Gli autori vorrei ringraziare Keith Tarpley di l'US EPA Office del team ricerca e sviluppo-Research Triangle Park (RTP-ORD) grafica e Media per lo sviluppo, taping e di editing del video didattico. Vorremmo anche ringraziare Deborah Pritchett da ProteinSimple per le conversazioni utili per quanto riguarda l'ottimizzazione dei nostri dati. JM Guynn è stata sostenuta dall'Istituto Oak Ridge per scienza e formazione ricerca/Participation Program presso la US Environmental Protection Agency.

Nota: accertarsi che tutti i reagenti ed i campioni sono preparati secondo il produttore &#39; protocollo s, descritta di seguito. Si prega di indossare dispositivi di protezione individuale adeguata durante questa procedura, che include guanti in nitrile, camice, scarpe a punta chiusa e occhiali di sicurezza. Una tabella di materiali specifici, reagenti e attrezzatura necessaria è fornita separatamente. Proteina totale concentrazione dei campioni deve essere determinata in anticipo utilizzando metodologie consolidate che sono compatibili con il lisato buffer utilizzato, come analisi di Bradford 11.
 1. preparazione dei campioni e reagenti del pacchetto standard come fornito dal produttore di <ol><li>per preparare la soluzione di lavoro di 400 mM di ditiotreitolo (DTT), aggiungere 40 µ l deionizzata acqua al tubo trasparente contenente il stock fornito dal produttore. È importante evitare di introdurre bolle alla soluzione mescolando la soluzione con lenta e delicata pipettaggio.</li>
	Tampone del campione <li>aggiungere 20 µ l 10 X e 20 µ l della soluzione preparata 400 mM DTT nella rosa provetta contenente 5 fluorescente X master mix (Vedi la Tabella materiali). 
	Nota: Il Master Mix (MM) è sigillato dal costruttore con una pellicola di copertura e deve essere trafitto da un puntale. Mix dolcemente pipettando lento per evitare spruzzi DTT in pipetta.</li>
	<li>Successivamente, aggiungere 16 µ l deionizzata acqua, 2 µ l di fornito 10X tampone del campione e 2 µ l della soluzione preparata 400 mM DTT al bianco biotinilati scaletta tubo fornito dal produttore. Mescolare delicatamente e trasferire in una provetta di 0,6 mL di denaturazione.</li>
	<li>Preparare 0,1 x tampone diluendo la dotazione 10 X soluzione 1: 100 con acqua. Preparare abbastanza 0,1 x tampone per diluire i campioni tutti.</li>
	<li>Calcolare la quantità di 0,1 x sample buffer che viene aggiunto a un campione, che dipenderà la concentrazione finale desiderata delle proteine totali. Mescolare 1 parte 5 x fluorescente MM con 4 parti campione per ottenere la concentrazione finale desiderata di proteine diluito.
	Volumi <ol><li>calcola come segue: (i) Volume 5 x fluorescente MM = (concentrazione nella proteina finale desiderata) / 5; (ii) volume di stock di proteine = (concentrazione di proteina finale desiderata x volume totale richiesto) / proteina stock concentrazione; (iii) volume di 0,1 x tampone del campione = volume totale - 5 x MM volume - proteina stock volume.</li>
	</ol></li></ol> 2. Denaturazione di campioni e scaletta <ol><li>luogo preparato campioni e biotinilati scaletta in un blocco di calore di 95 ° C per 5 min. tubi di vortice immediatamente dopo l'incubazione, eseguire uno spin per ~ 5 s in una centrifuga da tavolo e posto su Ice. 
	Nota: Alcune proteine possono richiedere condizioni denaturanti più delicate (ad es., 70 o C per 10 min) per impedire l'aggregazione proteica e migliorare la migrazione nella matrice capillare. Considerate questa opzione se c'è pesante sbavature presso i più alti pesi molecolari (Vedi ad esempio video).</li>
</ol> 3. Preparazione di anticorpi <ol><li>come determinato da ottimizzazione (Vedi Rappresentante risultati e video), l'anticorpo fornito da soli il desiderato diluizioni di anticorpo primario (ad esempio, 01:50, 1: 100) Diluente 2. 
	Nota: Gli anticorpi sono generalmente utilizzati a concentrazioni più elevate per immunodosaggio basato su capillare rispetto per macchiarsi occidentale tradizionale. L'anticorpo secondario fornito è pronto all'uso senza diluizione.</li>
</ol> 4. Preparazione di perossido e Luminol-S <ol><li>preparare una miscela 1:1 di perossido e luminol-S.</li>
	<li>Vortex per mescolare e conservare il ghiaccio 
	Nota: È importante che questa miscela è preparata fresco per ogni dosaggio sperimentale. 250ul mix totale è necessario per eseguire un piatto completo.</li>
</ol> 5. Preparazione del piatto dosaggio <ol><li>come illustrato nella Figura 1, caricare i campioni e reagenti preparati sopra nella piastra del dosaggio. Consulta le istruzioni dettagliate qui di seguito per ogni riga. Per minimizzare evaporazione dai pozzi, assicurarsi che il coperchio della piastra viene sostituito tra aggiunte di reagente.</li>
	<li>Nella riga A, pipettare 5 µ l di Biotinylated Ladder in pozzetto A1. Per l'altra fila, dispensare preparati campioni (5 µ l) nei pozzetti A2-A25. 
	Nota: È fondamentale che la A1 contiene bene sempre scaletta, come il primo capillare nella cartuccia è ottimizzato per l'esecuzione di questo standard.</li>
	<li>In fila B, dispensare 10 µ l di diluente 2 anticorpo in ogni pozzetto (B1-B25).</li>
	<li>Nella riga C, dispensare 10 µ l di diluente 2 anticorpo in C1 bene. Nella riga resto pozzetti C, dispensare 10 µ l di anticorpo primario (pozzetti C2-C25).</li>
	<li>In fila D, dispensare 10 µ l di streptavidina-HRP in ben D1. Nella riga resto pozzetti D, dispensare 10 µ l di anticorpo secondario (pozzi D2-D25).</li>
	<li>In fila E, dispensare 10 µ l della miscela preparata luminol-perossido in ogni pozzetto (E1-E25).</li>
	<li>Infine, aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio per vano a ciascuno le prime 3 righe di pozzi buffer. 
	Nota: È importante ridurre al minimo la formazione di bolle di pipettaggio delicatamente e non espellere il volume finale dalla punta come bolle possono interferire con il capillare di carico ed eseguire.</li>
	<li>Una volta caricati tutti i pozzetti, centrifugare la piastra a ~ 1000 x g per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere le bolle e assicurarsi che il liquido sia il fondo dei pozzetti. Pop tutte le bolle visibili con un puntale piccolo o un ago pulito (ad es., calibro 25 sterile &#34; alto rappresentante &#34; needle).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> Figura 1 . Modello di pipettaggio per piastra test. Codifica a colori rappresenta corretta reagenti e campioni (fino a 24 in totale) sulla piastra di dosaggio. Aggiungere biotinilati scaletta al pozzetto A1 (arancione), preparati campioni da pozzetti A2 fino A25 (blu chiaro), anticorpo 2 diluente nei pozzetti B1-B25 e C1 (verde chiaro), anticorpo primario per pozzetti C2 fino a C25 (blu), streptavidina-HRP ben D1 (rosa scuro), anticorpo secondario per pozzi D2 fino a D25 (verde scuro) e il mix di luminol-perossido nei pozzetti E1 fino a E25 (viola). Tampone di lavaggio viene aggiunto per le prime tre righe della piastra metà più grande pozzi (blu scuro). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
 6. a partire lo strumento capillare immunoassay <ol><li>assicurarsi che lo strumento e il computer di accompagnamento siano accesi. Nessun tempo di preriscaldamento è necessario.</li>
	<li>Aprire il software di strumentazione sul computer. In primo luogo, selezionare il &#34; test &#34; scheda sulla destra della finestra e &#34; nuovo dosaggio &#34; sotto il &#34; Menu File &#34; sulla sinistra. Selezionare il formato, la gamma di dimensioni (ad es., 12-230 kDa) e la cartuccia tipo (ad esempio, 25 capillare) che è stato utilizzato per il dosaggio particolare. 
	Nota: Un maggio anche input analisi parametri, incluso la concentrazione nella proteina, tipo di anticorpo e diluizione, se lo si desidera, ma questi non sono necessari per avviare il test.</li>
	<li>Aprire la porta sullo strumento premendo il pulsante sulla parte superiore del pannello arancio.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente la cartuccia capillare dalla confezione. Senza toccare i capillari di vetro se stessi, è necessario inserire la cartuccia nell'apposito supporto. Verificare i posti a sedere cartuccia osservando la luce interiore cambia da arancione a blu.</li>
	<li>Tenere saldamente la piastra sul banco e rimuovere con cautela il sigillo di evaporazione dalla parte inferiore della piastra. Pop tutte le bolle vista in questi pozzi di matrice di separazione con un smtutti puntale o aghi puliti (ad esempio, calibro 25 sterile &#34; alto rappresentante &#34; needle).</li>
	<li>Posizionare la piastra di saggio sul porta targa, assicurando che sia completamente inserita e chiudere la porta strumenti.</li>
	<li>Clic la &#34; Start &#34; pulsante nel software. 
	Nota: Se viene visualizzata la finestra di nessun pulsante di avvio, il collegamento con lo strumento è stato perso. Scegliere strumenti dal menu in alto a sinistro, quindi collegare. Un pop-up dovrebbe essere visualizzato con il numero di matricola; Selezionare questa opzione, quindi fare clic su Connetti. Pulsante Start dovrebbe ora apparire.</li>
	<li>Quando viene completata, l'esecuzione scartare la piastra. Rimuovere la cartuccia e posto in un apposito contenitore per lo smaltimento, insieme a qualsiasi aghi che potrebbe essere stato utilizzato per bolle scoppiano. Lasciare acceso per evitare problemi di connessione se lo strumento viene utilizzato regolarmente (ad es., almeno settimanalmente).</li>
</ol> 7. Esperimento di analisi <ol><li>prima dell'analisi, garantire vengono eseguiti i seguenti controlli di qualità.
	<ol><li>Verifica fluorescente standard selezionando la &#34; standard Visualizza &#34; icona. Verificare che gli standard sono identificati correttamente nella &#34; visualizzazione grafico &#34; scheda. Se non sono corretti, andare alla &#34; singola visualizzazione &#34; icona, fare clic con il pulsante destro sul picco di corretto e selezionare &#34; forza Standard &#34;, o fare clic con il pulsante destro sul picco errato e selezionare &#34; non Standard &#34;. Eseguire questo controllo per ogni nuovo capillare.</li>
		<li>Verifica biotinilati scaletta cliccando sul &#34; campioni &#34; e &#34; singola visualizzazione &#34; icone. Selezionare la scala nella scheda esperimento. Se un picco è identificato in modo non corretto, fare clic destro su di esso in &#34; visualizzazione grafico &#34; e selezionare &#34; Rimuovi Peak &#34;. 
		Nota: ad esempio, la scala di biotinylated utilizzata per il 12-230 kDa kit dovrebbe mostrare 12, 40, 66, 116, 180 e 230 kDa picchi di ridimensionamento. Se questo passaggio non viene eseguito, il dimensionamento dei picchi del campione sarà calcolato in modo errato, producendo risultati spuri.</li>
		<li>Vista e analizzare i picchi del campione. Derivano i dati dalla tabella di vette, tra cui peso molecolare, area di picco, picco alto e segnale-rumore (S/N), come necessario per calcoli sperimentali.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hematopoietic stem cell protocols. 1185, (2014).</li><li>Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+(hiPSC-CMs)+to+Monitor+Compound+Effects+on+Cardiac+Myocyte+Signaling+Pathways.">Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways.</a> Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).</li><li>Chen, J. 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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari. Questo manoscritto è stato recensito dal National Health and Environmental Effects Research Laboratory e approvato per la pubblicazione. Il contenuto non riflette necessariamente le opinioni di EPA né menzione di marchi o prodotti commerciali costituisce approvazione o raccomandazione per l'uso.

Per decenni, c'è stato interesse costante nello sviluppo di metodi di immunoassay basati su elettroforetico capillare a causa basso dispendio campioni e reagenti, è diminuito di elaborazione tempo rispetto ai metodi tradizionali e ad alta compatibilità per automatizzare la procedura4,15. Ci sono un certo numero di diversi protocolli per la separazione delle proteine che hanno utilizzato i capillari, tra cui polimero elettroforetico, elettrocinetico, setacciatura e metodi isoelettrici, che isolare proteine dalle proprietà differenti (rispettivamente, carica elettrostatica, equilibrio di partizione, setacciatura proprietà della matrice separazione e pH)16. Qui, descriviamo un anticorpo-basato (o immunologico) metodo di elettroforesi capillare, utilizzando un polimero vagliatura separazione, che è stato automatizzato e commercialmente adottati3. Vantaggi di questo sistema sono la facilità di utilizzo e funzionamento, standardizzati e commercialmente disponibili reagenti e misurazioni affidabili, sensibili che richiedono meno reagenti e campioni rispetto all'analisi tradizionale proteina come macchia occidentale, immunoassay enzima-collegato e altri formati3,4,5. È stato osservato nelle precedenti valutazioni di questa tecnologia che l'intervallo di grandezza di proteina che può essere valutata è stato limitato dalla separazione disponibili matrice4, tuttavia recenti offerte hanno ampliato la gamma misurabile da 2 a 440 kDa17 . Inoltre, alcuni buffer di lisato sono noti per essere incompatibile con il saggio18, quindi selezione dei reagenti sperimentali utilizzato deve essere considerata in anticipo.
Un vantaggio principale di una procedura automatizzata con componenti disponibili in commercio è la coerenza dei risultati attraverso metodi standardizzati e reagenti. Questo riduce al minimo le probabilità di errore di dosaggio automatizzando i passaggi critici all'interno della routine. Tuttavia, è importante notare che certe pratiche devono essere rispettati durante il protocollo per ridurre al minimo i problemi con l'immunodosaggio basato su elettroforetica capillare. In primo luogo, è fondamentale che la miscela di luminol-S/perossido è preparata fresco e immediatamente prima di carico su piastra. Temporizzazione coerente si tradurrà in luminescenza coerenza dopo aver aggiunto l'agente ossidante, che si tradurrà in misure coerenti per un dosaggio anticorpo particolare termine dosaggio. Inoltre, è importante che vengano utilizzati i reagenti non scaduto, che colpisce principalmente la potenza dell'agente ossidante. Inoltre, è importante che l'ordine di caricamento dei campioni, anticorpi e altri reagenti essere rigorosamente rispettata (Vedi Figura 1). Qualsiasi reagente pipettato fuori luogo si tradurrà in errore di dosaggio e una corsa sprecata.
Oltre a questi passaggi critici, principali problemi sperimentati con la tecnica generalmente possono essere superati attraverso l'ottimizzazione. Infatti, queste condizioni sono specifiche per ogni combinazione di sistema/anticorpo modello e pertanto dovrebbero essere determinate empiricamente per ogni nuovo dosaggio. In questo articolo, ci concentriamo su tre comuni procedure di ottimizzazione: tempo di esposizione, la titolazione lisato e la diluizione di anticorpo primario. La capacità di generare risultati misurabili dipende dalle analisi di un tempo di esposizione quando il substrato di luminol non è stanno rapidamente esaurendo, come risultati di svuotamento di substrato in perdita di segnale. Lisato titolazione determina l'intervallo dinamico lineare di ogni dosaggio, che può differire da con sistemi di modello diverso, così come gli anticorpi differenti, anche per lo stessa proteina bersaglio. Diluizioni di anticorpo scelti a o vicino a saturare le concentrazioni garantiscono cambiamenti nel segnale non ne risentiranno di una carenza di anticorpi liberi, ma solo da diverse quantità di proteina disponibile destinazione epitopo. Altre considerazioni durante il processo di ottimizzazione possono includere il tempo di incubazione dell'anticorpo e accatastamento/campione tempo di caricamento. Nella maggior parte dei casi le impostazioni predefinite per lo strumento offrono il miglior equilibrio tra risoluzione e sensibilità. Tuttavia, in alcuni casi, scarsa risoluzione o sensibilità può essere migliorata mediante la regolazione di questi parametri.
Metodi di immunoassay basati su elettroforetico capillare forniscono misurazioni proteina veloce, efficace e riproducibile. Mentre questi metodi sono stati utilizzati principalmente nelle impostazioni di ricerca e sviluppo, la coerenza di queste tecnologie ha potenziale utilità nelle applicazioni cliniche e regolamentazione. Ad esempio, l'identificazione di sottopopolazioni suscettibili di tossici ambientali o pazienti con progressione della malattia può essere basato su proteine biomarcatori misurati in matrici accessibile come sangue, urine e saliva. Come reagente e goccia di costi di operazione e il numero di campioni e gli obiettivi che possono essere valutati contemporaneamente aumenta, probabilmente vedremo metodi di immunoassay di basati su elettroforetico capillare utilizzati per questi tipi di applicazioni.

Test immunologici mediante elettroforesi capillari misurano l'espressione della proteina in lisati cellulari utilizzando sistemi di separazione di dimensione o carica e offrono numerosi vantaggi rispetto i tradizionali test immunologici. Ad esempio, rispetto alla macchia occidentale, la procedura automatizzata basata su capillare elimina la necessità di gel, dispositivi di trasferimento, e manuale di lava. Inoltre, la quantità assoluta di proteine necessaria è circa 10 volte meno, rendendo i sistemi basati su capillare ideale per l'utilizzo con i tipi di cellule rare o campione limitato1,2. Risultati sono ottenuti in meno di 3 h utilizzando sistemi automatizzati e precedentemente sono stati dimostrati più quantitativa e riproducibile di convenzionale western blot procedure3,4,5. Il processo per saggi basati su dimensioni consiste di caricamento campioni contenenti sodio dodecil solfato (SDS), ditiotreitolo (DTT) e fluorescente etichettati marcatori di peso molecolare in colonne capillari contenenti matrici di accatastamento e separazione. Tensione applicata ai capillari separa le proteine in campioni in base alla dimensione, e luce UV immobilizza le proteine separate per la parete capillare. Il capillare è quindi immuno-sondato con specifica della destinazione primario dell'anticorpo e rafano perossidasi (HRP)-anticorpo secondario coniugato. Luminol e perossido di catalizzare chemiluminescente generazione di luce che è misurata da una telecamera di charge coupled device (CCD) ed analizzati per quantificare le proteine.
Nonostante la relativa facilità e la velocità di una piattaforma di dosagggio immunologico automatizzato basato su capillare elettroforetica, ottimizzazione di metodiche quali concentrazione proteica, diluizione dell'anticorpo e tempo di esposizione è importante per ottenere accurate, riproducibili risultati. In generale, è necessario eseguire le procedure seguenti per ottimizzare un dosaggio per questi sistemi:
1) uno schermo deve essere eseguito per valutare e scegliere gli anticorpi per segnale e specificità per il proteina bersaglio. Se disponibile, la proteina purificata o epitopo target può essere utilizzato per valutare la specificità; Tuttavia, è ancora importante valutare potenziali segnale aspecifico in proteine totali proveniente dal sistema di modello.
2) successivamente, la gamma dinamica del dosaggio deve essere determinato. In una situazione ideale, segnale raddoppio (misurato utilizzando area di picco) è osservato come la concentrazione del campione è raddoppiata; Tuttavia, in pratica, un cambiamento proporzionale a segnale di input in modo prevedibile (ad es., lineare adatta) è sufficiente per la quantificazione della proteina. Inoltre, questa ottimizzazione definirà la concentrazione di proteine con segnale alto ma ancora all'interno della gamma lineare per il modello sperimentale.
3) determinare la concentrazione di anticorpi ottimale utilizzando la concentrazione nella proteina fisso selezionata in fase di ottimizzazione 2. Come la concentrazione di anticorpi, il segnale aumenta fino a quando esso altipiani a saturazione. Una concentrazione di anticorpi vicino a questo livello di saturazione è necessaria per la misura accurata di concentrazione nella proteina.
Il processo utilizzato per ottimizzare le concentrazioni della proteina, diluizioni di anticorpo e tempi di esposizione per un di dosaggio automatizzato basato su capillare dimensione6 è dimostrato usando gli estratti di cellule intere isolati da BEAS-2B, un essere umano SV-40 trasformato bronchiale linea cellulare epiteliale. Isolamento della proteina dagli estratti delle cellule o del tessuto può essere eseguita utilizzando un numero di protocolli pubblicati7,8,9 e non sarà coperti qui. Risultati di un esperimento di prova utilizzando le condizioni ottimizzate sono inoltre segnalati per totale e fosforilate (serina 15, Serina 20) p53 nelle culture esposte a doxorubicina (un agente chemioterapeutico comune che induce l'apoptosi di cellule10) a 1.2, 1.8, e 2,4 media µ g/mL per 4 h prima del raccolto. Le aree di picco di p53 sono normalizzate a ɑ-tubulina, che è usato come un controllo di carico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wes instrument</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td>004-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P53 DO-1 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-tubulin primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873</td>
			<td>used as a loading control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass Software</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td></td>
			<td>provided with the Wes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-230 kDa Master kit</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&#160;</td>
			<td>PS MK02 (since replaced by a new kit #)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td>
			<td>INCLUDES PART NO: 
			Wash Buffer (60 mL) 042-202 
			10X Sample Buffer (440 &#956;L) 042-195 
			Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 
			Capillary Cartridges (8) PS-CC01 
			Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 
			Luminol-S (1.5 mL) 042-233 
			Peroxide (1.5 mL) 042-234 
			Streptavidin-HRP (132 &#956;L) 042-414 
			Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 
			Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 
			or 
			Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte growth medium, KGM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192152</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte basal medium, KBM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192151</td>
			<td>serum free medium for chemical dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue Bradford Assays</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>23200</td>
			<td>for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Extract kit</td>
			<td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D1515</td>
			<td>used to prepare whole cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INCLUDES:</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer AM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M dithiothreitol (DTT)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X PBS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method

Nuove tecnologie che utilizzano test immunologici basati su capillare promettono valutazione più veloce e più quantitativa della proteina rispetto ai tradizionali test immunologici. Tuttavia, simile ad altri dosaggi di proteina anticorpo-basato, ottimizzazione dei parametri di base capillare immunoassay, quali concentrazione proteica, diluizione dell'anticorpo e tempo di esposizione è un presupposto importante per la generazione di significativo e affidabile dati. Misure devono rientrare all'interno della gamma lineare del dosaggio dove sono direttamente proporzionali ai cambiamenti nella concentrazione di lisato cambiamenti nel segnale. Il processo di scelta di concentrazioni adeguate di lisato, diluizioni di anticorpo e tempi di esposizione in linea di cellule epiteliali bronchiali umane, BEAS-2B, è dimostrato qui. Linearità di dosaggio è indicato sopra una gamma di concentrazioni di proteina intera cellula Estratto con gli anticorpi p53 e α-tubulina. Un esempio del burnout segnale è visibile alle più alte concentrazioni con tempi di esposizione lunghi, e una curva di diluizione dell'anticorpo di α-tubulina è mostrata dimostrando la saturazione. Inoltre, risultati sperimentali di esempio sono riportati per cellule trattate con doxorubicina utilizzando parametri ottimizzati.

Tempo di esposizione - Burnout di segnale di determinazione
Burnout di segnale può verificarsi quando il substrato di luminol e perossido si esaurisce troppo rapidamente. Questo può essere determinato esaminando i dati in tempi di esposizione differenti chemiluminescenza. Nel software di analisi, vai a "Modifica – &#62; analisi – &#62; immagini". Le esposizioni vanno da 5 a 480 s. L'asse y in un elettroferogramma rapporti segnale/tempo, quindi i dati da ogni esposizione dovrebbero avere un simile coefficiente di segnale/tempo. Questo coefficiente diminuisce con esposizioni in sequenza più lunghe se luminol si esaurisce, come si è visto con l'anticorpo di DO-1 di p53 (Figura 2). A causa di svuotamento del substrato, questo test può essere considerato misurabile fino alla concentrazione di 0,2 µ g / µ l solo presso le esposizioni di s di 5-30. Pertanto, in questo esempio, 15 s è stato determinato per essere il tempo di esposizione ottimale dei dati analisi per p53.
Titolazione lysate - Determinazione del range dinamico lineare
È importante che misure all'interno della gamma dinamica lineare di ogni dosaggio, dove cambiamenti nel segnale come misurato dall'area del picco sono proporzionali ai cambiamenti nella quantità di proteine nel campione. Utilizzando il tempo di esposizione ottimale di 15 scelti di s nella sezione precedente, dosaggio linearità è dimostrata per p53 sia ɑ-tubulina sopra maggiore di un intervallo di 15 volte della concentrazione (Figura 3). Nella nostra esperienza, un valore di2 R di &#62; 0,9 di una regressione lineare adatta è considerato accettabile per un intervallo di diluizione della proteina purificata di quantità nota (se il test è una misura quantitativa assoluta) o campione lisato di proteina bersaglio sconosciuto (se dosaggio è una misura quantitativa relativa).
Ottimizzazione della diluizione di anticorpo
Usando gli anticorpi a saturare le concentrazioni aiuta a garantire che eventuali cambiamenti del segnale misurati sono dovuti solo a cambiamenti nella quantità di proteine. Come dimostrazione, due varietà di cellula BEAS-2B intera cellula estrae (0,2 µ g / µ l proteine totali caricati nel dosaggio) erano sondato con concentrazioni di anticorpo diluito serialmente ɑ-tubulina che vanno da 01:25 - 1: 800 (Figura 4). Segnale a chemiluminescenza (qui, misurata come area di picco) è stata tracciata contro la diluizione dell'anticorpo. Saturazione è stata osservata vicino il 01:50 diluizione dove la curva inizia un altopiano evidente.
Prova sperimentale - trattamento di doxorubicina in cellule BEAS-2B
Utilizzando condizioni di dosaggio ottimizzato, coltura cellulare BEAS-2B è stato trattato con tre differenti concentrazioni di doxorubicina (1.2, 1,8 e 2,4 µ g/mL) per 4 h (Figura 5, tabella 1). Attivazione di p53 attraverso modifiche post-traduzionali media diverse risposte cellulari, tra cui l'arresto del ciclo cellulare, senescenza e apoptosi12. In particolare, la fosforilazione della serina 15 è stata attribuita all'attivazione trascrizionale di p53, con conseguente apoptosi dopo doxorubicina trattamento13. In questa dimostrazione, ɑ-tubulina normalizzati picco aree vengono presentati come piega del controllo. È interessante notare che, 3.5 a 4 falde aumenti in p53 fosforilazione in serina sono stati osservati aumenti 15 e 2 volte nel livello di p53 fosforilata in serina 20 dopo l'esposizione di 4 h a doxorubicina. Questi risultati indicano l'attivazione di p53; Tuttavia, nessuna dose-risposta è visto per le concentrazioni scelte (al contrario, la dose più bassa testata ha suscitato la risposta più alta). Totale p53 non hanno dimostrato una risposta al trattamento chiaro in questo modello. In precedenza abbiamo osservato l'attivazione di p53 fosforilazione in assenza di aumento dei livelli di p53 totale in condizioni simili in zinco-trattati BEAS-2B cellule14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Figura 2 . Confronto di immagini di esposizione per rilevare segnale burnout. Lane viste Visualizza diminuire le concentrazioni di proteina per BEAS-2B lisati sondato con p53 DO-1 anticorpo ad una diluizione di 1: 500. Coefficienti di segnale di chemiluminescenza, segnalati come altezze dei picchi nel software dello strumento, si sovrappongono. A differenza delle altezze dei picchi, le intensità di visual band sono generate automaticamente e regolate dallo strumento per facilitare la visualizzazione delle bande e sono quindi non confrontabili da un pannello a altro. Nota: la diminuzione del segnale di chemiluminescenza come aumento del tempo di esposizione, con il segnale di inizio a scomparire (picco di Spalato) presso le due esposizioni più lunghe, che indica lo svuotamento del substrato. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Figura 3 . Titolazione lysate Mostra le visualizzazioni di corsia. Lisato titolazione mostrando la corsia viste (A) di BEAS-2B lisato quando sondato con 1: 500 p53 DO-1 o 01:50 ɑ-tubulina. A differenza di valori di zona di picco, le intensità di visual band sono generate automaticamente e regolate dallo strumento per facilitare la visualizzazione delle bande e sono quindi non confrontabili da un pannello a altro. Analisi di regressione lineare (B) conferma che i dosaggi sono lineari su tutta la gamma testata, da 0,01 a 0,20 µ g / µ l e 0.025 a 0,40 µ g / µ l, con valori di R2 di 0,999 e 0.985, rispettivamente. Le concentrazioni di proteine totali nel mezzo della gamma lineare sono stati scelti per ospitare la potenziale variazione di proteina bersaglio in entrambe le direzioni (per esempio, 0,2 µ g / µ l per α-tubulina). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Figura 4 . Diluizione di anticorpo α-tubulina curve per due lysates di proteina BEAS-2B separato con e senza normalizzazione della linea di base. Una partenza definitivature da linearità è visto presso il 01:50 (0,02) diluizione, che indica la saturazione. 01:50 quindi è stato scelto come la diluizione ottima per questo anticorpo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Nella figura 5. Effetto del trattamento di doxorubicina (DXN) 4 h su totale e serina fosforilata espressione della proteina p53 delle cellule BEAS-2B. Le aree dei picchi sono normalizzate a α-tubulina e tracciate come piega del controllo (CTL). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tabella 1. Effetto del trattamento di doxorubicina (DXN) 4 h su totale e serina fosforilata espressione della proteina p53 delle cellule BEAS-2B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.</a>

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Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

È dimostrato un immunodosaggio basato su capillare utilizzando una piattaforma commerciale per misurare proteine bersaglio dalle preparazioni di proteine totali. Inoltre, i parametri di analisi del tempo di esposizione, concentrazione nella proteina e diluizione dell'anticorpo sono ottimizzati per un sistema di modello di coltura cellulare.

Procedure e strategie di ottimizzazione chiave per un metodo automatizzato Immunoassay basati su elettroforetica capillare

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  U.S. Environmental Protection Agency. È dimostrato un immunodosaggio basato su capillare utilizzando una piattaforma commerciale per misurare proteine bersaglio dalle preparazioni di proteine totali. Inoltre, i parametri di analisi del tempo di esposizione, concentrazione nella proteina e diluizione dell'anticorpo sono ottimizzati per un sistema di modello di coltura cellulare.

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Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Ottimizzazione della reazione Ugi Con Sintesi parallela e automatica Gestione liquidi

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Ricerca

Biologia

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of microbiology was transformed with the advent of Anton van Leeuwenhoek&#39;s microscope, which allowed scientists to visualize prokaryotes for the first time. The development of the polymerase chain reaction (PCR) is one of those innovations that changed the course of molecular science with its impact spanning countless subdisciplines in biology. The theoretical process was outlined by Keppe and coworkers in 1971; however, it was another 14 years until the complete PCR procedure was described and experimentally applied by Kary Mullis while at Cetus Corporation in 1985. Automation and refinement of this technique progressed with the introduction of a thermal stable DNA polymerase from the bacterium Thermus aquaticus, consequently the name Taq DNA polymerase.
PCR is a powerful amplification technique that can generate an ample supply of a specific segment of DNA (i.e., an amplicon) from only a small amount of starting material (i.e., DNA template or target sequence). While straightforward and generally trouble-free, there are pitfalls that complicate the reaction producing spurious results. When PCR fails it can lead to many non-specific DNA products of varying sizes that appear as a ladder or smear of bands on agarose gels. Sometimes no products form at all. Another potential problem occurs when mutations are unintentionally introduced in the amplicons, resulting in a heterogeneous population of PCR products. PCR failures can become frustrating unless patience and careful troubleshooting are employed to sort out and solve the problem(s). This protocol outlines the basic principles of PCR, provides a methodology that will result in amplification of most target sequences, and presents strategies for optimizing a reaction. By following this PCR guide, students should be able to: 
 
&#9679; Set up reactions and thermal cycling conditions for a conventional PCR experiment 
&#9679; Understand the function of various reaction components and their overall effect on a PCR experiment 
&#9679; Design and optimize a PCR experiment for any DNA template 
&#9679; Troubleshoot failed PCR experiments

PCR has emerged as a common technique in many molecular biology laboratories. Provided here is a quick guide to several conventional PCR protocols. Because each reaction is a unique experiment, optimal conditions required to generate a product vary. Understanding the variables in a reaction will greatly enhance troubleshooting efficiency, thereby increasing the chance to obtain the desired result.

Polymerase Chain Reaction: protocollo Basic Plus Strategies Risoluzione dei problemi e ottimizzazione

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Spatial Multiobjective Optimization of Agricultural Conservation Practices using a SWAT Model and an Evolutionary Algorithm

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals across the landscape is of primary importance in watershed management. Traditional economics methods of finding the lowest-cost solution in the watershed context (e.g.,5,12,20) assume that off-site impacts can be accurately described as a proportion of on-site pollution generated. Such approaches are unlikely to be representative of the actual pollution process in a watershed, where the impacts of polluting sources are often determined by complex biophysical processes. The use of modern physically-based, spatially distributed hydrologic simulation models allows for a greater degree of realism in terms of process representation but requires a development of a simulation-optimization framework where the model becomes an integral part of optimization.
Evolutionary algorithms appear to be a particularly useful optimization tool, able to deal with the combinatorial nature of a watershed simulation-optimization problem and allowing the use of the full water quality model. Evolutionary algorithms treat a particular spatial allocation of conservation practices in a watershed as a candidate solution and utilize sets (populations) of candidate solutions iteratively applying stochastic operators of selection, recombination, and mutation to find improvements with respect to the optimization objectives. The optimization objectives in this case are to minimize nonpoint-source pollution in the watershed, simultaneously minimizing the cost of conservation practices. A recent and expanding set of research is attempting to use similar methods and integrates water quality models with broadly defined evolutionary optimization methods3,4,9,10,13-15,17-19,22,23,25. In this application, we demonstrate a program which follows Rabotyagov et al.'s approach and integrates a modern and commonly used SWAT water quality model7 with a multiobjective evolutionary algorithm SPEA226, and user-specified set of conservation practices and their costs to search for the complete tradeoff frontiers between costs of conservation practices and user-specified water quality objectives. The frontiers quantify the tradeoffs faced by the watershed managers by presenting the full range of costs associated with various water quality improvement goals. The program allows for a selection of watershed configurations achieving specified water quality improvement goals and a production of maps of optimized placement of conservation practices.

This work demonstrates an integration of a water quality model with an optimization component utilizing evolutionary algorithms to solve for optimal (lowest-cost) placement of agricultural conservation practices for a specified set of water quality improvement objectives. The solutions are generated using a multi-objective approach, allowing for explicit quantification of tradeoffs.

Spaziale Ottimizzazione multiobiettivo di pratiche di conservazione agricole utilizzando un modello SWAT e un algoritmo evolutivo

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: un plugin per ImageJ semi-automatico di misurazione Leaf Shape

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Un metodo di quantificazione sensibile e specifico per la determinazione del siero miosina cardiaca Binding Protein-C da elettrochemiluminescenza immunoenzimatico

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Strategie per l'ottimizzazione dell'acquisizione dei dati della tomografia elettronica criogenica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Rilevamento in tempo reale della produzione di specie reattive dell'ossigeno nella risposta immunitaria nel riso con un saggio di chemiluminescenza

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Raccolta dell'emolinfa da piccoli artropodi

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus transmission. Hemolymph collection is the basic technology for studying virus-vector interactions. Here, we describe a novel and simple method for the quantitative collection of hemolymph from small arthropods using Laodelphax striatellus (the small brown planthopper, SBPH) as a research model, as this arthropod is the main vector of rice stripe virus (RSV). In this protocol, the process begins by gently pinching off one leg of the frozen arthropod with fine-tipped tweezers and pressing the hemolymph out of the wound. Then, a simple micropipette consisting of a capillary and a pipette bulb is used to collect the transudative hemolymph from the wound according to the principle of capillary forces. Finally, the collected hemolymph can be dissolved into a specific buffer for further study. This new method for collecting hemolymph from small arthropods is a useful and efficient tool for further research on arboviruses and vector-virus interactions.

Autore in primo piano: un metodo preciso e quantificabile per la raccolta dell'emolinfa da piccoli artropodi  

We describe a method to collect quantifiable hemolymph efficiently from small arthropods for subsequent analysis.