ככל שהוא משמש לביצוע רצף ChIP יעיל של חלבוני אסתר ולא אסתר ברקמת השומנים החומה מבודד מהעכבר. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא כי הפרוטוקול כבר אופטימיזציה עבור immunoprecipitation יעיל של קומפלקס הקשורים כרומטין מרמת השומנים. לפני החתך, לרסס את העכבר המתת דם עם 70% אתנול.
מניחים את העכבר עם הגב פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן לבצע חתך לאורך הצוואר. לאחר מכן, ממוקם BAT ישירות מתחת לעור בין הכתפיים בזהירות להסיר את השכבה הדקה של שומן לבן. לחצות כל כרית BAT ב 10 מיליליטר של PBS המכיל 1% פורמלדהיד במשך 15 דקות ב 150 סל"ד בטמפרטורת החדר.
לאחר 15 דקות, מרווה את ההצלבה על ידי הוספת 2.5 גליצין טוחן ל BAT, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 125 מילימולר. מניחים אותו על שייקר במשך חמש דקות, מסתובב ב 150 סל"ד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להעביר את כרית BAT ל 500 microliters של חיץ תזה היפוטונית ולהוסיף שני חרוזים נירוסטה עבור כל כרית BAT.
לאחר מכן, השתמש הומוגניזר רקמות מבוסס חרוזים לגרוס את הרקמה. התחל עם חמש דקות בה הספק מרבי. במידת הצורך, להאריך את הזמן עד הרקמה הומוגנית תאים בודדים מופרדים.
מעבירים את הדגימה לצינור חדש, וצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב 16, 000 גרם במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, להעביר את supernatant לתוך צינור חדש ולשמור את גלולת התא על הקרח. צנטריפוגה supernatant בארבע מעלות צלזיוס ב 16, 000 G במשך 10 דקות כדי למנוע אובדן של תאים צפים.
לאחר מכן, להשליך את supernatant הסופי מחדש להשעות את שני כדורי התא יחד 300 microliters של חיץ תזה SDS עם מעכב פרוטאז פעם אחת. דגירה על קרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, sonicate lysates כדי ליצור שברי DNA 200 כדי 500 זוגות בסיס ארוך.
לאחר sonication, להסיר פסולת על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 16, 000 G בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבצע immunoprecipitation, לשמור 1% של פתרון כרומטין בצד כמו קלט ChIP ולשמור את התשומות לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מוסיפים את הנוגדן ChIP למיליליטר אחד של פתרון כרומטין ולבצע immunoprecipitation מקביל עם IgG טרום חיסון המתאים או IgG נורמלי של אותו מין.
לחלופין, יש לשמור מיליליטר אחד של תותר כרומטין לבקרת נוגדנים ללא צורך בשליטה בנוגדנים. דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב. כדי לאסוף את מתחמי החיסון, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של חלבון Agarose 50% תרחיף למתחמי החיסון ותדקרו במשך שעה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-150 סל"ד.
לאחר שעה, גלולה את חרוזים על ידי צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 1000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. בצע שטיפות רציפות של חרוזים על 0.45 מיקרומטר PVDF עמודי מסנן צנטריפוגלי עם מאגרים של מחמירות גוברת על ידי העברת תחילה את חרוזים בעמודים עם 500 microliters של מאגר שטיפת מלח נמוך. לאחר מכן, גלולה את חרוזים בעמודים במשך שלוש דקות ב 2500 G.השלך את הזרימה דרך.
חזור על לשטוף עם מאגר שטיפת מלח גבוהה על פי נהלי שטיפת מלח נמוכה. לאחר מכן, חזור על ההליכים עם ליתיום כלורי ולבסוף עם TE פעמים אחת. לאחר השלמת הכביסה, יש לסלק את מתחמי החיסון על ידי הוספת 300 מיקרוליטרים של מאגר אלוט לתהלומות גלולות בעמודים. דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות על שייקר ב 400 סל"ד.
לאחר מכן, לאסוף את האלוט על ידי סיבוב במורד העמודים במשך שלוש דקות ב 2500 G בצינור טרי. הפוך את הקישורים הצולבים על ידי דגירה של האלוט והתשומות שנאספו ב 65 מעלות צלזיוס לילה. כדי לשחזר את הדנ"א, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של PHenol chloroform IAA ל-elute והקלטות ביחס של אחד לאחד ומערבולת למשך 10 שניות.
לאחר מכן, סובב למטה ב 21, 000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. שמור את גלולה ולהשליך את העל טבעי. לשטוף את גלולה עם מיליליטר אחד של קר 70% אתנול.
ואז להסתובב למטה ב21, 000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי וייבשו את האוויר. להשעות מחדש את גלולה ב 70 microliters של מים ללא DNAse להליכים נוספים.
הנה דוגמה של CHIP Q PCR באמצעות BAT מבודד מן סוג פראי או GPS2-A עכברי נוקאאוט. מאז GPS2 נמצאה להידרש לביטוי של גנים מיטוכונדריים מקודדים גרעיניים בקווי תאים שונים, הגיוס של GPS2 נבדק על שני גנים מיטוכונדריים מקודדים גרעיניים ספציפיים. NDUFV1 ו TOMM20 ב BAT מעכברים כדוגמאות של רקמה מועשרת מאוד במיטוכונדריה.
תפוסת מקדם GPS2 הושוותה בעכברי נוקאאוט GPS2-A ובשותפים לאות מסוג פראי. ירידה צפויה נצפתה ב-GPS2 מחייבת גנים של מטרה סלקטיבית ב-BAT מעכברי נוקאאוט GPS2-A. באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, כריכה מוגברת של RNA פולימראז 2 ואת סימן היסטון דכאני, H3K9ME3, נרשם BAT מ עכברי נוקאאוט GPS2-A בהשוואה לחברים מכתב סוג פראי.
תוצאות אלה מאשרות את גיוס GPS2 על גנים מיטוכונדריאליים מקודדים גרעיניים נבחרים ומראות כי GPS2 נדרש למניעת הצטברות של H3K9ME3 ולכן נדרש להתעכב של פעילות מיתמל מוט שני על מקדמי היעד. הפרוטוקול המתואר כאן, גם אם אופטימיזציה ספציפית עבור רקמת השומן החום, מייצג כלי מוערך לביצוע ChIP מרקמה אחרת מורין אנושי. אל תשכח כי עבודה עם phenochloroform יכול להיות מסוכן מאוד.
לכן, חשוב מאוד תמיד לפעול מתחת למכסה המנוע של האדים תוך שימוש בריג'נט זה.
