Bu çalışma sırasıyla Dana-Farber Kanser Enstitüsünde ve Güney Kaliforniya Üniversitesi&#39;nde Fiziksel Bilimler-Onkoloji Merkezleri (PS-OC) kurmak üzere U54CA143798 ve U54CA143907 Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Grants tarafından finanse edildi. SM Mumenthaler, bu çalışmaların bir kısmını destekleyen bir PS-OC trans-network ödülü aldı. Operetta HCS platformunu bağışları için hayırsever taraftarlarımıza, özellikle Stephenson ailesi, Emmet, Toni ve Tessa&#39;ya en büyük şükranlarımızı sunmak istiyoruz. Rehberlik için J. Foo&#39;ya ve Uygulamalı Moleküler Tıp Merkezi ekip üyelerine de teşekkür ederiz: D. Agus klinik rehberlik ve mentorluk için, K. Patsch deneysel tasarım ile anlamlı tartışmalar için R. Rawat, görüntü analiz protokollerinde yardım için , J. Katz, Operetta ile teknik yardım için, ve P. Macklin ve D. Ruderman&#39;a yararlı tartışmalar ve geri bildirimler.

1. Hücre Kültürü NOT: Akciğer fibroblastları (CCD-19Lu GFP) ile birlikte kültürlendiğinde, burada NSCLC hücrelerinin (H3255) fenotipik yanıtları EGFR hedefleyici ajan erlotinib&#39;e araştırılmıştır. Aynı veri seti için, iki hücreli popülasyonun (H3255 ve CCD-19Lu GFP) florasan esaslı ve morfolojiye dayalı sınıflamaları, uyumlarını örneklemek için gerçekleştirildi. Bununla birlikte, yalnızca bir sınıflandırma metodunun kullanılması gerekmekte ve uygulama temel alınarak seçilmesi gerekmektedir. <ol><li> % 10 ısı ile inaktif FBS ve% 1 penisilin / streptomis ile desteklenmiş 500 mL RPMI-1640 hazırlayın. NOT: Büyüme ortamı ve takviyeleri diğer hücre tipleri için gerektiği gibi değiştirilebilir. </li><li> 37 ° C&#39;de% 5 C02&#39;de saf popülasyonlar olarak 10 cm3 plakalarda kültür hücreleri ve 3-4 günde bir uygun oranda geçirin. </li></ol> 2. Hücrelerin Hazırlanması <ol><li> Bir hücre süspansiyonu hazırlamak için, cOrtamları çalkalayın ve hücreleri 5 mL 1X Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) ile yıkayın. </li><li> PBS&#39;yi aspire edin, 37 ° C&#39;ye kadar ısıtılan 1 mL% 0.05&#39;lik tripsin ekleyin ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin (veya hücreler artık plakaya yapışana kadar). </li><li> Tripsin nötralize etmek için H3255 ve CCD-19Lu GFP plakalarına 4 mL RPMI ekleyin ve hücre solüsyonlarını 15 mL konik tüplere pipetleyin. </li><li> RT&#39;de 5 dakika boyunca 150 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı aspire edin ve topak hazırlamak için konik tüpler içinde RPMI medya 10 ml hücre peletleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> 3. Hücre Kaplama <ol><li> Tohumu standartlaştıracak hücreleri sayın. <ol><li> Çözeltilerdeki hücreleri karıştırmak için tüpleri tersine çevirin. Bir mikrosantrifüj tüpü içine her bir hücre süspansiyonu 10 mcL Pipet ve 10 mcL trypan mavi ekleyin. </li><li> Bir hücre sayma slaydına bu çözeltiden 10 μL pipetleyin ve otomatik hücre sayacına yerleştirin. NOT: Diğer hücre sayımı yöntemleri ( örn.. Hemositometre) kullanılabilir. </li><li> Hücre sayısını en az üç kez tekrarlayın veya elde edilen sayılar tutarlı olacak şekilde yapın. </li></ol></li><li> Çok iyi plaka üzerine tohum hücreleri NOT: Çekilecek tabaklar sayısı görüntülenecek olan zaman noktalarının sayısına bağlıdır. Alternatif olarak, hücreler, histone-2B-GFP (veya yeterli nükleer bölünme sağlayan diğer kararlı lentiviral nükleer lekeler) ile transforme edilirse, bir plaka zamanla yeniden görüntü haline getirilebilir. <ol><li> 100 mcL RPMI&#39;de toplam 1.500 hücre / kuyu tohumlandı. Üç hücre popülasyonunu plakaya üç hücre süspansiyonu hazırlayın: H3255, CCD-19Lu GFP ve% 50 H3255 +% 50 CCD-19Lu GFP. Her bir zaman noktası için her birini aynı plakalarla üçlü olarak yapın. NOT: İlk ekim yoğunluğu, her hücre hattı ve plaka boyutu için optimize edilmelidir. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanarak 3 x 96 oyuklu plakalarda tohum hücreleri. Hücreleri O / N 37 ° C,% 5 CO 2&#39;de inkübe edin. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 4. İlaç Dozajlama <ol><li> 10 mM konsantrasyonda nihai bir erlotinib stok solüsyonu yapmak için erlotinib tozuna DMSO ekleyin. NOT: İlaç istenildiği şekilde ikame edilebilir. </li><li> İlacı hücre kültürü ortamı ile, 10 uM&#39;de en yüksek nihai konsantrasyona sahip olan nihai konsantrasyonun 2 katı olacak şekilde seyreltin ve toplam beş ilaç konsantrasyonu ve ilaç kontrolü olmaksızın, 1: 10 oranında dört defa seyreltin. NOT: DMSO konsantrasyonu, en yüksek ilaç dozunda% 0.1 v / v&#39;ye eşitse veya bunu aşarsa, gözlemlenen etkilerin DMSO toksisitesinden kaynaklanmadığından emin olmak için hiçbir ilaç kontrolü eşdeğer miktarda DMSO içermemelidir. </li><li> Ortamda seyreltilmiş 1x&#39;lik nihai bir ilaç konsantrasyonu için uygun çözeltiye 100 μL&#39;lik ilaç solüsyonu pipetleyin. </li></ol> 5. Görüntü Edinimi NOT: Görüntüler 0, 2 ve 3. günlerde elde edildi. Çalışılan hücre tiplerine ve hücresel proseslere bağlı olarakArzu edilen zaman noktaları çalışılabilir. <ol><li> Leke hücreleri görüntülemeye hazırlanın. <ol><li> Boya çözeltisini, aşağıdaki son konsantrasyonlarda hazırlayın. <ol><li> Floresan bazlı sınıflandırma için PBS içinde 5 μg / mL nükleer leke ve 5 uM ölü hücre lekesi hazırlayın (Malzeme Listesine bakın). </li><li> Morfoloji bazlı sınıflandırma için 5 μg / mL nükleer leke, 5 uM ölü hücre lekesi ve PBS&#39;de 5 μM hücre lekesi hazırlayın (Bkz . Malzeme Tablosu ). </li></ol></li><li> Her göze 20 μL boya çözeltisi ekleyin. Işıktan korunarak 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li></ol></li><li> Optimize edin ve görüntü elde edin. <ol><li> Kuluçka makinesinden çanağı çıkarın, plakanın tabanını% 70 EtOH ile silin ve plakayı görüntüleme odasına yerleştirin. </li><li> &#39;Kurulum&#39; sekmesinde, kanal seçimi bölümüne uygun kanallar eklemek için &#39;Kanal Seçimi&#39;nin altındaki&#39; + &#39;düğmesini tıklayın.Görüntü ( yani parlak alan, nükleer leke, ölü hücre lekesi, GFP ve RFP sinyalleri). </li><li> &#39;Düzen Seçimi&#39;ni tıklayın ve odak düzlemini tanımlamak için 0 μm&#39;den başlayan ve 20 μm&#39;de biten her 2 μm&#39;de z istifli test görüntüleri alın. Bu mesafeyi her kanal için &#39;Yükseklik&#39; altına girin. </li><li> Ağırlıkları değerlendirmek ve pozlama sürelerini optimize etmek için her kanalın altındaki &#39;Anlık Görüntü&#39;yü tıklayın. Gerektiğinde &#39;Zaman&#39; başlığının altına daha yüksek veya daha düşük değerler girin. </li><li> Ekranın sağ tarafında, plaka şemasında uygun oyukları (görüntülenecek) vurgulayın. Aşağıdaki kuyu şasesinde, benzer şekilde görüntülenecek yirmi beş alanı vurgulayın. </li><li> Yukarıdaki kanallarda gri ölçekli TIFF görüntüleri oluşturmak için &#39;Deneme Çalıştır&#39; altında, sol sekmede &#39;Plaka Adı&#39; içindeki plakayı belirleyin ve resim edinme protokolünü 10X&#39;lik bir hedefle çalıştırmak için &#39;Başlat&#39; düğmesine (altındaki) tıklayın. NOT: Adım adım yöntemGörüntüleme protokolü için rölötikler aletler arasında farklılık gösterebilir ancak parametre değerleri yine de optimize edilmelidir. </li><li> İkinci ve üçüncü günlerde görüntülemeyi tekrarlayın. </li></ol></li></ol> 6. Görüntü Analizi NOT: Tüm görüntü analizi, tescilli yazılım kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu genel olarak mevcut olmadığı için, CellProfiler 2.2 ve CellProfiler Analyst 2.0&#39;da aşağıda listelenen kısa bir protokol ve ek materyal olarak sunulan ayrıntılı protokol ile karşılaştırılabilir analizler de tasarlanmıştır (test görüntüleri iş akışını test etmek için boru hatlarına önceden yüklenmiştir). Bu deneydeki görüntüler, her kuyunun ayrı ayrı yüklenebilmesi için kuyu başına de gruplanmıştır. Aşağıdaki CellProfiler boru hatları, her resim dosyasından meta veri bilgilerini ayrıştıran ve görüntülerin kanal tarafından daha da gruplandırılmasını sağlayan bir normal ifade içermektedir. <ol><li> Açık kaynak yazılımını indirin ve yükleyin: &#39;CellProfiler9; Ve &#39;CellProfiler Analisti&#39;. Yükleme sırasında tüm varsayılan seçenekleri ve eklentileri kabul edin. </li><li> Heteroselüler kültürleri alt popülasyonlara sınıflandırın. <ol><li> &#39;CellProfiler&#39; yazılımını açın, &#39;Dosya&#39; | &#39;İthalat Boru Hattı&#39; | &#39;Dosyadan&#39; ve uygun dosyayı seçin (floresans tabanlı sınıflandırma için &quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; veya morfoloji tabanlı sınıflandırma için &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot;). NOT: Bu dosyalar temel görüntü işleme ve çekirdek / hücre bölütlemesi için protokoller içerir. Bu hücreler arasında bulunan düzensiz Hoechst lekesi nedeniyle, çekirdekler bölünmüş ve büyütülmüş ve daha sonra çekirdeklerin daha düşük yoğunluklarla bölümlenmesine olanak tanımak için görüntüyü maskelemek için kullanılmıştır. <ol><li> Hücreleri, eGFP yoğunluğuna dayalı olarak H3255 veya CCD-19Lu olarak sınıflandırmak ve morfoloji özelliklerini hesaplamak için flüorüre dayalı sınıflandırma boru hattını seçin. NOT: CCD-19Lu hücreler GFP ile transforme edildi. </li><li> Çekirdekleri ve hücreleri segmentlere ayırmak ve morfoloji özelliklerini hesaplamak için morfolojiye dayalı sınıflandırma boru hattını seçin. NOT: Sınıflandırma için &#39;CellProfiler Analyst&#39; de daha aşağı doğru analiz gereklidir. Ölü hücreler, flüorüre dayalı sınıflandırma yoluyla sınıflandırılır. </li></ol></li><li> Ekranın sol alt köşesindeki &#39;Çıktı Ayarlarını Görüntüle&#39;yi tıklayın. Analiz amaçlı görüntü dosyalarının konumunu (&#39;Varsayılan Giriş Klasörü&#39;) ve çıkarılan verilerin hedefini (&#39;Varsayılan Çıktı Klasörü&#39;) seçin. </li><li> Analiz işlemine başlamak için &#39;Analiz Et görüntüleri&#39; seçeneğini tıklayın. Analiz tamamlandığında, hesaplanan verileri görüntülemek için &#39;Tamam&#39;ı tıklayın ve&#39; Varsayılan Çıktı Klasörüne &#39;gidin. NOT: Örnek parametre değerleri ve resimleri Ek Dosya 1-CellProfilerProtocol.pdf&#39;de mevcuttur . </li><li> Morfolojiye dayalı sınıflandırma için (yalnızca) aşağıdakileri yapın. <ol><li> &#39;CellProfiler Analyst&#39; yazılımını açın, CellProfiler&#39;de oluşturulan veritabanı özellikleri dosyasını seçin ve &#39;Aç&#39; seçeneğini tıklayın. </li><li> Ekranın sol üst kısmındaki &#39;Sınıflandırıcı&#39; sekmesini tıklayın. Denemeden rastgele hücre görüntüleri çağırmak için &#39;Getir&#39;i tıklayın; Resimler sınıflandırılmamış pencerede görünecektir. </li></ol></li><li> Hücreleri uygun kutuya seçip sürükleyerek elle hücreleri pozitif (H3255) veya negatif (CCD-19Lu) olarak sınıflandırın (bkz. Ek Dosya 2-Boru Hattı.pdf: Şekil B ). Alt popülasyon başına en az 50 hücre sınıflandırdıktan sonra, &#39;Sınıflandırıcıyı Eğitin&#39;i tıklayın ve ardından&#39; Progress&#39;i izle&#39;yi tıklayın. NOT: Hücreler, kullanıcı denetimli random orman makinesi öğrenme algoritması 12 üzerinden sınıflandırılır. Doğruluk onaylanmış eşiğin (&gt;% 90) üzerinde değilse, geri dönüp &#39;CellProfiler&#39; üzerindeki hücre segmentasyonunu optimize etmek gerekebilir veya hücreler sınıf için ideal olmayabilirMorfoloji ile yenerek. </li><li> Her alt popülasyon için hücre sayıları içeren bir tablo oluşturmak için &#39;Tümüne Puan Ver&#39;i tıklayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kanemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+proliferative+activity+of+human+fetal+neural+stem/progenitor+cells+using+indirect+measurements+of+viable+cells+based+on+cellular+metabolic+activity.">Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity.</a> J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).</li><li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+pH+dependence+of+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay.">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li><li>Hsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+polyphenols+induce+differentiation+and+proliferation+in+epidermal+keratinocytes.">Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).</li><li>Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+image-based+profiling+of+perturbations.">Applications in image-based profiling of perturbations.</a> Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).</li><li>Sero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+the+microenvironment+regulate+nuclear+translocation+of+NF-kappaB+in+breast+epithelial+and+tumor+cells.">Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells.</a> Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).</li><li>Chen, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclassification+of+prostate+cancer+circulating+tumor+cells+by+nuclear+size+reveals+very+small+nuclear+circulating+tumor+cells+in+patients+with+visceral+metastases.">Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases.</a> Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).</li><li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound.">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li><li>Paraiso, K. H., Smalley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast-mediated+drug+resistance+in+cancer.">Fibroblast-mediated drug resistance in cancer.</a> Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).</li><li>Dao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+interactive+data+exploration,+analysis+and+classification+of+large+biological+image+sets.">CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).</li><li>Garvey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+image-based+method+for+quantitatively+studying+context-dependent+cell+population+dynamics.">A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics.</a> Sci Rep. 6, 29752 (2016).</li><li>Juarez, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+differences+in+cell+line+population+dynamics+using+CellPD.">Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD.</a> BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).</li><li>Mumenthaler, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Microenvironmental+Heterogeneity+on+the+Evolution+of+Drug+Resistance+in+Cancer+Cells.">The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells.</a> Cancer Inform. 14, 19-31 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

Hücre bazlı tahliller, temel araştırma ve ilaç geliştirme ayarlarında önemli bir yere sahiptir. Bununla birlikte, bu standart tayinlerin sınırlamaları, in vitro ve klinik veriler arasındaki uyumsuzluk ve çoğu ilaçların FDA onayını almaması nedeniyle giderek daha belirgin hale gelmiştir. Burada, eşzamanlı olarak ortaya çıkan çevre uyarılarına yanıt olarak heterosellüler fenotipleri eş zamanlı olarak analiz etmek için kantitatif görüntülemenin kullanılması için yeni bir yöntem sunuyoruz. Hücrenin yaşayabilirliğini ölçmek için kullanılan geleneksel hücre bazlı tahliller şunları içerir: tripan mavisi dışlama testleri, MTT / MTS ve Annexin V-FITC akış sitometrisi boyaması. Tripan mavisi dışlama testleri, basit ve ucuz olsa da, çok sayıda hücre gerektirir, zaman alıcıdır ve genellikle kullanıcı tarafından önyargılanmadan etkilenir 1 . MTT ve MTS tahlilleri, mitokondriyal metabolik hız ölçümleri yoluyla dolaylı olarak hücre yaşayabilirliğini ölçer. Bununla birlikte, metabolik aktiviteHücrelerin türleri, yanlış sonuçlara yol açan ve hücre tipleri ve koşulları 2 , 3&#39;te standartlaşmayı önleyen farklı kültür koşullarından (örneğin, ortam veya oksijen konsantrasyonu) etkilenebilir. Bu tekniklerin bir başka büyük dezavantajı, çoklu hücre tiplerini ayırt edememeleridir - çoğu biyolojik sistem heterosellülerdir. Akış sitometrisi yöntemleri çoklu hücre popülasyonları arasında ayırt etme yeteneğine sahipken, hücre etiketleri gereklidir, dinamik örnekleme zorludur ve yapışkan hücreler kullanıldığında bu uygulama zaman alıcı ve hata eğilimli hale gelir. Morfolojik değişiklikler de dahil olmak üzere diğer önemli hücresel fenotipler, çevresel uyaranlara yanıt olarak ortaya çıkar ancak geleneksel hücre bazlı tahliller tarafından yakalanmaz. Hücre durumlarını morfolojik karakterizasyon yoluyla profilleme ve benzerliklerini örnekler arasında haritalama,Temel hücre biyolojisi ve ilaç keşfi de dahil olmak üzere temel ve translasyonel araştırmaların birçok yönüne yeni anlayışlar kazandırmak. Ayrıca, tümör hücresi morfolojisinin tümör alt tipi 5 ve saldırganlık 6 ile korele olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla, bu hücresel özellikleri ve bunların belirli çevresel rahatsızlıklarla nasıl ilişkili olduklarını incelemek çok önemlidir. Ek olarak, ortak kültür sistemlerinde alt popülasyonlar arasında ayrım yapmak için morfolojik özelliklerin farklılıklarını kullanabilir. Floresan olarak etiketlenen hücrelerin düşüşleri vardır ( yani doğal hücre özelliklerini değiştirerek zaman alıcıdır) ve bu nedenle hücre tiplerini sınıflandırmak için ilave yöntemler avantajlıdır. Mikroskopi tabanlı görüntüleme, hücresel fenotipe çok katlı, kantitatif ve sağlam bir şekilde profil oluşturmada alternatif bir yöntemdir. Bu el yazmasında, nicel görüntüleme hattını, evriminBir tümör içindeki heterojen hücre popülasyonlarının nary dinamikleri. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) hücreleri ile tümörlerde bulunan en yaygın stromal hücre türü Kanserle İlişkili Fibroblastlar (CAF) arasındaki etkileşime odaklanırız. CAF&#39;ler tümörün başlatılması, ilerlemesi ve terapötik tepki ile ilişkilendirilmiştir; Bu nedenle CAFs yokluğunda tümör hücreleri üzerinde fenotipik analizler yapmak 7 , 8 , 9 yanıltıcı olabilir. Özellikle, KKH&#39;lerin klinik tedavisinde sıklıkla kullanılan Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörünü (EGFR) hedefleyen küçük bir molekül olan erlotinib&#39;e yanıt olarak CAF&#39;lerin tümör hücreleri üzerindeki etkilerini değerlendirdik. Değerlendirme için yüksek içerikli bir tarama platformu ve eşlik eden görüntü analiz yazılımını kullandık; Bununla birlikte, bu metodolojiyi diğer araştırmacılar tarafından erişilebilir kılmaya yönelik bir girişimde, açık kaynaklı yazılımları kullanarak karşılaştırılabilir bir aşağı akış protokolü geliştirdik:CellProfiler 10 ve CellProfiler Analisti 11 . Çoğu görüntü tabanlı yüksek içerikli tarama testleri, belirli bir enstrüman modeline özgü ticarileştirilmiş yazılımlarla analiz edilir. Altta yatan algoritmalar genellikle tescilli olduğundan sonuçları farklı yazılımlarla diğer laboratuvarlarda çoğaltmak zordur. Bu görüntü temelli boru hattını kullanarak, her iki floresans ve morfoloji bazlı sınıflandırmayı kullanarak, ilaç tedavisine yanıt olarak bir heterosellüler kültüre ait her bir alt popülasyonun hücre çoğalması, ölümü ve morfolojisi ölçülmüştür. Aşağıdaki protokol karmaşık hücresel proseslerin problanması için sağlam bir metodoloji sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:191px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">FBS</td>
			<td style="width:127px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15-140-122</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20 slides with trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450003</td>
			<td>cell counter slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">96-well plates</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td>clear bottom black plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Erlotinib</td>
			<td style="width:127px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">E-4007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">DMSO</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">317275-100ML</td>
			<td>solution to resuspend drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Hoechst</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">H21491</td>
			<td>nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td>dead cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Cell Tracker Orange CMRA</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
			<td>whole cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Operetta high content imaging system</td>
			<td style="width:127px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:127px;">Broad Institue</td>
			<td style="width:119px;">version 2.2.0 (rev 9969f42)</td>
			<td>http://cellprofiler.org/releases/</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &#186;C at 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:240px;">10 cm2 cell culture plates</td>
			<td style="width:127px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

Hücresel süreçler karmaşıktır ve çoklu hücre tipleri ve çevreleri arasındaki etkileşim sonucunda ortaya çıkmaktadır. Mevcut hücre biyolojisi teknikleri çoğu zaman bu etkileşimin doğru yorumlanmasına izin vermez. Kantitatif görüntüleme tabanlı bir yaklaşım kullanarak, heterojen hücre popülasyonlarının dinamik fenotipik tepkilerini ( yani morfoloji değişiklikleri, çoğalması, apoptozisi) çevre uyaranlarındaki değişikliklere karakterize etmek için yüksek içerikli bir protokol sunuyoruz. Uygulamaya bağlı olarak, flüoresan yoğunluğuna veya doğal morfoloji özelliklerine dayalı hücre tiplerini ayırt etme yeteneğimizi vurguluyoruz. Bu platform, geleneksel hücre biyolojisi tahlillerine kıyasla daha kısa süreler, daha az reaktif miktarı ve hata olasılığı düşük iken pertürbasyona alt popülasyon yanıtının daha kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlar. Bununla birlikte, bazı vakalarda, hücre popülasyonlarının belirlenmesi zor olabilir ve karmaşık cellu bazında nicelendirilebilirDaha fazla sorun giderme gerektirecektir; Protokolde bu koşulların bazılarını vurguluyoruz. Bu uygulamayı bir kanser modelinde uyuşturucuya tepki kullanarak göstermek; Bununla birlikte, diğer fizyolojik süreçlere daha kolay uygulanabilir. Bu protokol, bir ortak kültür sistemi içinde alt popülasyonları tanımlamaya ve her ikisinin de dış uyaranlara verilen tepkileri karakterize etmesine izin verir.

Toplam 4050 bireysel görüntü için üç tablaya karşı 25 alan / oyuk, 54 oyuk / plaka (3 hücre popülasyonu x 6 ilaç konsantrasyonu x 3 kopya) içeren bir görüntü seti ürettik. Deney boyunca üretilen görüntü setleri, hücrelerin alt popülasyonlarının sınıflandırılmasında kullanılan çeşitli kantitatif özellikteki hücrelerin ( örn., Morfoloji, flüoresan) özümlenmesi için tescilli yazılım kullanılarak analiz edildi (materyal tablosuna bakınız). Bununla birlikte, kullanılan ticari yazılımın erişimi sınırlı olduğundan, CellProfiler ve CellProfiler Analyst&#39;de karşılaştırılabilir downstream boru hatları oluşturuldu. Alt popülasyonlara Heteroselüler Sınıflandırma Çekirdekler, DNA lekesi (burada Hoechst) temel alınarak tanımlandı ve parçalara bölündü ve hücre popülasyonları floresans veya mo&#39;yaRfoloji ( Şekil 1 ). Floresan bazlı sınıflandırma için, fibroblastlar (CCD-19Lu) daha önce GFP-lentivirüs ile dönüştürülmüştür. GFP yoğunluk seviyeleri her çekirdek için ölçüldü ve kabul edilen eşiğin üstünde hesaplanan (arka plandaki sinyal temelli) CCD-19Lu olarak sınıflandırılırken, aşağıda belirtilenler tümör hücreleri olarak tanımlandı (H3255). Morfolojiye dayalı sınıflandırma için, hücreler daha önce toksik olmayan bir hücresel leke ile boyandılar (materyal tablosuna bakınız) ve bu sitoplazmayı tanımlamak ve parçalamak için kullanılmıştır. Her bir popülasyondan ~ 50-100 hücre ile bir makine öğrenme algoritması eğitildi. Popülasyonlar arasında önemli derecede farklı olan, daha sonra CCD-19Lu ve H3255 hücrelerini ayırmak için doğrusal bir sınıflandırıcı tasarlamak için kullanılan morfolojik özellikler belirlendi. Floresan ve morfoloji sınıflandırma protokolleri, iki hücre popülasyonunu ayırt ederken uyumlu% 97.4 (n = 1403) idiVe ilaçla tedavi edilen koşullarda (1 μM erlotinib)% 92.5 (n = 916) uyumlu bulunmuştur ( Şekil 2 ). Alt popülasyonların fenotipik analizleri Hücre tipleri arasında ayrım yapmanın yanı sıra, her alt popülasyonun fenotipik özelliklerini karakterize etmeyi amaçladık. Çoklama analizleri, zamandan ve reaktiflerden tasarruf sağlar, tutarlılık katar ve incelenen sistemle ilgili ek bilgi sağlar. Birçok potansiyel fenotipik çıktı vardır ve bunları ilginç sorulara dayanarak seçmelidir. Burada erlotinib tedavisine yanıt olarak hücre morfolojisi ve canlılık durumundaki değişiklikler araştırılmıştır. İlaç tedavisinden üç gün sonra, H3255 hücrelerinin nükleer alanındaki azalma ve hücresel alanın artışı gözlendi ( Şekil 3A ). Nükleer alan arasındaki ortalama farkIki taraflı tip-2 (eşit varyans) t- testi ( p = 7.92 x 10 -16 ) yoluyla &quot;ilaçsız&quot; ve &quot;ilaç&quot; uygulanan popülasyonların istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulundu. Bu gözlemin uyuşturucu tedavisi tarafından strese verilen hücresel bir yanıt olduğunu varsayarız. Ayrıca, bir ilacın, hücreler üzerinde sitotoksik ( yani , ölü hücrelerin sayısının zaman içinde artması) veya sitostatik ( yani , hücre doğumlarının zaman içinde azalması) etkisi olup olmadığının derin klinik etkiye sahip olup olmadığının incelenmesi ilgi çekicidir. Örneğin, bir sitostatik ilaç etkisi, büyümeyi durdurmaya neden olur, ancak hücreleri tümörden ortadan kaldırmaz, böylece kanser hücreleri ilaç uzaklaştırıldıktan sonra hücre proliferasyonunu yeniden başlatma potansiyeline sahiptir. İlaç etkileri genellikle bağlam, konsantrasyon ve hücre türüne bağlı olabilir. Bir hücre tipinde erlotinib&#39;in sitotoksik bir yanıt ortaya çıkardığını daha önce gözlemledik, buna karşın acBaşka bir dilde ytostatik yanıt 13 . Geleneksel canlılık testleri nispi hücre sayısını verir ve bu nedenle büyüme tutuklamaları ile hücre ölümü arasında ayrım yapmaz. Burada, ölen hücreler, propidyum iyodür lekesine dayanılarak tanımlandı ( Şekil 3B ). Erlotinibin H3255 hücrelerine karşı hem sitotoksik hem de sitostatik etkileri gözlendi, ölümlerin sayısında bir artış ve ilaç tedavisi sonrasında doğum sayısı azaldı ( Şekil 3C ). Hücrenin temizlenmesi yüzünden muhtemelen 1. günden sonra ölen hücrelerin sayısının düştüğü belirtilmelidir. CCD-19Lu hücreleri ilacından etkilenmedi. Bu platformun ek bir avantajı, nicel veri üretmektir. Örneğin, eş-kültür deneyimizde, 1178 (% 75.8) H3255 hücresinin ilk alt popülasyonunun erlotinsiz veya erlotinsiz üç gün sonra 2.817 (% 87.9) veya 396 (% 57.2) olduğu tespit edildiIb tedavisi (sırasıyla Şekil 4 ). Göreli yüzde yerine fiili hücre sayıları üretebildiğimiz için (akış sitometrisi yöntemlerinde olduğu gibi), ilaç tedavisi esnasındaki kompozisyon değişikliğinin CCD-19Lu&#39;da bir artış değil, H3255 hücrelerinde bir azalmaya bağlı olduğu sonucuna vardık. Deneysel olarak değerlendirilmesi zor ve muhtemelen hücre tipleri arasında farklılık gösteren hücre boşluğu nedeniyle ölüm oranlarının hafife alınabileceği hiçbir şeyin değeri yoktur. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> Şekil 1: Görüntü Analizi Protokolüne Genel Bakış. Hem morfolojiye dayalı sınıflandırma hem de flüoresans temelli sınıflandırma kullanarak heterosellüler popülasyonları sınıflandırmak için iki potansiyel downstream görüntü analizi boru hatları. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">Lütfen onu tıklayın</a>Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için e tuşuna basın. <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> Şekil 2: Morfoloji ve Floresan Temelli Sınıflandırma Arasındaki Uyumluluk. ( A ) İki sınıflandırma protokolünün örtüşmesini gösteren eşzamanlılık arsası. Aynı hücreler, hem morfoloji hem de flüoresan bazlı sınıflandırma kullanılarak H3255 olarak sınıflandırıldı. İki protokol, tedavi edilmemiş hücrelerin% 97.4&#39;ü (n = 1403) ve erlotinib ile tedavi edilen hücrelerin% 92.5&#39;i (n = 916) sınıflandırılmıştı (Not: beyaz alan görselleştirilemeyecek kadar küçüktür). ( B ) flüoresan esaslı ve morfolojik tabanlı sınıflandırma arasındaki iyi ve kötü eşzamanlılık örneklerini gösteren 10X görüntü. Beyaz oklar, platformlar arasında tutarsız olarak sınıflandırılan hücrelere işaret ediyor. Giriş görüntüsü: mavi çekirdekler (Hoechst); Yeşil - CCD19Lu (GFP). SınıflandırmaFication görüntüleri: Kırmızı - H3255; Yeşil - CCD-19Lu. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> Şekil 3: Tek Deneysel Kurulumdan Multiplexed Fenotipik Ölçümler. ( A ) Çekirdek ve hücre alanı gibi morfolojik özellikler, ilaç varlığında ve yokluğunda tek hücre seviyesinde hesaplandı. Not: 100 μm2&#39;den küçük ölçülen hücre alanları enkaz olarak kabul edildi ve analizlerden hariç tutuldu. Kutu çizimi, birinci ve üçüncü çeyrek aralıklarla ve% 95 güven aralığı hata çubuklarıyla medyanı göstermektedir. ( B ) H3255 (mavi) ve CCD-19Lu (yeşil) hücreler birlikte kültürlenmiş ve propidin yoğunluğuna göre ölü hücreler tespit edilmiştirIyodür boyası (kırmızı) ve 10X objektif kullanılarak görüntülendi. Ölçek çubuğu = 1 mm (üst panel); 100 μm (alttaki görüntüler). ( C ) Yaşayan ve ölen hücrelerin toplam sayısı, erlotinib ilavesi ile canlı hücrelerin sayısının belirgin bir şekilde azalması ve ölü hücrelerin artması ile, ilaç tedavisi olsun veya olmasın üç gün boyunca hesaplandı. Hata çubukları, üç kopyaya dayanan ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> Şekil 4: Zaman Üzerindeki Alt Popülasyon Dinamikleri. 0 veya 3. günde uyuşturucu ve ilaçsız H3255 (mavi) ve CCD-19Lu (yeşil) içeren kuyulardan temsilcilerin 10X görüntüsü. Her alt popülasyona ait hücreler sayılmış ve orantılı pasta grafikleri aNumuneler arasındaki nüfus kompozisyonunda ctual değişim. Ölçek çubukları = 1 mm (orta paneller, en soldaki panelde), 1 mm (üst resim), 100 μm (alttaki görüntüler). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques at JoVE.com

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Değişikliklere tepki olarak heterosellüler popülasyon dinamiklerini incelemek için yeni bir protokol geliştirdik. Bu el yazması heterosellüler popülasyonların çoklu hücresel fenotiplerinin aynı anda karakterize edilmesi için nicel veri kümeleri üreten görüntü tabanlı bir platformu açıklamaktadır.

Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

discrimination-characterization-heterocellular-populations-using

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Görüntüleme.  University of Southern California (USC).  Değişikliklere tepki olarak heterosellüler popülasyon dinamiklerini incelemek için yeni bir protokol geliştirdik. Bu el yazması heterosellüler popülasyonların çoklu hücresel fenotiplerinin aynı anda karakterize edilmesi için nicel veri kümeleri üreten görüntü tabanlı bir platformu açıklamaktadır. 

Video: Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biyoloji

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Görüntüleme Ca Teknikleri 2 + İnsan Sperm sinyal

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Hücre içi Ca Ölçme<sup&gt; 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm&gt; Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Oositler

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...