המחברים רוצה להודות קית Tarpley אותנו לאיכות הסביבה במשרד ראש צוות פיתוח, מחקר, פיתוח-Research Triangle Park (ORD-RTP) גרפיקה ומדיה מדביק, ועריכה של וידאו הדרכה. כן נרצה להודות דבורה פריטצ'ט מ ProteinSimple לשיחות מועיל לגבי אופטימיזציה של הנתונים שלנו,. JM Guynn נתמכה על ידי המכון אוק רידג המדע, החינוך תוכנית מחקר/השתתפות ב לנו מסוכנות ההגנה על הסביבה.

הערה: להבטיח כי כל ריאגנטים ודוגמאות מוכנות על פי היצרן &#39; פרוטוקול s, המפורטות להלן. בבקשה ללבוש ציוד למיגון אישי תקין במהלך הליך זה, אשר כוללת nitrile כפפות, חלוק המעבדה, סגור-נעל בטיחות משקפי מגן. טבלת חומרים ספציפיים, ראגנטים וציוד נדרש מסופק בנפרד. ריכוז החלבון הכולל של דגימות צריך להיקבע מראש באמצעות מתודולוגיות הוקמה התואמים המאגר lysate בשימוש, כגון ברדפורד assay 11.
 1-הכנת ודוגמאות מן הלהקה רגיל כפי שסופקו על ידי היצרן <ol><li>כדי להכין את הפתרון עובד 400 מ של dithiothreitol (DTT), להוסיף מים µL יונים 40 צינור נקי המכיל מניות שסופקו מהיצרן. חשוב להימנע מהחדרה בועות לפתרון על ידי ערבוב הפתרון עם איטית ועדינה pipetting.</li>
	מאגר מדגם <li>µL להוסיף 20 10 X ו- µL 20 של הפתרון DTT מוכן 400 מ ל הצינור ורוד המכיל פלורסנט 5 X מיקס מאסטר (ראה את הטבלה של חומרים). 
	הערה: מיקס מאסטר (מ מ) חתום על ידי היצרן עם כיסוי רדיד, חייב להיות נעוץ טיפ פיפטה. מערבבים בעדינות על-ידי pipetting איטי כדי להימנע שכשוך DTT פיפטה.</li>
	<li>הבא, מוסיפים מים µL יונים 16, 2 µL של מסופקים 10-מאגר דוגמאות, ו- 2 µL של הפתרון DTT מוכן 400 מ ל הצינור הסולם biotinylated לבן המסופקים על ידי היצרן. מערבבים בעדינות ולהעביר לתוך צינור 0.6 מ"ל עבור denaturing.</li>
	<li>הכנת 0.1 x דוגמת המאגר על ידי דילול 10 שסופקו X מטריים פתרון עם מים. להכין מספיק 0.1 x דוגמת המאגר כדי לדלל את כל הדגימות.</li>
	<li>לחשב את כמות 0.1 x מדגם מאגר זה מתווסף מדגם, אשר יהיה תלוי הריכוז הרצוי הסופי של החלבון הכולל. לערבב 1 חלק 5 x מ מ פלורסנט עם 4 חלקים מדולל הדגימה כדי להשיג ריכוז החלבון הסופי הרצוי.
	<ol><li>חישוב כרכים כלהלן: (i) כרך ה' x מ מ פלורסנט = (ריכוז החלבון הסופי הרצוי) / 5; (ii) כמות חלבון מניות = (ריכוז החלבון הסופי הרצוי x הנפח הכולל הדרוש) / חלבון מלאי ריכוז; (iii) נפח 0.1 x מדגם מאגר = הנפח הכולל - 5 x מ מ נפח - חלבון מניות נפח.</li>
	</ol></li></ol> 2. דנטורציה של הסולם ודוגמאות <ol><li>biotinylated הסולם בתוך גוש חום 95 ° C עבור 5 דק וורטקס צינורות מיד לאחר דגירה, ודוגמאות המקום מוכן לבצע סיבוב ~ 5 s שולחן צנטריפוגה, ובמקום על קרח 
	הערה: חלבונים מסוימים עשויים לדרוש תנאים denaturing עדינה (למשל, 70 o C 10 דקות) כדי למנוע צבירת חלבון ולשפר את ההעברה המטריצה נימי. לשקול אפשרות זו אם יש כבד מריחת משקלים מולקולרית גבוהה יותר (ראה וידאו לדוגמה).</li>
</ol> 3. הכנת נוגדנים <ol><li>כפי שנקבע על ידי אופטימיזציה (ראה תוצאות נציג או וידאו), להכין את dilution(s) הרצוי של נוגדן ראשוני (למשל, 1:50, 1: 100) בהנוגדן שסופקו Diluent 2. 
	הערה: נוגדנים משמשות בדרך כלל בריכוזים גבוהים עבור המבוסס על נימי מתכלה מאשר עבור סופג המערבי המסורתי. הנוגדן משני המסופק הוא מוכן לשימוש ללא דילול.</li>
</ol> 4. הכנת הלומינול-S, מי חמצן <ol><li>להכין תערובת של 1:1 של הלומינול-S מי חמצן-</li>
	<li>מערבולת לערבב ולאחסן על קרח 
	הערה: חשוב כי תערובת זו הוא מוכן טרי כל assay ניסיוני. מיקס הכולל 250ul יש צורך להפעיל את צלחת מלאה.</li>
</ol> 5. הכנת צלחת assay <ol><li>כפי שמוצג באיור 1, טען דגימות של ריאגנטים המוכן מעל המשקולת וזמינותו. ראה הוראות מפורטות להלן עבור כל שורה. כדי למזער את אידוי מן הבארות, להבטיח כי המכסה צלחת מוחלף בין תוספות ריאגנט.</li>
	<li>בשורה A, pipet 5 µL של הסולם Biotinylated לתוך A1 היטב. עבור השורה שנותרה, pipet הכין דגימות (5 µL כל) לתוך בארות A2-A25. 
	הערה: זה הכרחי כי A1 מכיל טוב תמיד הסולם, כמו נימי הראשון במחסנית ממוטבת עבור הפעלת בתקן זה.</li>
	<li>בשורה B, pipet 10 µL של נוגדן Diluent 2 לבאר כל (B1-B25).</li>
	<li>בשורה C, pipet 10 µL של נוגדן Diluent 2 לתוך C1 היטב. בשורה הנותרים C בארות, pipet 10 µL של נוגדן ראשוני (בארות C2-C25).</li>
	<li>בשורה D, pipet 10 µL של Streptavidin-HRP לתוך D1 היטב. בשורה הנותרים D בארות, pipet 10 µL של נוגדנים משניים (בארות D2-D25).</li>
	<li>בשורה E, pipet 10 µL של המיקס הלומינול-חמצן טרי כל טוב (E1-E25).</li>
	<li>לבסוף, להוסיף מאגר לשטוף µL 500 לכל תא לכל השורות top 3 של מאגר בארות. 
	הערה: חשוב למזער את היווצרות בועה pipetting בעדינות, לא גירוש האחסון הסופי מהקצה כמו בועות עשויה להפריע נימי לטעון ולהפעיל.</li>
	<li>פעם הבארות כל נטענים, centrifuge את הצלחת-1000 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להסיר את הבועות ולהבטיח את הנוזל הוא בחלק התחתון של הבארות. פופ בועות גלוי עם טיפ קטן פיפטה או מחט נקי (לדוגמה, סטרילי 25 מד &#34; נציג העליון &#34; מחט).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> איור 1 . תבנית pipetting לצלחת assay. קודי הצבע מייצג נכונה ריאגנטים ודוגמאות (סה כ עד 24) הוסיף לצלחת וזמינותו. להוסיף biotinylated הסולם (כתום), ובכן A1 הכין דגימות מבארות A2 עד A25 (תכלת), 2 Diluent נוגדנים לבארות B1 B25 ו- C1 (אור ירוק), נוגדן ראשוני כדי בארות C2 עד C25 (כחול), streptavidin-HRP כדי D1 טוב (ורוד כהה), נוגדנים משניים כדי בארות D2 עד D25 (ירוק כהה), ולערבב הלומינול-חמצן בארות E1 עד E25 (סגול). מאגר שטיפת מתווסף בשלוש השורות הראשונות של אמצע צלחת גדולה יותר וולס (כחול כהה). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
 6. הפעלת המכשיר מתכלה נימי <ol><li>ודא כי המכשיר והמחשב הנלווה מופעלים. אין לחמם את הזמן הדרוש.</li>
	<li>פתח את התוכנה מכשור במחשב. ראשית, בחר &#34; Assay &#34; טאב בצד ימין של החלון, &#34; Assay חדש &#34; תחת &#34; תפריט קובץ &#34; בצד השמאל. בחר את גודל, גודל טווח (למשל, 12-230 kDa) ואת מחסנית סוג (למשל, נימי 25) שבו נעשה שימוש עבור וזמינותו מסוים. 
	הערה: אחד במאי גם קלט assay פרמטרים, כולל ריכוז חלבון, סוג נוגדן של דילול, אם רצונך בכך, אך אלה אינם נדרשים להתחיל וזמינותו.</li>
	<li>פתח את הדלת על המכשיר על-ידי לחיצה על הכפתור בראש החלונית ' תפוז '.</li>
	<li>הסר בזהירות את מחסנית נימי מאריזתו. בלי לגעת הנימים זכוכית עצמם, למקם את המחסנית בעל מחסנית. ודא מחסנית ישיבה על ידי התבוננות את התאורה הפנימית לשנות מ orange לכחול.</li>
	<li>להחזיק את הצלחת בחוזקה על הספסל, לקלף בזהירות את החותם אידוי מן החלק התחתון של הלוח. פופ בועות לראות בבארות מטריקס אלה ההפרדה עם משכל אורח/ים ילד/pipet עצה או מחט נקי (לדוגמה, סטרילי 25 מד &#34; נציג העליון &#34; מחט).</li>
	<li>למקם את הצלחת assay על לוחית, להבטיח שהוא מתיישב, וסגור את הדלת מכשיר.</li>
	<li>לחץ &#34; התחלה &#34; כפתור בתוכנה. 
	הערה: אם אין לחצן ' התחל ' מופיע, הקשר עם המכשיר אבד. לבחור מכשיר בתפריט השמאלי העליון, ולאחר מכן חבר. מוקפץ אמור להופיע עם המספר הסידורי כלי; בחר באפשרות זו ולאחר מכן לחץ על התחבר. לחצן התחל עכשיו אמור להופיע.</li>
	<li>בסיום המרוץ, למחוק את הצלחת. הסר את מיכל הדיו ומניחים במיכל החדים עבור סילוק, יחד עם מזרקים זה אולי שומש כדי יבעבע. להשאיר את הכוח כדי למנוע בעיות התחברות אם המכשיר נמצא בשימוש באופן קבוע (למשל, אחת לשבוע לפחות).</li>
</ol> 7. ניסוי ניתוח <ol><li>לפני ניתוח, להבטיח איכות הבדיקות הבאות מבוצעות.
	<ol><li>תקנים פלורסנט אימות על-ידי בחירה &#34; תקנים להראות &#34; סמל. בדוק כי הסטנדרטים מזוהים כראוי &#34; תצוגת גרף &#34; טאב. אם הם אינם נכונים, ללכת &#34; תצוגה יחידה &#34; סמל, לחץ לחיצה ימנית על הפסגה נכונה ובחר &#34; תקן כוח &#34;, או לחץ לחיצה ימנית על הפסגה שגוי ובחר &#34; לא תקן &#34;. בצע בדיקה זו עבור כל נים חדשים.</li>
		<li>אימות הסולם biotinylated על ידי לחיצה על &#34; דגימות &#34; ו &#34; תצוגה יחידה &#34; סמלים. בחר את הסולם בכרטיסיה הניסוי. אם לשיא מזוהה באופן שגוי, לחץ לחיצה ימנית על זה &#34; תצוגת גרף &#34; ובחר &#34; הסר שיא &#34;. 
		הערה: לדוגמה, הסולם biotinylated המשמש עבור ערכת kDa 12-230 צריך להראות 12, 40, 66, 116, 180 ו- 230 kDa שנקודות פסגות. אם שלב זה לא מבוצע, שינוי גודל של הפסגות מדגם באופן שגוי יחושבו, הפקת תוצאות כדין.</li>
		<li>תצוגה וניתוח פסגות לדוגמה. להפיק נתונים מהטבלה ' פסגות ', כולל משקל מולקולרי, באזור השיא, שיא גובה אות רעש (S/N), כנדרש לצורך חישובים ניסיוני.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hematopoietic stem cell protocols. 1185, (2014).</li><li>Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+(hiPSC-CMs)+to+Monitor+Compound+Effects+on+Cardiac+Myocyte+Signaling+Pathways.">Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways.</a> Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).</li><li>Chen, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+endogenous+proteins+with+precision+and+accuracy+using+a+capillary+Western+system.">Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system.</a> Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).</li><li>Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+nano-immunoassays:+advancing+quantitative+proteomics+analysis,+biomarker+assessment,+and+molecular+diagnostics.">Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics.</a> J Transl Med. 13, 182 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Application+of+a+Novel+Nanovolume+Capillary+Electrophoresis-+Based+Protein+Analysis+System+in+Personalized+&amp;+Translational+Medicine+Research.">The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized &amp; Translational Medicine Research.</a> J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).</li><li>ProteinSimple Western. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western++blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+Western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis.">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> J Vis Exp. (84), e51149 (2014).</li><li>Thorn, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+pathways:+pharmacodynamics+and+adverse+effects.">Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects.</a> Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> J Vis Exp. (38), (2010).</li><li>Taira, N., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+p53+tumor+suppressor:+determinants+of+its+functional+targets.">Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets.</a> Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).</li><li>Thompson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+p53+on+key+serines+is+dispensable+for+transcriptional+activation+and+apoptosis.">Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis.</a> J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).</li><li>Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+Gene+Biomarker+at+the+Tipping+Point+of+Adaptive+and+Adverse+Responses+in+Human+Bronchial+Epithelial+Cells.">Developing a Gene Biomarker at the Tipping Point of Adaptive and Adverse Responses in Human Bronchial Epithelial Cells.</a> PLoS One. 11 (5), e0155875 (2016).</li><li>Moser, A. C., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-based+immunoassays:+principles+and+quantitative+applications.">Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications.</a> Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , (1997).</li><li>. Wes reagents and consumables :: ProteinSimple Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html">https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</a> (2017)</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים. כתב יד זה נבדקו על ידי נבחרת בריאותם של מעבדת המחקר השפעות סביבתיות ואושרו לפרסום. התוכן ואינם משקפים בהכרח של המשרד לאיכות הסביבה אותנו ולא עושה איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים מהווים המלצה או המלצה לשימוש.

במשך עשורים, היו מתמשכת ההתעניינות בפיתוח שיטות מתכלה electrophoretic המבוסס על נימי עקב נמוך ריאגנט ולדגום ההוצאה, ירד עיבוד זמן בהשוואה לשיטות מסורתיות וגבוה תאימות ל להפוך לאוטומטיות הליך ה-4,15. ישנם מספר פרוטוקולים שונים עבור הפרדת חלבונים אשר נעזרו נימים, כולל פולימר electrophoretic, electrokinetic, ניפוי, ושיטות לגירויי כאב, אשר לבודד חלבונים לפי מאפיינים שונים (בהתאמה, מטען אלקטרוסטטי, שיווי משקל המחיצה, ניפוי מאפיינים של מטריקס הפרדת, ו pH)16. כאן, אנו מתארים של השיטה אלקטרופורזה נימי נוגדן מבוסס (או מתכלה), באמצעות פולימר ניפוי הפרדה, יש כבר אוטומטי ומסחרית המאומץ3. היתרונות של מערכת זו כולל קלות שימוש, מבצע, ריאגנטים סטנדרטית ו זמינים מסחרית, מדידות אמין, רגיש הדורשים פחות ריאגנט ודוגמאות לעומת מבחני חלבון מסורתיים כגון, תספיג חלבון מקושרים-אנזים מתכלה, ועוד פורמטים3,4,5. זה נרשמה בהערכות קודמות של טכנולוגיה זו כי הטווח בגודל של חלבון זה יכול להיות מוערך יש היה מוגבל על-ידי הפרדה זמין מטריקס4ההנפקות אולם האחרונות הרחיבו את טווח מדידה 2 440 kDa17 . בנוסף, כמה מאגרי lysate ידועים להיות תואם ל- assay18, ולכן מבחר ריאגנטים ניסיוני המשמש יש לקחת בחשבון מראש.
היתרון העיקרי של הליך אוטומטי עם רכיבים זמינים מסחרית היא עקביות של תוצאות באמצעות שיטות מתוקננת, ריאגנטים. פעולה זו מקטינה את הסיכוי לכשל assay על ידי מיכון שלבים קריטיים בתוך השגרה. עם זאת, חשוב לציין כי פרקטיקות מסוימות חייב להיות דבקה במהלך פרוטוקול כדי למזער בעיות מיכשור וציוד נימי מבוסס על electrophoretic. קודם, זה קריטי כי התערובת הלומינול-S/מי חמצן מוכן טרי ומיד לפני צלחת טעינה. תזמון עקבי תגרום לומינסנציה עקבי אחרי הסוכן חמצון נוסף, אשר תגרום המידות עקבית עבור וזמינותו נוגדנים מסוימים לאחר assay. יתר על כן, חשוב כי ריאגנטים שפג תוקפו שאינם משמשים, אשר משפיע בעיקר את העוצמה של סוכן חמצון. בנוסף, חשוב כי סדר טעינה של דגימות, נוגדנים, וחומרים אחרים אך ורק לאחר מכן (ראה איור 1). כל ריאגנט pipetted מהמקום יביא כשל assay, ריצה מבוזבז.
מלבד השלבים הקריטיים, בעיות העיקרי חוו עם הטכניקה ניתן בדרך כלל להתגבר באמצעות אופטימיזציה. אכן, תנאים אלה ספציפיים לכל שילוב מערכת/נוגדן מודל, לכן צריך להיות נחוש מדעית עבור כל assay חדש. במאמר זה, אנו מתמקדים שלושה הליכים אופטימיזציה נפוצות: זמן החשיפה טיטור lysate, דילול נוגדן ראשוני. היכולת להפיק תוצאות הניתנות למדידה תלוי ניתוח של מועד החשיפה כאשר המצע הלומינול לא להיות במהירות תיגמר, כתוצאות המצע דלדול לאובדן של האות. טיטור lysate קובע את הטווח הדינמי ליניארי של כל assay, שיכול להיות שונה עם מערכות מודל שונה, כמו גם נוגדנים שונים, אפילו בשביל חלבון לאותו היעד. נוגדן דילולים שבחרת ליד קולח ריכוזי או להבטיח שינויים אות לא יושפעו על ידי מחסור נוגדן חינם, אלא רק על ידי כמות חלבון זמין היעד epitope שונות. שיקולים אחרים במהלך תהליך אופטימיזציה עשויים לכלול זמן הדגירה נוגדן ודגימת לערום/זמן טעינה. ברוב המקרים הגדרות ברירת המחדל עבור הכלי מציעים את האיזון הטוב ביותר של רזולוציה ורגישות. עם זאת, במקרים מסוימים, רזולוציה נמוכה או רגישות ניתן לשפר באמצעות התאמת הפרמטרים האלה.
ראגנטים נימי electrophoretic מבוססי שיטות מספקים מדידות חלבון מהיר, יעיל, ו לשחזור. שיטות אלה כבר נעזרו בעיקר בהגדרות מחקר ופיתוח, מרקם של טכנולוגיות אלה יש פוטנציאל השירות יישומים קליניים ולניהולו. לדוגמה, זיהוי subpopulations רגישים חשיפה לרעלים סביבתיים או חולים עם התקדמות המחלה יכול להיות מבוסס על חלבון סמנים ביולוגיים נמדד מטריצות נגישים, כגון דם, שתן ורוק. ריאגנט של ירידה במחיר מבצע, מספר מטרות שניתן המוערך בו זמנית מגביר ודוגמאות, שנראה סביר מתכלה נימי electrophoretic המבוסס על שיטות המשמשות עבור סוגים אלה של יישומים.

נימי immunoassays electrophoretic ביטוי חלבון lysates תא באמצעות מערכות הפרדה גודל או תשלום וכולן מספקות כמה יתרונות על פני immunoassays המסורתי. לדוגמה, כאשר לעומת תספיג, ההליך ממוכנת המבוססת על נימי מבטלת את הצורך ג'ל, העברת התקנים, ושוטף ידני. בנוסף, כמות החלבון הנדרש המוחלט נמצא כ 10 פעמים פחות, ביצוע מערכות מבוססות נימי אידיאליות לשימוש עם סוגי תאים נדיר או מדגם מוגבל1,2. תוצאות מתקבלים קצת כמו 3 שעות באמצעות מערכות אוטומטיות, בעבר הוכחו להיות כמותיים יותר לשחזור מאשר המערבית הקונבנציונלית כתם הליכים3,4,5. תהליך מבוסס-גודל מבחני מורכב טעינה בדגימות המכיל נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות), dithiothreitol (DTT), ומתויגים fluorescently משקל מולקולרי סמני לתוך עמודות נימי המכיל סידור בערימה והפרדה מטריצות. מתח חלה על הנימים מפריד את החלבונים הדגימות בהתאם לגודל, אור UV עוצר את החלבונים מופרדים לקיר נימי. נים זה אז חיסונית-שנבדק עם במטרה העיקרית נוגדן וחזרת peroxidase (HRP)-נוגדנים משניים מצומדת. הלומינול ותחמוצת המימן לעודד דור אור chemiluminescent, אשר נמדדת מצלמה בשילוב התקן (CCD) תשלום, ניתח quantitate חלבון.
למרות בקלות יחסית המהירות של פלטפורמת מיכשור וציוד electrophoretic אוטומטית מבוססת-נימי, אופטימיזציה של assay תנאים כגון ריכוז חלבון, דילול נוגדן זמן החשיפה חשובה להשגת מדויק, לשחזור תוצאות. באופן כללי, הפרוצדורות הבאות יש לבצע כדי למטב וזמינותו של מערכות אלה:
1) מסך צריכה להתבצע להעריך ולבחור נוגדנים עבור האות וספציפיות אל המטרה חלבון. אם הוא זמין, חלבון מטוהרים או היעד epitope ניתן להשתמש כדי להעריך ירידה לפרטים; עם זאת, עדיין חשוב להעריך את פוטנציאל אות לא ספציפית הכוללת חלבון הטרייה מערכת מודל.
2) הבא, הטווח הדינמי של וזמינותו צריך להיקבע. במצב אידיאלי, לסמן הכפלה (נמדד בעזרת שיא) נצפית כמו ריכוז מדגם מוכפל; עם זאת, בפועל, שינוי ביחס אות קלט באופן צפוי (למשל, לינאריות מתאים) מספיקה על כימות חלבון. בנוסף, מיטוב זה מגדיר את ריכוז חלבון קליטה גבוהה אך עדיין בתוך הטווח. ליניארית עבור דגם ניסיוני.
3) לקבוע ריכוז נוגדן אופטימלית באמצעות ריכוז חלבון קבוע נבחר אופטימיזציה בשלב 2. ריכוז נוגדן גודלת, האות מגדיל עד זה מישורים-רוויה. ריכוז נוגדן ליד רמת רוויה זו נדרשת עבור מדידה מדויקת של ריכוז חלבון.
התהליך המשמש כדי למטב את ריכוז חלבון נוגדן דילולים, פעמים חשיפה וזמינותו גודל אוטומטי המבוסס על נימי6 הוכח באמצעות תמציות התא כולו מבודד BEAS-2B, אדם SV-40 טרנספורמציה הסימפונות שורת תאים אפיתל. בידוד חלבון של תמציות תאים או רקמות יכול להתבצע באמצעות מספר פרוטוקולים שפורסמו7,8,9 , לא יכוסו כאן. התוצאות של ניסוי הניסיון להשתמש בתנאים אופטימליים גם דיווחו על סך ובעלות phosphorylated (סרין 15, סרין 20) p53 בתרבויות נחשפים דוקסורוביצין (נפוץ כימותרפיות סוכן אשר מעוררת אפופטוזיס תא10) ב- 1.2, 1.8, ו 2.4 מדיה µg/mL עבור 4 h לפני הקציר. האזורים שיא p53 הם מנורמל ל ɑ-טובולין, אשר משמש פקד הטעינה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wes instrument</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td>004-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P53 DO-1 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-tubulin primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873</td>
			<td>used as a loading control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass Software</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td></td>
			<td>provided with the Wes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-230 kDa Master kit</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&#160;</td>
			<td>PS MK02 (since replaced by a new kit #)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td>
			<td>INCLUDES PART NO: 
			Wash Buffer (60 mL) 042-202 
			10X Sample Buffer (440 &#956;L) 042-195 
			Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 
			Capillary Cartridges (8) PS-CC01 
			Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 
			Luminol-S (1.5 mL) 042-233 
			Peroxide (1.5 mL) 042-234 
			Streptavidin-HRP (132 &#956;L) 042-414 
			Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 
			Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 
			or 
			Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte growth medium, KGM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192152</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte basal medium, KBM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192151</td>
			<td>serum free medium for chemical dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue Bradford Assays</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>23200</td>
			<td>for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Extract kit</td>
			<td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D1515</td>
			<td>used to prepare whole cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INCLUDES:</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer AM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M dithiothreitol (DTT)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X PBS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method

טכנולוגיות חדשות לנצל המבוסס על נימי immunoassays מבטיח הערכה כמותית יותר ויותר חלבון בהשוואה immunoassays המסורתי. בדומה מבחני נוגדן מבוססי חלבונים אחרים, אופטימיזציה של פרמטרים המבוסס על נימי מתכלה, כגון ריכוז חלבון, דילול נוגדן זמן החשיפה עם זאת, תנאי מוקדם חשוב לדור של אמין ובעל משמעות נתונים. מדידות חייב ליפול בתוך הטווח. ליניארית של וזמינותו איפה לשינויים אות יחסי ישירות לשינויים בריכוז lysate. תהליך בחירת המתאים ריכוזי lysate נוגדנים דילולים, פעמים חשיפה בשורה תאי אפיתל הסמפונות אדם, BEAS-2B, הוא הפגין כאן. ליניאריות assay מוצג על טווח של תאים כל תמצית חלבון ריכוזים עם נוגדנים p53 וα-טובולין. דוגמה של האות שחיקה נתפסת בבית את הריכוזים הגבוהים ביותר עם חשיפה ארוכה פעמים, מעגל דילול של נוגדן α-טובולין מוצג הוכחת רוויה. בנוסף, מדווחים תוצאות ניסויית דוגמה עבור תאים שטופלו דוקסורוביצין באמצעות פרמטרים אופטימליים.

זמן החשיפה - שחיקה אות הקובע
האות שחיקה עשויה להתרחש כאשר המצע הלומינול ותחמוצת המימן תיגמר מהר מדי. זה יכול להיקבע על ידי בחינת הנתונים בזמנים חשיפה chemiluminescence שונים. התוכנה ניתוח, כנס ל "ערוך – &#62; ניתוח – &#62; תמונות". חשיפות בטווח שבין 5 ל 480 s. ציר ה-y ב- electropherogram דוחות אות/שעה, כך נתוני החשיפה כל אחד צריך מקדם אות/זמן דומה. מקדם זה מקטין עם חשיפות ברצף זמן רב יותר אם הלומינול הופך להיות דלה, כפי שניתן לראות עם הנוגדן דו-1 p53 (איור 2). בגלל המחסור המצע, assay זה יכול להיחשב מדיד עד ריכוז µg/µL 0.2 רק ב 5-30 s החשיפות. לכן, בדוגמה זו, 15 s היה נחוש בדעתו להיות הזמן חשיפה אופטימלית נתונים ניתוח p53.
טיטור lysate - קביעת טווח דינמי ליניארי
חשוב מדידות להילקח בטווח דינמי ליניארי של כל assay, איפה לשינויים האות כפי שנמדד לפי אזור שיא ביחס לשינויים בכמות החלבון במדגם. שימוש בזמן חשיפה אופטימלית נבחר s 15 בסעיף הקודם, וזמינותו ליניאריות הוכח p53 וגם ɑ-טובולין מעל גדול יותר מגוון 15-fold של ריכוז (איור 3). מניסיוננו, ערך2 R של &#62; 0.9 של רגרסיה ליניארית להתאים נחשב מקובל עבור טווח דילול של חלבון מטוהרים של כמות ידוע (אם וזמינותו מדידה כמותית מוחלטת) או לטעום lysate של חלבון המטרה לא ידוע (אם וזמינותו הוא מידה כמותית יחסית).
אופטימיזציה של דילול נוגדן
באמצעות נוגדנים ב קולח ריכוזים מסייעת להבטיח כי כל שינוי האות נמדד רק בשל שינויים בכמות החלבון. בתור הדגמה, שתי שורות תא BEAS-2B, התא כולו תמציות (0.2 µg/µL הכוללת חלבון נטען לתוך וזמינותו) היו שנבדק עם ריכוזים נוגדן ɑ באופן סדרתי מדולל-טובולין הנע בין 1:25 - 1:800 (איור 4). האות chemiluminescent (כאן, נמדד כשטח שיא) הייתה להתוות נגד דילול נוגדן. רוויה נצפתה ליד 1:50 מתחילה העקומה מישור בולט דילול.
משפט ניסיוני - דוקסורוביצין הטיפול בתאים BEAS-2B
שימוש assay מיטבי בתנאים, תרבית תאים BEAS-2B טופלה עם שלושה ריכוזים שונים של דוקסורוביצין (1.2, 1.8 ו 2.4 µg/mL) במשך 4 שעות (איור 5, טבלה 1). הפעלה של p53 דרך שינויים post-translational שמתווכת תגובות הסלולר מספר, כולל מעצר מחזור התא, הזדקנות ביולוגית של אפופטוזיס12. באופן ספציפי, זירחון של סרין 15 יוחסה להפעלה תעתיק של p53, וכתוצאה מכך אפופטוזיס לאחר טיפול דוקסורוביצין13. בהפגנה הזו, ɑ-טובולין מנורמל שיא האזורים מוצגים כמו קיפול של שליטה. מעניין, 3.5 לעלייה p53 זרחון על סרין 4-fold נצפו עליות 15 ו- 2-fold רמת p53 phosphorylated-סרין 20 לאחר 4 שעות חשיפה דוקסורוביצין. תוצאות אלו מצביעות על ההפעלה של p53; עם זאת, אין מנה-תגובה נתפסת עבור הריכוזים שבחרת (לעומת זאת, המנה הנמוכה ביותר נבדק elicited התגובה הגבוהה ביותר). סה כ p53 לא להפגין מענה ברור טיפול במערכת מודל. הבחנו בעבר הפעלה של p53 זירחון בהיעדרו של רמות גבוהות של p53 הכולל תנאים דומים שטופלו אבץ BEAS-2B תאים14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
איור 2 . חשיפה השוואה התמונה כדי לזהות אות שחיקה. ליין צפיות הצג הפחתת ריכוז חלבון עבור BEAS-2B lysates שנבדק עם p53 נוגדנים דו-1 לדילול שבערך. המקדמים של אות chemiluminescence, המדווח פסגת הגולן בתוכנה כלי נגינה, הן נקודות המגע המוצגים. בניגוד הגולן שיא, עוצמות הלהקה ויזואלית אוטומטית שנוצר, על ידי המכשיר כדי לסייע צפייה של להקות, הן לא דומות מהחלונית אחד למשנהו. שימו לב לירידה chemiluminescence אות כמו זמן החשיפה עולה, עם האות תחילתן (פיצול פיק)-שתי החשיפות הארוך, המציינת את המצע דלדול. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
איור 3 . טיטור lysate מציג תצוגות ליין. טיטור lysate מציג את ליין צפיות (א) BEAS-2B lysate כאשר נחקר עם שבערך p53 דו-1 או 1:50 ɑ-טובולין. שלא כמו ערכי אזור הפסגה, עוצמות הלהקה חזותי באופן אוטומטי שנוצר, על ידי המכשיר כדי לסייע צפייה של להקות, הן לא דומות מהחלונית אחד למשנהו. ניתוח של רגרסיה ליניארית (B) מאשרת שמבחני הם לינארית מעל הטווח כולו נבדק, מ 0.01 µg 0.20/µL, µg 0.025 כדי 0.40/µL, עם ערכי R2 0.999 ו- 0.985, בהתאמה. ריכוז החלבון הכולל באמצע הטווח. ליניארית נבחרו כדי להכיל פוטנציאל וריאציה חלבון המטרה בשני הכיוונים (לדוגמה, µg/µL 0.2 עבור α-טובולין). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
איור 4 . Α-טובולין נוגדן דילול ' עקומות ' עבור שתי נפרד BEAS-2B חלבון lysates עם או בלי בסיס נורמליזציה. Depar מובהקמכשור מ ליניאריות נתפסת 1:50 (0.02) דילול, המציינת את הרוויה. 1:50 ולכן נבחר דילול אופטימלית עבור זה הנוגדן. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
איור 5. השפעת הטיפול דוקסורוביצין (DXN) 4 שעות על סך של סרין phosphorylated ביטוי חלבון p53 של תאים BEAS-2B. שיא אזורים מנורמל ל α-טובולין, התווה קיפול של שליטה (CTL). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
טבלה 1. השפעת הטיפול דוקסורוביצין (DXN) 4 שעות על סך של סרין phosphorylated ביטוי חלבון p53 של תאים BEAS-2B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

ראגנטים מבוסס-נים באמצעות פלטפורמה מסחרית כדי למדוד את היעד חלבונים מן ההכנות חלבון הכולל הוא הפגין. בנוסף, הפרמטרים וזמינותו של זמן החשיפה, לריכוז החלבון נוגדן דילול הממוטבות מערכת מודל של התרבות תאים.

הליך ואסטרטגיות אופטימיזציה מפתח שיטה אוטומטית נימי מתכלה מבוסס על Electrophoretic

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

procedure-key-optimization-strategies-for-an-automated-capillary

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  U.S. Environmental Protection Agency. ראגנטים מבוסס-נים באמצעות פלטפורמה מסחרית כדי למדוד את היעד חלבונים מן ההכנות חלבון הכולל הוא הפגין. בנוסף, הפרמטרים וזמינותו של זמן החשיפה, לריכוז החלבון נוגדן דילול הממוטבות מערכת מודל של התרבות תאים.

Video: Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

אופטימיזציה של התגובה אוגי באמצעות סינתזה במקביל וטיפול נוזלי אוטומטי

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of microbiology was transformed with the advent of Anton van Leeuwenhoek&#39;s microscope, which allowed scientists to visualize prokaryotes for the first time. The development of the polymerase chain reaction (PCR) is one of those innovations that changed the course of molecular science with its impact spanning countless subdisciplines in biology. The theoretical process was outlined by Keppe and coworkers in 1971; however, it was another 14 years until the complete PCR procedure was described and experimentally applied by Kary Mullis while at Cetus Corporation in 1985. Automation and refinement of this technique progressed with the introduction of a thermal stable DNA polymerase from the bacterium Thermus aquaticus, consequently the name Taq DNA polymerase.
PCR is a powerful amplification technique that can generate an ample supply of a specific segment of DNA (i.e., an amplicon) from only a small amount of starting material (i.e., DNA template or target sequence). While straightforward and generally trouble-free, there are pitfalls that complicate the reaction producing spurious results. When PCR fails it can lead to many non-specific DNA products of varying sizes that appear as a ladder or smear of bands on agarose gels. Sometimes no products form at all. Another potential problem occurs when mutations are unintentionally introduced in the amplicons, resulting in a heterogeneous population of PCR products. PCR failures can become frustrating unless patience and careful troubleshooting are employed to sort out and solve the problem(s). This protocol outlines the basic principles of PCR, provides a methodology that will result in amplification of most target sequences, and presents strategies for optimizing a reaction. By following this PCR guide, students should be able to: 
 
&#9679; Set up reactions and thermal cycling conditions for a conventional PCR experiment 
&#9679; Understand the function of various reaction components and their overall effect on a PCR experiment 
&#9679; Design and optimize a PCR experiment for any DNA template 
&#9679; Troubleshoot failed PCR experiments

PCR has emerged as a common technique in many molecular biology laboratories. Provided here is a quick guide to several conventional PCR protocols. Because each reaction is a unique experiment, optimal conditions required to generate a product vary. Understanding the variables in a reaction will greatly enhance troubleshooting efficiency, thereby increasing the chance to obtain the desired result.

תגובת שרשרת פולימרז: פרוטוקול בסיסי פלוס אסטרטגיות לפתרון בעיות ואופטימיזציה

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Spatial Multiobjective Optimization of Agricultural Conservation Practices using a SWAT Model and an Evolutionary Algorithm

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals across the landscape is of primary importance in watershed management. Traditional economics methods of finding the lowest-cost solution in the watershed context (e.g.,5,12,20) assume that off-site impacts can be accurately described as a proportion of on-site pollution generated. Such approaches are unlikely to be representative of the actual pollution process in a watershed, where the impacts of polluting sources are often determined by complex biophysical processes. The use of modern physically-based, spatially distributed hydrologic simulation models allows for a greater degree of realism in terms of process representation but requires a development of a simulation-optimization framework where the model becomes an integral part of optimization.
Evolutionary algorithms appear to be a particularly useful optimization tool, able to deal with the combinatorial nature of a watershed simulation-optimization problem and allowing the use of the full water quality model. Evolutionary algorithms treat a particular spatial allocation of conservation practices in a watershed as a candidate solution and utilize sets (populations) of candidate solutions iteratively applying stochastic operators of selection, recombination, and mutation to find improvements with respect to the optimization objectives. The optimization objectives in this case are to minimize nonpoint-source pollution in the watershed, simultaneously minimizing the cost of conservation practices. A recent and expanding set of research is attempting to use similar methods and integrates water quality models with broadly defined evolutionary optimization methods3,4,9,10,13-15,17-19,22,23,25. In this application, we demonstrate a program which follows Rabotyagov et al.'s approach and integrates a modern and commonly used SWAT water quality model7 with a multiobjective evolutionary algorithm SPEA226, and user-specified set of conservation practices and their costs to search for the complete tradeoff frontiers between costs of conservation practices and user-specified water quality objectives. The frontiers quantify the tradeoffs faced by the watershed managers by presenting the full range of costs associated with various water quality improvement goals. The program allows for a selection of watershed configurations achieving specified water quality improvement goals and a production of maps of optimized placement of conservation practices.

This work demonstrates an integration of a water quality model with an optimization component utilizing evolutionary algorithms to solve for optimal (lowest-cost) placement of agricultural conservation practices for a specified set of water quality improvement objectives. The solutions are generated using a multi-objective approach, allowing for explicit quantification of tradeoffs.

אופטימיזציה למרחבי Multiobjective של שיטות שימור חקלאיות באמצעות מודל SWAT ואלגוריתם אבולוציונית

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: תוסף ImageJ למדידת צורת עלה חצי אוטומטית

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

זיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי בתגובה חיסונית באורז עם בדיקת כימילומינסנציה

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

איסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus transmission. Hemolymph collection is the basic technology for studying virus-vector interactions. Here, we describe a novel and simple method for the quantitative collection of hemolymph from small arthropods using Laodelphax striatellus (the small brown planthopper, SBPH) as a research model, as this arthropod is the main vector of rice stripe virus (RSV). In this protocol, the process begins by gently pinching off one leg of the frozen arthropod with fine-tipped tweezers and pressing the hemolymph out of the wound. Then, a simple micropipette consisting of a capillary and a pipette bulb is used to collect the transudative hemolymph from the wound according to the principle of capillary forces. Finally, the collected hemolymph can be dissolved into a specific buffer for further study. This new method for collecting hemolymph from small arthropods is a useful and efficient tool for further research on arboviruses and vector-virus interactions.

מחבר זרקור: שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים  

We describe a method to collect quantifiable hemolymph efficiently from small arthropods for subsequent analysis.