfügen. HINWEIS: Andere Methoden der Zellzählung (z. Hämocytometer) verwendet werden. </li><li> Wiederholen Sie die Zellzahl mindestens dreimal, oder bis die erhaltenen Zählungen konsistent sind. </li></ol></li><li> Samen Zellen auf eine Multi-Well-Platte HINWEIS: Die Anzahl der zu sägenden Platten hängt von der Anzahl der abgebildeten Zeitpunkte ab. Alternativ kann eine Platte im Laufe der Zeit neu abgebildet werden, wenn die Zellen mit Histon-2B-GFP (oder anderen stabilen lentiviralen Kernflecken, die eine adäquate Kernsegmentierung bereitstellen) transduziert werden. <ol><li> Saatgut insgesamt 1.500 Zellen / Vertiefung in 100 μl RPMI. Bereiten Sie drei Zellsuspensionen vor, um drei Zellpopulationen zu plattieren: H3255, CCD-19Lu GFP und 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Führen Sie jede in dreifacher Ausfertigung mit identischen Platten-Setups für jeden Zeitpunkt. ANMERKUNG: Für jede Zelllinie und Plattengröße sollten anfängliche Seededichten optimiert werden. </li><li> Samenzellen in 3 x 96-Well-Platten mit einer Mehrkanalpipette. Inkubieren von Zellen O / N bei 37 ° C, 5% CO 2 . </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Arzneimitteldosierung <ol><li> Füge DMSO zu Erlotinib Pulver hinzu, um eine endgültige Erlotinib-Stammlösung von 10 mM Konzentration zu bilden. HINWEIS: Das Medikament kann nach Wunsch ersetzt werden. </li><li> Verdünnen Sie das Medikament mit Zellkulturmedium auf 2x der Endkonzentration mit der höchsten Endkonzentration bei 10 μM und verdünnen Sie viermal im Verhältnis 1:10 für insgesamt fünf Arzneimittelkonzentrationen und ohne Medikamentenkontrolle. HINWEIS: Wenn die Konzentration von DMSO bei der höchsten Arzneimitteldosis 0,1% v / v übersteigt oder übersteigt, sollte die Medikamentenkontrolle keine äquivalente Menge an DMSO enthalten, um sicherzustellen, dass die beobachteten beobachteten Effekte nicht auf die DMSO-Toxizität zurückzuführen sind. </li><li> 100 μl Arzneimittellösung in die geeignete Vertiefung für eine abschließende Arzneimittelkonzentration von 1x, verdünnt in Medien, pipettieren. </li></ol> 5. Bildaufnahme HINWEIS: Bilder wurden an den Tagen 0, 2 und 3 erworben. Je nach Zelltypen und zellulären Prozessen, die untersucht wurden, oDie gewünschten Zeitpunkte können untersucht werden. <ol><li> Fleckzellen zur Vorbereitung auf die Bildgebung. <ol><li> Die Farbstofflösung bei den folgenden Endkonzentrationen auffüllen. <ol><li> Zur fluoreszenzbasierten Klassifizierung werden 5 μg / mL Kernfleck und 5 μM toter Zellfleck in PBS hergestellt (siehe Tabelle der Materialien ). </li><li> Zur morphologiebasierten Klassifizierung werden 5 μg / mL Kernfleck, 5 μM toter Zellfleck und 5 μM Zellfleck in PBS hergestellt (siehe Tabelle der Materialien ). </li></ol></li><li> 20 μl Farbstofflösung zu jeder Vertiefung geben. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C vor Licht geschützt. </li></ol></li><li> Optimieren und Erfassen von Bildern. <ol><li> Entfernen Sie die Bohrkrone aus dem Inkubator, wischen Sie den Boden der Platte mit 70% EtOH und legen Sie die Platte in die Abbildungskammer. </li><li> Klicken Sie auf der Registerkarte &#39;Setup&#39; auf die Schaltfläche &#39;+&#39; unter &#39;Kanalauswahl&#39;, um entsprechende Kanäle hinzuzufügenBild ( dh Hellfeld, Kernfleck, toter Zellfleck, GFP und RFP Signale). </li><li> Klicken Sie auf &quot;Layout Selection&quot; und nehmen Sie z-gestapelte Testbilder alle 2 μm ab 0 μm und enden bei 20 μm, um die Fokusebene zu identifizieren. Geben Sie diesen Abstand für jeden Kanal unter &#39;Höhe&#39; ein. </li><li> Klicken Sie unter jedem Kanal auf &quot;Schnappschuss&quot;, um Intensitäten zu bewerten und die Belichtungszeiten zu optimieren. Geben Sie unter &quot;Zeit&quot; nach Bedarf höhere oder niedrigere Werte ein. </li><li> Auf der rechten Seite des Bildschirms, markieren Sie geeignete Brunnen (abzubilden) auf dem Plattenschema. In den unten stehenden Brunnen markieren Sie die fünfundzwanzig Felder, die in ähnlicher Weise abgebildet werden sollen. </li><li> Unter &quot;Run Experiment&quot; markieren Sie die Platte in &#39;Plate Name&#39; auf der linken Registerkarte und klicken Sie auf die Schaltfläche &#39;Start&#39; (unten), um das Bildaufnahmeprotokoll mit einem 10fachen Ziel zu starten, um Graustufen-TIFF-Bilder in den oben genannten Kanälen zu erzeugen. HINWEIS: Schritt-für-Schritt-InstRuktionen für das Imaging-Protokoll können sich zwischen den Instrumenten unterscheiden, aber die Parameterwerte sollten noch optimiert werden. </li><li> Wiederholen Sie die Bildgebung an den Tagen zwei und drei. </li></ol></li></ol> 6. Bildanalyse HINWEIS: Die gesamte Bildanalyse wurde mit proprietärer Software durchgeführt. Da dies aber nicht öffentlich zugänglich ist, wurden auch vergleichbare Analysen auf CellProfiler 2.2 und CellProfiler Analyst 2.0 mit einem nachfolgend aufgeführten Kurzprotokoll und einem detaillierten Protokoll als Ergänzungsmaterial (Testbilder sind bereits in Pipelines geladen, um den Workflow zu testen). Die Bilder aus diesem Experiment wurden auf einer pro-well-Basis zusammengefasst, so dass jeder Brunnen einzeln geladen werden konnte. Die unten aufgeführten CellProfiler-Pipelines enthalten einen regulären Ausdruck, der Metadateninformationen aus jedem Bilddateinamen analysiert und die Bilder weiter nach Kanal gruppiert. <ol><li> Laden und installieren Sie die Open-Source-Software: &#39;CellProfiler9; Und &quot;CellProfiler Analyst&quot;. Übernehmen Sie alle Standardoptionen und Add-ons während der Installation. </li><li> Klassifizierung heterocyclischer Kulturen in Subpopulationen. <ol><li> Öffnen Sie &#39;CellProfiler&#39; Software, klicken Sie auf &#39;Datei&#39; | &#39;Pipeline importieren&#39; &#39;Aus Datei&#39; und wählen Sie die entsprechende Datei (&quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; für die Fluoreszenz-basierte Klassifizierung oder &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot; für die Morphologie-basierte Klassifizierung). HINWEIS: Diese Dateien enthalten Protokolle für die grundlegende Bildverarbeitung und die Kern- / Zellsegmentierung. Wegen des unebenen Hoechst-Fleckes, der über diesen Zellen vorhanden war, wurden die Kerne segmentiert und vergrößert und dann verwendet, um das Bild zu maskieren, um die Segmentierung von Kernen mit niedrigeren Intensitäten zu ermöglichen. <ol><li> Wählen Sie die Fluoreszenz-basierte Klassifizierungspipeline, um Zellen als H3255 oder CCD-19Lu auf der Grundlage der eGFP-Intensität zu klassifizieren und um Morphologiemerkmale zu berechnen. HINWEIS: CCD-19Lu-Zellen wurden mit GFP transduziert. </li><li> Wählen Sie die Morphologie-basierte Klassifizierungspipeline, um Kerne und Zellen zu segmentieren und um Morphologiemerkmale zu berechnen. HINWEIS: Für die Klassifizierung wird eine weitere Downstream-Analyse in &#39;CellProfiler Analyst&#39; benötigt. Tote Zellen werden durch fluoreszenzbasierte Klassifizierung klassifiziert. </li></ol></li><li> Klicken Sie unten links auf dem Bildschirm auf &quot;Ausgabeeinstellungen&quot;. Wählen Sie den Ort der Bilddateien für die Analyse (&#39;Default Input Folder&#39;) und das Ziel für die extrahierten Daten (&#39;Default Output Folder&#39;). </li><li> Klicken Sie auf &quot;Bilder analysieren&quot;, um die Analyse zu starten. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf &quot;OK&quot; und gehen Sie zum &quot;Standard-Ausgabeordner&quot;, um die berechneten Daten anzuzeigen. HINWEIS: Beispielparameterwerte und -bilder sind in der Ergänzungsdatei 1-CellProfilerProtocol.pdf verfügbar . </li><li> Für die Morphologie-basierte Klassifizierung (nur) die folgenden. <ol><li> Öffnen Sie die Software &quot;CellProfiler Analyst&quot;, wählen Sie die in CellProfiler generierte Datenbankeigenschaftsdatei aus und klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot;. </li><li> Klicken Sie oben links auf den Bildschirm &quot;Classifier&quot;. Um zufällige Zellbilder aus dem Experiment aufzurufen, klicken Sie auf &#39;Fetch&#39;; Bilder werden im nicht klassifizierten Fenster angezeigt. </li></ol></li><li> Manuelles Klassifizieren von Zellen als positiv (H3255) oder negativ (CCD-19Lu) durch Auswählen und Ziehen von Zellen in eine geeignete Bin (siehe Ergänzende Datei 2-Pipeline.pdf : Abbildung B ). Nach der Klassifizierung von mindestens 50 Zellen pro Subpopulation, klicken Sie auf &#39;Train Classifier&#39;, und klicken Sie dann auf &#39;Progress prüfen&#39;. HINWEIS: Die Zellen werden über einen vom Benutzer überwachten zufälligen Forstmaschinen-Lernalgorithmus 12 klassifiziert. Wenn die Genauigkeit nicht über der zulässigen Schwelle (&gt; 90%) liegt, kann es notwendig sein, zurückzugehen und die Zellsegmentierung auf &quot;CellProfiler&quot; zu optimieren, oder die Zellen sind möglicherweise nicht ideal für classiDurch Morphologie verunglimpfen </li><li> Klicken Sie auf &#39;Score All&#39;, um eine Tabelle mit Zellzählungen für jede Subpopulation zu erzeugen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

Zellbasierte Assays waren ein Arbeitspferd in Grundlagenforschung und Arzneimittelentwicklung. Allerdings sind die Einschränkungen dieser Standard-Assays zunehmend offensichtlich mit der Diskordanz zwischen in vitro und klinischen Daten und das Versagen der meisten Medikamente, um FDA-Zulassung zu erhalten. Hier stellen wir eine neuartige Methode zur Verwendung einer quantitativen Bildgebung vor, um gleichzeitig heteroelluläre Phänotypen als Reaktion auf relevante, gleichzeitig auftretende Umwelteinflüsse zu analysieren. Herkömmliche zellbasierte Assays, die verwendet werden, um die Zelllebensfähigkeit zu messen, umfassen: Trypanblau-Ausschluss-Assays, MTT / MTS und Annexin-V-FITC-Durchflusszytometrie-Färbung. Trypan Blue Ausschluss Assays, während einfach und kostengünstig, erfordern eine große Anzahl von Zellen, sind zeitaufwendig, und werden oft von Benutzer Bias 1 beeinflusst . MTT- und MTS-Assays messen die Zelllebensfähigkeit durch Messungen der mitochondrialen metabolischen Rate indirekt. Allerdings ist die metabolische activiDie Zellen können durch unterschiedliche Kulturbedingungen (wie Medien- oder Sauerstoffkonzentration) beeinflusst werden, was zu ungenauen Ergebnissen führt und die Standardisierung über die Zelltypen und die Bedingungen 2 , 3 verhindert . Ein weiterer wichtiger Nachteil dieser Techniken ist ihre Unfähigkeit, zwischen mehreren Zelltypen zu unterscheiden - die meisten biologischen Systeme sind heterozellulär. Während Durchflusszytometrie-Verfahren die Fähigkeit haben, zwischen mehreren Zellpopulationen zu unterscheiden, sind Zelletiketten erforderlich, dynamische Abtastung ist eine Herausforderung, und bei der Verwendung von adhärenten Zellen wird diese Anwendung zeitaufwändig und fehleranfällig. Andere wichtige zelluläre Phänotypen, einschließlich morphologischer Veränderungen, treten in Reaktion auf Umwelteinflüsse auf, werden aber nicht durch herkömmliche zellbasierte Assays erfasst. Profiling Zelle Zustände durch morphologische Charakterisierung und Abbildung Ähnlichkeiten über Proben ist ein leistungsfähiges, unvoreingenommenes Werkzeug mit dem aUm neue Erkenntnisse in viele Aspekte der grundlegenden und translationalen Forschung zu geben, einschließlich der grundlegenden Zellbiologie und der Wirkstoffforschung 4 . Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Tumorzellmorphologie mit den Tumorsubtypen 5 und der Aggressivität korreliert. Daher ist es von großem Interesse, diese zellulären Merkmale zu studieren und wie sie sich auf spezifische Umweltstörungen beziehen. Darüber hinaus kann man Unterschiede in morphologischen Merkmalen verwenden, um zwischen Subpopulationen in Co-Kultursystemen zu unterscheiden. Fluoreszenzmarkierende Zellen haben Abfälle ( dh die Veränderung der inhärenten Zelleigenschaften, zeitaufwändig) und daher sind zusätzliche Methoden zur Klassifizierung von Zelltypen vorteilhaft. Die Mikroskopie-basierte Bildgebung ist eine alternative Methode zur Profilierung von zellulären Phänotypen in multiplexierter, quantitativer und robuster Weise. In diesem Manuskript wenden wir unsere quantitative bildgebende Pipeline an, um die evolutio hervorzuhebenNary Dynamik heterogener Zellpopulationen innerhalb eines Tumors. Wir konzentrieren uns auf die Wechselwirkung zwischen Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) Zellen und Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs), dem am häufigsten vorkommenden Stromazellen-Typ, der in Tumoren gefunden wird. CAFs wurden in Tumorinitiierung, Progression und therapeutische Reaktion verwickelt; Daher kann die Durchführung von phänotypischen Assays auf Tumorzellen in Abwesenheit von CAFs irreführend 7 , 8 , 9 sein . Insbesondere haben wir die Effekte von CAFs auf Tumorzellen als Reaktion auf Erlotinib, ein kleines Molekül, das auf den Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) abzielt, der häufig in der klinischen Behandlung von NSCLC verwendet wird, ausgewertet. Wir haben eine hochauflösende Screening-Plattform und die dazugehörige Bildanalyse-Software zur Auswertung eingesetzt. In einem Versuch, diese Methodik anderen Forschern zugänglich zu machen, haben wir auch ein vergleichbares Downstream-Protokoll mit der Open-Source-Software entwickelt:CellProfiler 10 und CellProfiler Analyst 11 . Die meisten bildbasierten High-Content-Screening-Assays werden mit kommerzieller Software analysiert, die für ein bestimmtes Instrumentenmodell spezifisch ist. Ergebnisse sind schwierig, in anderen Labors mit unterschiedlicher Software zu replizieren, weil die zugrunde liegenden Algorithmen oft proprietär sind. Unter Verwendung dieser bildbasierten Pipeline wurden Zellproliferation, Tod und Morphologie jeder Subpopulation einer heterozellulären Kultur als Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung unter Verwendung von Fluoreszenz- und Morphologie-basierter Klassifikation gemessen. Das folgende Protokoll bietet eine robuste Methode zur Untersuchung komplexer zellulärer Prozesse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:191px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">FBS</td>
			<td style="width:127px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15-140-122</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20 slides with trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450003</td>
			<td>cell counter slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">96-well plates</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td>clear bottom black plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Erlotinib</td>
			<td style="width:127px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">E-4007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">DMSO</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">317275-100ML</td>
			<td>solution to resuspend drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Hoechst</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">H21491</td>
			<td>nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td>dead cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Cell Tracker Orange CMRA</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
			<td>whole cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Operetta high content imaging system</td>
			<td style="width:127px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:127px;">Broad Institue</td>
			<td style="width:119px;">version 2.2.0 (rev 9969f42)</td>
			<td>http://cellprofiler.org/releases/</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &#186;C at 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:240px;">10 cm2 cell culture plates</td>
			<td style="width:127px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

Zelluläre Prozesse sind komplex und ergeben sich aus dem Zusammenspiel von mehreren Zelltypen und deren Umgebung. Bestehende zellbiologische Techniken erlauben oft keine genaue Interpretation dieses Zusammenspiels. Mit einem quantitativen bildgebenden Ansatz präsentieren wir ein hochauflösendes Protokoll zur Charakterisierung der dynamischen phänotypischen Reaktionen ( dh Morphologieveränderungen, Proliferation, Apoptose) heterogener Zellpopulationen auf Veränderungen der Umweltreize. Wir unterstreichen unsere Fähigkeit, zwischen Zelltypen zu unterscheiden, die entweder auf Fluoreszenzintensität oder inhärenten Morphologiemerkmalen je nach Anwendung basieren. Diese Plattform ermöglicht eine umfassendere Charakterisierung der Subpopulation Antwort auf Störung unter Nutzung kürzere Zeit, kleinere Mengen an Reagenzien und geringere Wahrscheinlichkeit von Fehler als herkömmliche Zellbiologie Assays. Allerdings können in einigen Fällen Zellpopulationen schwer zu identifizieren und zu quantifizieren, basierend auf komplexen celluFeatures und erfordert zusätzliche Fehlersuche; Wir heben einige dieser Umstände im Protokoll hervor. Wir zeigen diese Anwendung mit Hilfe von Medikamenten in einem Krebsmodell; Allerdings kann es leicht breiter auf andere physiologische Prozesse angewendet werden. Dieses Protokoll erlaubt es, Subpopulationen innerhalb eines Co-Kultursystems zu identifizieren und die jeweilige Antwort von jedem auf externe Reize zu charakterisieren.

Wir haben ein Bildset bestehend aus 25 Feldern / Brunnen, 54 Wells / Platte (3 Zellpopulationen x 6 Arzneimittelkonzentrationen x 3 Replikate), über drei Platten für insgesamt 4.050 Einzelbilder erstellt. Die im Laufe des Experiments erzeugten Bildmengen wurden mittels proprietärer Software (siehe Materialtabelle) analysiert, um verschiedene quantitative Eigenschaften von Zellen ( dh Morphologie, Fluoreszenz) zu extrahieren, die dann zur Klassifizierung von Zell-Subpopulationen verwendet werden konnten. Da jedoch die verwendete kommerzielle Software nur begrenzten Zugang hat, wurden vergleichbare nachgeschaltete Pipelines in CellProfiler und CellProfiler Analyst erstellt. Heterozelluläre Einteilung in Subpopulationen Nuklei wurden identifiziert und segmentiert, basierend auf dem DNA-Fleck (hier Hoechst) und Zellpopulationen wurden entweder auf der Basis von Fluoreszenz oder MoRphologie ( Abbildung 1 ). Für die Fluoreszenz-basierte Klassifikation wurden die Fibroblasten (CCD-19Lu) zuvor mit GFP-Lentivirus transduziert. Die GFP-Intensitätsniveaus wurden für jeden Kern gemessen, und diejenigen, die oberhalb der akzeptierten Schwelle (basierend auf dem Hintergrundsignal) berechnet wurden, wurden als CCD-19Lu klassifiziert, während die folgenden als Tumorzellen identifiziert wurden (H3255). Für die Morphologie-basierte Klassifikation wurden die Zellen zuvor mit einem nicht-toxischen Zellfleck gefärbt (siehe die Tabelle der Materialien), und dies wurde verwendet, um das Zytoplasma zu identifizieren und zu segmentieren. Ein maschineller Lernalgorithmus wurde mit ~ 50-100 Zellen aus jeder Population trainiert. Es wurden morphologische Merkmale identifiziert, die zwischen den Populationen signifikant unterschiedlich waren, die dann zur Bildung eines linearen Klassifikators verwendet wurden, um zwischen CCD-19Lu- und H3255-Zellen zu unterscheiden. Die Fluoreszenz- und Morphologie-Klassifizierungsprotokolle waren 97,4% (n = 1403), die bei der Unterscheidung zwischen den beiden Zellpopulationen übereinstimmtenAtionen in unbehandelten Bedingungen und 92,5% (n = 916) übereinstimmend in medikamentenbehandelten Bedingungen (1 μM Erlotinib) ( Abbildung 2 ). Phänotypische Analysen von Subpopulationen Neben der Unterscheidung zwischen Zelltypen zielten wir darauf ab, die phänotypischen Eigenschaften jeder Subpopulation zu charakterisieren. Multiplexing-Assays spart Zeit und Reagenzien, fügt Konsistenz hinzu und liefert zusätzliche Informationen über das zu untersuchende System. Es gibt viele potentielle phänotypische Ausgänge und man sollte sie auf der Grundlage der interessanten Fragen wählen. Hier wurden Veränderungen in der Zellmorphologie und dem Lebensfähigkeitsstatus als Reaktion auf die Erlotinib-Behandlung untersucht. Nach drei Tagen medikamentöser Behandlung wurde eine Abnahme des Kernbereichs und eine Zunahme der Zellfläche der H3255-Zellen beobachtet ( Abbildung 3A ). Der mittlere Unterschied im Kernbereich zwischenEs wurde festgestellt, dass die &quot;Nicht-Arzneimittel&quot; und &quot;Arzneimittel&quot; behandelten Populationen über einen zweiseitigen Typ-2 (gleicher Varianz) t- test ( p = 7,92 x 10 &amp; supmin ; ¹ ) statistisch signifikant waren. Wir vermuten, dass diese Beobachtung eine zelluläre Antwort auf den Stress ist, der durch eine medikamentöse Behandlung auferlegt wird. Es ist auch von Interesse zu untersuchen, ob ein Arzneimittel eine zytotoxische ( dh eine Zunahme der Anzahl von toten Zellen im Laufe der Zeit) oder eine zytostatische ( dh eine Verringerung der Anzahl von Zellgeburten über die Zeit) auf die Zellen hat, da dies einen tiefen klinischen Einfluss hat. Zum Beispiel induziert ein zytostatischer Arzneimittelwirkung Wachstumsstopp und beseitigt die Zellen nicht aus dem Tumor, so dass es möglich ist, dass Krebszellen die Zellproliferation neu initialisieren, sobald das Medikament entfernt ist. Drogeneffekte können oft Kontext-, Konzentrations- und Zelltypen sein. Wir haben zuvor beobachtet, dass Erlotinib eine zytotoxische Antwort in einem Zelltyp hervorruft, während er ac zeigtYtostatische Antwort in einem anderen 13 . Traditionelle Lebensfähigkeitstests geben die relative Zellzahl aus und unterscheiden daher nicht zwischen Wachstumsstörungen und Zelltod. Hier wurden tote Zellen auf der Basis von Propidiumjodidfärbung identifiziert ( 3B ). Sowohl zytotoxische als auch zytostatische Effekte von Erlotinib auf H3255-Zellen wurden beobachtet, mit einer Zunahme der Zahl der Todesfälle und einer Abnahme der Anzahl der Geburten nach einer medikamentösen Behandlung ( Abbildung 3C ). Es ist erwähnenswert, dass die Anzahl der toten Zellen nach dem Tag 1 wahrscheinlich aufgrund der Zellfreisetzung sinkt. CCD-19Lu-Zellen wurden nicht von der Droge betroffen. Ein weiterer Vorteil dieser Plattform ist die Erzeugung von quantitativen Daten. Zum Beispiel wurde bei unserem Co-Kultur-Experiment eine anfängliche Subpopulation von 1.118 (75,8%) H3255-Zellen nach drei Tagen ohne oder mit Erlotin 2.817 (87,9%) oder 396 (57,2%) festgestelltIb-Behandlung ( Abbildung 4 ). Da wir anstelle des relativen Prozentsatzes (wie bei Durchflusszytometrieverfahren) tatsächlich tatsächliche Zellzahlen erzeugen können, schließen wir, dass die Veränderung der Zusammensetzung während der medikamentösen Behandlung auf eine Abnahme der H3255-Zellen und nicht auf eine Erhöhung der CCD-19Lu zurückzuführen ist. Es ist nichts wert, dass die Sterberaten aufgrund der Zellfreisetzung unterschätzt werden können, was schwer experimentell zu beurteilen ist und sich wahrscheinlich über Zelltypen unterscheidet. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> Abbildung 1: Überblick über das Bildanalyse-Protokoll. Zwei potenzielle Downstream-Bildanalyse-Pipelines zur Klassifizierung heterozellulärer Populationen unter Verwendung entweder morphologiebasierter Klassifikation oder fluoreszenzbasierter Klassifikation. Maßstäbe = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicke sie an</a>Um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> Abbildung 2: Konkordanz zwischen Morphologie und Fluoreszenz-basierter Klassifikation. ( A ) Konkordanzdiagramm, das die Überlappung der beiden Klassifizierungsprotokolle anzeigt. Die gleichen Zellen wurden als H3255 unter Verwendung von morphologie- und fluoreszenzbasierter Klassifikation klassifiziert. Die beiden Protokolle stimmten mit der Klassifizierung für 97,4% (n = 1403) unbehandelter Zellen und 92,5% (n = 916) von mit Erlotinib behandelten Zellen (Anmerkung: weißer Bereich ist zu klein, um zu visualisieren). ( B ) 10X-Bilder, die Beispiele für eine gute und schlechte Konkordanz zwischen fluoreszenzbasierter und morphologiebasierter Klassifikation darstellen. Die weißen Pfeile weisen auf Zellen hin, die widersprüchlich zwischen Plattformen klassifiziert wurden. Eingabebild: blue - nuclei (Hoechst); Grün - CCD19Lu (GFP). KlasseBilder: Rot - H3255; Grün - CCD-19Lu. Maßstab = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> Abbildung 3: Multiplexierte phänotypische Messungen aus einem einzigen experimentellen Setup. ( A ) Morphologische Merkmale, wie Kerne und Zellfläche, wurden auf der Ebene der einzelnen Zellen in Gegenwart und Abwesenheit von Arzneimitteln berechnet. Hinweis: Zellbereiche, die kleiner als 100 μm 2 sind, wurden als Trümmer betrachtet und von Analysen ausgeschlossen. Box-Plot zeigt Median mit dem ersten und dritten Quartilbereich und 95% Konfidenzintervall-Fehlerbalken. ( B ) H3255 (blau) und CCD-19Lu (grüne) Zellen wurden co-kultiviert und tote Zellen wurden auf der Grundlage der Intensität von Propid identifiziertIodjodidfleck (rot) und mit einem 10fachen Ziel abgebildet. Maßstab = 1 mm (obere Platte); 100 μm (untere bilder). ( C ) Die Gesamtzahl der lebenden und toten Zellen wurde über drei Tage mit oder ohne medikamentöse Behandlung mit einer offensichtlichen Abnahme der Anzahl von lebenden Zellen und Erhöhung der toten Zellen unter Zugabe von Erlotinib berechnet. Fehlerbalken stellen einen Standardfehler des Mittelwertes dar, der auf drei Wiederholungen basiert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> Abbildung 4: Subpopulation Dynamik über Zeit. Repräsentative 10X Bilder von Brunnen mit H3255 (blau) und CCD-19Lu (grün) am Tag 0 oder Tag 3 mit und ohne Medikament. Zellen, die zu jeder Subpopulation gehörten, wurden gezählt und proportionale Kreisdiagramme zeigen die aVeränderung der Populationszusammensetzung über Proben hinweg. Maßstäbe = 1 mm (mittlere Tafeln, eingeklemmt, obere Platte), 1 mm (oberes Bild), 100 μm (untere Bilder). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Wir haben ein neuartiges Protokoll für das Studium der heterozellulären Populationsdynamik als Reaktion auf Störungen entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt eine bildgebende Plattform, die quantitative Datensätze zur gleichzeitigen Charakterisierung mehrerer zellulärer Phänotypen heterocyclischer Populationen in einer robusten Weise erzeugt.

Diskriminierung und Charakterisierung von Heterocellular Populationen mit quantitativen Imaging-Techniken

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Aufrufe.  University of Southern California (USC).  Wir haben ein neuartiges Protokoll für das Studium der heterozellulären Populationsdynamik als Reaktion auf Störungen entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt eine bildgebende Plattform, die quantitative Datensätze zur gleichzeitigen Charakterisierung mehrerer zellulärer Phänotypen heterocyclischer Populationen in einer robusten Weise erzeugt. 

Serie: Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Forschung

Biologie

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Mess-intrazellulären Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...