Yazarlar Keith Tarpley bize EPA kayıt ve öğretim video düzenleme Office geliştirme, araştırma ve geliştirme-araştırma üçgen Parkı (ORD-RTP) grafik ve medya ekibinin teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Deborah Pritchett ProteinSimple üzerinden bizim veri. duruma getirilmesi ile ilgili yararlı konuşmaları için teşekkür etmek istiyorum JM Guynn bilim ve eğitim araştırma/katılım programı ABD Çevre Koruma Kurumu, Oak Ridge Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Not: tüm reaktifler ve örnekleri üretici göre hazır sağlamak &#39; s protokolü, ana hatlar aşağı. Lütfen uygun bireysel koruma araçları nitril eldiven, önlük, kapalı parmaklı ayakkabılar ve koruyucu gözlük içerir Bu yordam sırasında giymek. Bir tablo belirli malzemeler, reaktifler ve gerekli ekipman ayrı olarak sağlanır. Örnekleri toplam protein konsantrasyonu-var belirlenen Bradford tahlil 11 gibi kullanılan, lysate arabellek ile uyumlu olan kurulan yöntemleri kullanılmadan önce.
 1. örnekleri ve Kimyasalları olarak üretici tarafından sağlanan standart paketinde hazırlanması <ol><li>dithiothreitol (DTT) 400 mM çalışma çözüm hazırlamak için açık tüp içeren 40 µL deiyonize su ekleyin Stok üretici tarafından sağlanan. Kabarcıklar çözümü çözüm yavaş ve yumuşak pipetting ile karıştırılarak tanıtımı önlemek önemlidir.</li>
	<li>Ekle 20 µL 10 X örnek arabellek ve floresan 5 X içeren pembe tüp için hazırlanan 400 mM DTT çözümün 20 µL master mix (Tablo reçetesi görmek). 
	Not: Master Mix (MM) bir folyo kapak ile üretici tarafından mühürlenmiş durumda ve pipet ucu tarafından deldi. DTT pipet sıçramasına önlemek için yavaş yavaş pipetting tarafından Mix.</li>
	<li>Sonra 16 µL deiyonize su ekleyin, 10 X örnek arabellek ve 2 µL hazırlanan 400 mM DTT çözüm için üretici tarafından sağlanan beyaz biotinylated merdiven tüp, 2 µL sağlanan. Karışımı yavaşça ve denaturing için bir 0.6 mL tüp içine transfer.</li>
	<li>Hazırlama 0.1 x tarafından sağlanan 10 su ile çözüm 1: 100 X sulandrarak örnek arabellek. Yeterli 0.1 x tüm örneklerini sulandırmak için örnek arabellek hazırlayın.</li>
	<li>Son istenen toplam protein konsantrasyonu bağlı olacak bir örnek eklenir 0.1 x örnek arabellek miktarını hesaplamak. Mix 1 Bölüm 5 floresan MM x 4 parça ile istenen son protein konsantrasyonu elde etmek için örnek seyreltilmiş.
	<ol><li>Hesaplama birimleri aşağıdaki gibi: (i) Cilt 5 x floresan MM (istenilen son protein konsantrasyonu) = / 5; (ii) protein stok hacmi (istenilen son protein konsantrasyonu x Toplam hacim gerekli) = / Protein hisse senedi toplama; (iii) birim 0.1 x örnek arabellek Toplam hacim - 5 MM birim x - Protein stok hacmi =.</li>
	</ol></li></ol> 2. Denatürasyon örnekleri ve merdiven <ol><li>hazırlanan yer örnekleri ve biotinylated merdiven 5 dk. girdap tüpler kuluçka, hemen sonra bir 95 ° C ısı bloğundaki yürütmek bir spin için ~ 5 s bir masa üstü santrifüj ve buz üzerinde yer 
	Not: Bazı proteinler, protein toplama önlemek ve göç kılcal matrisindeki geliştirmek için nazik denaturing koşulları (örneğin, 70 o C 10 dk) gerektirebilir. Eğer ağır yüksek moleküler ağırlık vasıl bulaşması (örneğin video bakınız) bu seçeneği düşünün.</li>
</ol> 3. Antikorların hazırlanması <ol>optimizasyonu ile saptanan <li>(Temsilcisi sonuçları ve video bakınız), birincil antikor (örneğin, 1:50, 1: 100) istenen dilution(s) sağlanan antikor hazırlamak Dilüent 2. 
	Not: Antikorlar genellikle daha yüksek konsantrasyonları immunoassay kılcal tabanlı geleneksel Batı kurutma için kullanılır. Sağlanan ikincil antikor seyreltme kullanıma hazırdır.</li>
</ol> 4. Luminol-S ve peroksit hazırlanması <ol><li>luminol-S ve peroksit 1:1 karışımı hazırlayın.</li>
	<li>Girdap karışımı ve buz üzerinde depolamak için 
	Not: Bu karışımı taze deneysel her tahlil için hazırlanır önemlidir. 250ul toplam karışımı tam bir tabak çalıştırmak için gerekli.</li>
</ol> 5. Tahlil plaka hazırlanması <ol><li> şekil 1 ' de gösterildiği gibi yük örnekleri ve yukarıda tahlil plaka hazırlanan Kimyasalları. Her satır için aşağıda ayrıntılı talimatlara bakın. Plaka kapak reaktif eklemeler arasında değiştirilir kuyulardan buharlaşma en aza indirmek için emin olun.</li>
	<li>İyi A1 içine A, damlalıklı 5 µL Biotinylated merdivenin satırda. İçin kalan satır, damlalıklı hazırlanan örnekleri (5 her µL) kuyu A2-A25. 
	Not: Kartuş ilk kılcal bu standart çalıştırmak için optimize edildiğinden bu A1 de her zaman merdiveni, içerir zorunludur.</li>
	<li>Satır B, antikor Dilüent 2 damlalıklı 10 µL her kuyuya (B1-B25).</li>
	<li>İyi C1 içine C, damlalıklı 10 µL antikor Dilüent 2 satırda. Kalan satır C kuyuları, birincil antikor (kuyu C2-C25) damlalıklı 10 µL.</li>
	<li>Satır D, damlalıklı 10 µL Streptavidin-HRP, iyi D1 içine. Kalan satırda D kuyuları, ikincil antikor (kuyu D2-D25) damlalıklı 10 µL.</li>
	<li>E, damlalıklı 10 µL her kuyuya (E1-E25) taze hazırlanmış luminol-peroksit karışımı satırdaki.</li>
	<li>Son olarak, Ekle yuvası başına 500 µL yıkama arabellek her top 3 satır arabellek Wells. 
	Not: Kabarcık oluşumu hafifçe pipetting ve kabarcıklar yükleme kılcal ile müdahale ve çalıştırabilirsiniz ucundan son hacim kovmak değil en aza indirmek önemlidir.</li>
	Bir kez tüm wells yüklü, <li>~ 1000 x g kabarcıklar kaldırmak ve kuyu dibinde sıvı olduğundan emin olmak için oda sıcaklığında 5 min için plaka santrifüj kapasitesi. Bir küçük pipet ucu veya temiz iğne ile herhangi bir görünür baloncuklar pop (örneğin, 25 göstergesi steril &#34; rep üst &#34; iğne).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> Resim 1 . Tahlil plaka için pipetting şablon. Renk kodlamasını uygun reaktifler ve tahlil plakasına eklendi örnekleri (24 toplam) temsil eder. Biotinylated merdiven örnekleri kuyulardan A2 A25 kadar hazırlanan iyi A1 (turuncu), Ekle (açık mavi), antikor Dilüent 2 kuyu B1-B25 ve C1 ' (açık yeşil), kuyu C2 C25 (mavi), streptavidin-HRP iyi D1 için kadar birincil antikor (koyu pembe), ikincil antikor D2 D25 kadar Kuyu yapımı (koyu yeşil) ve kuyu E1 E25 (mor) kadar luminol-peroksit karışımı. Yıkama arabellek daha büyük orta plaka ilk üç sıra eklendi wells (koyu mavi). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
 6. kılcal immunoassay enstrüman başlayan <ol><li>araç ve eşlik eden bilgisayarın açık olduğundan emin olun. Hiçbir ısınma zamanı gereklidir.</li>
	<li>Bilgisayar araçları yazılımını açın. Önce seçin &#34; tahlil &#34; pencerenin sağ sekmesini ve &#34; yeni tahlil &#34; altında &#34; Dosya menüsü &#34; solda. Boyut, boyut aralığı (örneğin, 12-230 kDa) ve kartuş seçin özel tahlil için kullanılan türü (örneğin, 25 kılcal). 
	Not: Bir de giriş Mayıs tahlil parametrelerini, protein konsantrasyonu, antikor türü ve seyreltme, eğer dahil olmak üzere istenen ama bunlar tahlil başlatmak için gerekli değil.</li>
	<li>Turuncu panelinin üstüne düğmeye basarak kapıyı cihazda.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde onun paketinden kapiller kartuşu çıkarın. Cam kılcal kendilerini dokunmadan, kartuş, kartuş tutucusuna koyun. Mavi ve turuncu değiştirmek iç ışık gözlemleyerek kartuş oturma doğrulayın.</li>
	<li>Plaka sıkıca kenarda tutun ve buharlaşma mühür plaka alt bölümünden dikkatle akasındaki. Bu ayrılık matris wells bir sm ile görülen herhangi bir baloncuklar popBütün damlalıklı ipucu veya temiz iğne (örneğin, 25 göstergesi steril &#34; rep üst &#34; iğne).</li>
	<li>Tahlil plaka yer tam olarak oturduğundan, sağlanması plaka tutucu üzerinde ve enstrüman kapıyı kapat.</li>
	<li>Tıklama &#34; başlangıç &#34; yazılımında butonunu. 
	Not: Başlat düğmesi görünüyorsa araç ile bağlantı kesildi. Araç üst sol menüden seçin, ardından bağlayın. Bir pop-up araç seri numarası ile görünmelidir; Bu seçin ve sonra Bağlan'ı tıklatın. Başlat düğmesini şimdi görünmelidir.</li>
	Çalışma tamamlandıktan sonra <li>plaka atmak. Kartuşu ve elden çıkarma, pop baloncuklar için kullanılan herhangi bir iğne ile birlikte "Sharps" kapsayıcısı yer. Güç aracı düzenli olarak kullanılıyorsa, bağlantı sorunlarını önlemek için bırakın (örneğin, en az haftalık).</li>
</ol> 7. Deneme analiz <ol><li>analiz daha önce aşağıdaki kalite kontrolleri yapılmaktadır emin olun.
	<ol><li>Seçerek doğrula floresan standartları &#34; göstermek standartları &#34; simgesi. Standartlara doğru olarak tanımlanan onay &#34; grafiği &#34; sekme. Onlar doğru değilse, gidin &#34; tek görünüm &#34; simgesi, doğru tepe üzerinde sağ tıklayın ve seçin &#34; kuvvet standart &#34;, ya da yanlış tepe üzerinde sağ tıklayın ve seçin &#34; standart değil &#34;. Her yeni kılcal için bu denetimi yap.</li>
		Yanında tıkırtı üstünde <li>Doğrula biotinylated merdiven &#34; örnekleri &#34; ve &#34; tek görünüm &#34; simgeler. Merdiveni deney sekmesinde seçin. Bir tepe yanlış teşhis, doğru içinde tıkırtı üstünde &#34; grafik görünümü &#34; ve seçin &#34; Kaldır tepe &#34;. 
		Not: Örneğin, 12, 40, 66, 116, 180 ve 230 kDa boyutlandırma doruklarına 12-230 kDa teçhizat için kullanılan biotinylated merdiven göstermelidir. Eğer bu adım gerçekleştirilmez, örnek doruklarına boyutlandırma yanlış hesaplanır, sahte sonuç.</li>
		<li>Görünümü ve örnek doruklarına analiz. Molekül ağırlığı, pik alanı, pik yüksekliği ve sinyal-gürültü (S/N), deneysel hesaplamalar için gerektiği gibi de dahil olmak üzere zirveleri tablosundan veri türetmek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hematopoietic stem cell protocols. 1185, (2014).</li><li>Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+(hiPSC-CMs)+to+Monitor+Compound+Effects+on+Cardiac+Myocyte+Signaling+Pathways.">Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways.</a> Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).</li><li>Chen, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+endogenous+proteins+with+precision+and+accuracy+using+a+capillary+Western+system.">Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system.</a> Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).</li><li>Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+nano-immunoassays:+advancing+quantitative+proteomics+analysis,+biomarker+assessment,+and+molecular+diagnostics.">Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics.</a> J Transl Med. 13, 182 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Application+of+a+Novel+Nanovolume+Capillary+Electrophoresis-+Based+Protein+Analysis+System+in+Personalized+&amp;+Translational+Medicine+Research.">The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized &amp; Translational Medicine Research.</a> J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).</li><li>ProteinSimple Western. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western++blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+Western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis.">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> J Vis Exp. (84), e51149 (2014).</li><li>Thorn, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+pathways:+pharmacodynamics+and+adverse+effects.">Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects.</a> Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> J Vis Exp. (38), (2010).</li><li>Taira, N., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+p53+tumor+suppressor:+determinants+of+its+functional+targets.">Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets.</a> Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).</li><li>Thompson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+p53+on+key+serines+is+dispensable+for+transcriptional+activation+and+apoptosis.">Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis.</a> J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).</li><li>Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+Gene+Biomarker+at+the+Tipping+Point+of+Adaptive+and+Adverse+Responses+in+Human+Bronchial+Epithelial+Cells.">Developing a Gene Biomarker at the Tipping Point of Adaptive and Adverse Responses in Human Bronchial Epithelial Cells.</a> PLoS One. 11 (5), e0155875 (2016).</li><li>Moser, A. C., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-based+immunoassays:+principles+and+quantitative+applications.">Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications.</a> Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , (1997).</li><li>. Wes reagents and consumables :: ProteinSimple Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html">https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</a> (2017)</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin. Bu makale Ulusal Sağlık ve çevre etkileri araştırma laboratuvarı tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmış yayın için. İçerik bize EPA görüşlerini yansıtmayabilir ne de ticari adlar veya ticari ürünler söz ciro veya kullanım için tavsiye teşkil etmez.

On yıllardır, oldu sürekli Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntem geliştirme ilgi işleme azalmıştır düşük örnek ve reaktif harcamaları nedeniyle, zaman zaman geleneksel yöntemlere göre ve yüksek uyumluluk için yordam4,15otomatikleştirmek. Kılcal damarlar, elektroforetik, electrokinetic, polimer eleme ve proteinler (sırasıyla farklı özelliklerine göre ayır, isoelectric yöntemleri de dahil olmak üzere kullanılan proteinler ayrılması için farklı iletişim kuralları vardır Elektrostatik yükü, bölüm denge, özellikleri ayıran matris ve pH eleme)16. Burada, bir otomatik ayırma, eleme bir polimer kullanarak antikor tabanlı (veya immunoassay) Kapiler elektroforez yöntemi ve ticari olarak kabul edilen3açıklayın. Bu sistemin avantajları kolaylığı kullanım ve işlem, standart ve piyasada bulunan reaktifler ve daha az reaktif ve geleneksel protein deneyleri Batı leke gibi karşılaştırıldığında örnekleri gerektirir güvenilir, duyarlı ölçümler şunlardır, enzim bağlı immunoassay ve diğer formatları3,4,5. O bu teknoloji önceki Değerlendirmeler içinde değerlendirilebilir protein boyutu aralığı tarafından kullanılabilir ayırma matris4ancak son teklifleri için 440 kDa17 2 Aralık ölçülebilir genişlettik, sınırlı dikkat edilmiştir . Buna ek olarak, bazı lysate arabellekleri tahlil18ile uyumsuz olduğu bilinmektedir, bu nedenle kullanılan deneysel reaktifler yelpazesi önceden dikkate alınmalıdır.
Bir otomatik işlemi piyasada bulunan bileşenleri ile önemli bir avantajı standartlaştırılmış yöntemler ve Kimyasalları ile sonuç tutarlılığını var. Bu tahlil başarısızlık yordam içinde kritik adımlar otomatikleştirerek bozmasını önler. Ancak, bazı uygulamalar için Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay sorunları en aza indirmek için protokol sırasında yapıştırılır gerekir olduğunu unutmamak gerekir. İlk olarak, bu luminol-S/peroksit karışımı taze ve hemen önce yükleme plakası hazırlanır önemlidir. Oksitleyici Ajan, sonra tahlil belirli antikor tayini için tutarlı ölçümleri ile sonuçlanır eklendikten sonra tutarlı zamanlama içinde tutarlı ışıldama neden olur. Ayrıca, süresi bitmemiş reaktifler, hangi öncelikle oksitleyici Ajan potens etkiler kullanılır önemlidir. Ayrıca, örnekleri, antikorlar ve diğer Kimyasalları yükleme sırasını kesinlikle (bkz. şekil 1) takip edilmesi önemlidir. Yersiz pipetted herhangi bir reaktif tahlil başarısızlık ve boşa koşmak sonuçlanır.
Kritik adımları yanı sıra, birincil sorunları tekniği ile deneyimli genellikle optimizasyon ile aşılabilir. Nitekim, bu koşullar her modeli sistem/antikor birleşimi için özeldir ve bu nedenle ampirik olarak her yeni tahlil için tespit edilmelidir. Bu makalede, biz üç ortak en iyi duruma getirme yordamı üzerinde odaklanmak: çekim hızı, lysate titrasyon ve birincil antikor seyreltme. Ne zaman luminol substrat hızla, substrat tükenmesi sonuçlarına sinyal kaybı tükenmiştir değil bir çekim hızı analizini ölçülebilir sonuçlar oluşturma yeteneği bağlıdır. Lysate titrasyon farklı model sistemleri, hem de aynı protein hedef için bile farklı antikorlar ile farklı olabilir her tahlil doğrusal dinamik aralığını belirler. Antikor dilutions veya konsantrasyonları doyurarak yakınındaki seçilmiş ücretsiz antikor yetersizliğinden, ancak kullanılabilir protein hedef epitope farklı miktarda sadece sinyal değişiklikleri etkilenmeyecektir emin olun. Diğer konuları en iyi duruma getirme işlemi sırasında antikor kuluçka süresi ve istifleme/örnek yükleme süresi içerebilir. Çoğu durumda varsayılan ayarlar için araç en iyi çözünürlük ve hassasiyet dengesini sunuyoruz. Ancak, bazı durumlarda yanlış çözünürlükte veya duyarlılık bu parametreleri ayarlayarak geliştirilebilir.
Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntemleri protein hızlı, verimli ve tekrarlanabilir ölçümler sağlar. Bu yöntemler öncelikle araştırma ve geliştirme ayarlarında kullanılan iken, bu teknolojilerin tutarlılık düzenleyici ve klinik uygulamaları potansiyel yarar vardır. Örneğin, duyarlı altgrupları çevre toxicants veya hasta kimlik hastalığın ilerlemesi ile protein biyolojik kan, idrar ve tükürük gibi erişilebilir matrisler ölçülen temel alabilir. Reaktif ve işlem maliyetleri bırak ve örnekleri ve aynı anda biçilen artar olabilir hedeflerin sayısı, biz büyük olasılıkla bu tür uygulamalar için kullanılan Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntemleri göreceksiniz.

Kapiler elektroforetik uzun boyutu veya şarj ayırma sistemleri kullanarak hücre lysates ifadede protein ölçmek ve geleneksel uzun çeşitli avantajlar sağlar. Örneğin, Batı leke için karşılaştırıldığında, kılcal tabanlı otomatik işlemleri jelleri, aktarım cihazları, gereksinimini ortadan kaldırır ve manuel yıkar. Buna ek olarak, mutlak gerekli protein yaklaşık 10 kat daha az, kılcal tabanlı sistemler nadir hücre tipleri veya sınırlı örnek1,2ile kullanmak için idealdir miktarıdır. Sonuçlar az 3 h otomatik sistemler kullanarak olarak elde edilen ve daha önce daha nicel ve geleneksel Batı daha tekrarlanabilir gösterilmiştir yordamlar3,4,5leke. Işlem boyutu tabanlı deneyleri için Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), dithiothreitol (DTT), içeren örnekleri yükleme oluşur ve fluorescently molekül ağırlığı işaretleri istifleme ve ayırma matrisler içeren kapiller sütunlara etiketli. Kılcal damarlar için uygulanan gerilim büyüklüğüne göre örneklerinde proteinler ayırır ve UV ışığı kapiller duvarı için ayrılmış proteinlerin immobilizes. Kılcal sonra IMMUNO probed-hedef özgü birincil antikor ve horseradish peroksidaz ile (HRP)-konjüge ikincil antikor. Luminol ve peroksit bir ücret eşleşmiş cihaz (CCD) kamera tarafından ölçülen ve protein quantitate için analiz chemiluminescent ışık nesil katalizler.
Göreli kolaylık ve hız bir kılcal tabanlı otomatik elektroforetik immunoassay platformu rağmen tahlil koşulları protein konsantrasyonu, antikor seyreltme ve çekim hızı gibi duruma getirilmesi doğru tekrarlanabilir elde etmek için önemlidir sonuçlar. Genel olarak, bir tahlil bu sistemler için en iyi duruma getirmek için aşağıdaki yordamları yapılmalıdır:
1) bir ekran değerlendirmek ve antikorlar sinyal ve özgüllük protein hedef seçmek için yapılmalıdır. Varsa, saf protein veya hedef epitope özgüllük değerlendirmek için kullanılabilir; Ancak, toplam protein modeli sisteminden kaynaklı olası belirsiz sinyal değerlendirmek hala önemlidir.
2) sonra tahlil dinamik aralığını belirlenmesi gerekiyor. Örnek toplama iki katına gibi ideal bir sinyal (pik alanı kullanarak ölçülen) iki katına görülmektedir; Ancak, uygulamada, tahmin edilebilir bir şekilde (uygunörneğin, doğrusal) giriş için sinyal orantılı bir değişiklik protein miktar için yeterlidir. Ayrıca, bu iyileştirme protein konsantrasyonu yüksek sinyal ile ama hala deneysel model için doğrusal aralık içinde tanımlayabilirsiniz.
3) en iyi duruma getirme adım 2'de seçilen sabit protein konsantrasyonu kullanarak en uygun antikor konsantrasyonu belirlemek. Antikor konsantrasyonu artırır, sinyal o doygunluk yaylalar kadar artar. Bu doygunluk düzeyi yakınındaki bir antikor konsantrasyonu protein konsantrasyonu doğru ölçüm için gereklidir.
Protein konsantrasyonları, antikor dilutions ve pozlama süreleri bir kılcal tabanlı otomatik boyut tahlil6 için en iyi duruma getirmek için kullandığı işlem bütün hücre özleri BEAS-2B bir SV-40 dönüştürülmüş insan bronş izole kullanarak gösterilmiştir epitel hücre satırı. Hücre veya doku özleri protein izolasyon çok sayıda yayımlanan protokolleri7,8,9 kullanarak gerçekleştirilebilir ve burada yer almaz. En iyi duruma getirilmiş koşullar kullanarak bir deneme deneme sonuçlarını da için toplam bildirdi ve fosforile (serin 15, serin 20) p53 1,2, doksorubisin (hücre apoptosis10ikna bir ortak kemoterapötik Ajan) maruz kültürlerde 1.8, ve 2.4 µg/mL medya 4 hasat öncesinde s için. P53 en yüksek alanlarda yükleme denetimi olarak kullanılan ɑ-tübülin için normalleştirilmiş.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wes instrument</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td>004-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P53 DO-1 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-tubulin primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873</td>
			<td>used as a loading control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass Software</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td></td>
			<td>provided with the Wes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-230 kDa Master kit</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&#160;</td>
			<td>PS MK02 (since replaced by a new kit #)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td>
			<td>INCLUDES PART NO: 
			Wash Buffer (60 mL) 042-202 
			10X Sample Buffer (440 &#956;L) 042-195 
			Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 
			Capillary Cartridges (8) PS-CC01 
			Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 
			Luminol-S (1.5 mL) 042-233 
			Peroxide (1.5 mL) 042-234 
			Streptavidin-HRP (132 &#956;L) 042-414 
			Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 
			Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 
			or 
			Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte growth medium, KGM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192152</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte basal medium, KBM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192151</td>
			<td>serum free medium for chemical dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue Bradford Assays</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>23200</td>
			<td>for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Extract kit</td>
			<td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D1515</td>
			<td>used to prepare whole cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INCLUDES:</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer AM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M dithiothreitol (DTT)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X PBS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method

Uzun kılcal tabanlı kullanmak yeni teknolojiler için geleneksel uzun kıyasla daha hızlı ve daha nicel protein değerlendirme söz veriyorum. Ancak, benzer şekilde diğer protein antikoru tabanlı deneyleri, protein konsantrasyonu, antikor seyreltme ve çekim hızı gibi kılcal tabanlı immunoassay parametrelerinin Optimizasyonu önemli bir anlamlı ve güvenilir nesil önkoşuldur veri. Ölçümleri sinyal değişiklikleri lysate konsantrasyon değişiklikleri doğrudan orantılı nerede tahlil doğrusal aralık içinde olmalıdır. Uygun lysate konsantrasyonları, antikor dilutions ve pozlama süreleri insan bronş epitel hücre hat, BEAS-2B, seçme işlemi burada gösterilmiştir. Tahlil doğrusallık tüm cep telefonu özü protein konsantrasyonları p53 ve α-tübülin antikorları ile bir dizi üzerinden gösterilir. Sinyal tükenmişlik örneği uzun pozlama süreleri ile en yüksek konsantrasyonlarda görülür ve doygunluk gösteren bir α-tübülin antikor seyreltme eğrisi gösterilir. Ayrıca, örnek deneysel sonuçlar en iyi duruma getirilmiş parametrelerini kullanarak doksorubisin tedavi hücreler için raporlanır.

Çekim hızı - Belirleme sinyali tükenmişlik
Luminol ve peroksit substrat çok hızlı bir şekilde boşaldığında sinyal tükenmişlik oluşabilir. Bu verileri farklı Kemiluminesan pozlama zaman tarafından belirlenebilir. Analiz yazılımı düzenleme - &#62; analiz - &#62; "resimler" için gidin. Pozlama aralığı 5 ila 480 s. Her poz verilerden benzer bir sinyal/saat katsayısı olmalıdır böylece sinyal/saat, y ekseni bir electropherogram içinde bildirir. Luminol tükenmiş olur bu katsayısının sırayla uzun pozlama ile p53-1 antikor (Şekil 2) ile görülen azalır. Substrat tükenmesi nedeniyle, bu tahlil ölçülebilir 0.2 µg/µL konsantrasyonu sadece 5-30 s Etkilenmeler kadar kabul edilebilir. Bu nedenle, bu örnekte 15 s p53 en uygun veri analizi pozlama zaman olmaya kararlıydım.
Lysate titrasyon - Doğrusal dinamik aralığı belirleme
Bu ölçümler her tahlil doğrusal dinamik aralığı içinde en yüksek bölgelere göre ölçülen sinyal değişiklikleri değişiklikleri örnekteki protein miktarı ile orantılı nerede alınması önemlidir. 15 s seçilmiş en uygun çekim hızı kullanarak önceki bölümde, tahlil doğrusallık p53 ve ɑ-tübülin için konsantrasyon (şekil 3) 15-fold bir dizi daha büyük üzerinde gösterilmiştir. Bizim deneyim, R2 değeri &#62; 0,9 bir doğrusal regresyon uygun olarak kabul edilir (tahlil mutlak bir nicel ölçüm ise) bilinen miktar veya örnek saf protein bir seyreltme aralığı için kabul edilebilir bilinmeyen hedef protein lysate (eğer tahlil göreli bir nicel ölçüm) olduğunu.
Antikor seyreltme duruma getirilmesi
Konsantrasyonları doyurarak antikorları kullanarak ölçülen herhangi bir sinyal değişiklikleri sadece protein miktarı değişikliklere bağlı olduğundan emin olun yardımcı olur. Gücümüzü, Bütün hücre (tahlil içine yüklenen 0.2 µg/µL toplam protein) ayıklar iki BEAS-2B hücre satır 1:25 - 1:800 (şekil 4) arasında değişen seri olarak seyreltilmiş ɑ-tübülin antikor konsantrasyonları ile probed. Chemiluminescent sinyal (burada, pik alanı olarak ölçülür) karşı antikor seyreltme çizildi. Doygunluk 1:50 gözlenen eğri göze çarpan bir plato başladığı seyreltme.
Deneysel deneme - BEAS-2B hücrelerdeki doksorubisin tedavi
En iyi duruma getirilmiş tahlil koşul kullanma, BEAS-2B hücre kültürü doksorubisin üç farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi (1,2, 1.8 ve 2.4 µg/mL) için 4 h (5 rakam, Tablo 1). P53 translasyonel modifikasyonlar ile aktivasyonu hücre döngüsü tutuklama, yaşlanma ve Apoptozis12de dahil olmak üzere çeşitli hücresel yanıt aracılık eder. Özellikle, Apoptozis doksorubisin tedavi13den sonra sonuçlanan p53, transkripsiyon aktivasyonu için serin 15 fosforilasyon sanılıyor. Bu gösteride, ɑ-tübülin alanları kontrol kat sunulan en yüksek normalleştirilmiş. İlginçtir, 3.5 4-fold artışlara p53 fosforilasyon, serin serin 20 fosforile p53 düzeyini 15 ve logosuna 2 kat artış doksorubisin 4 h maruz kaldıktan sonra gözlendi. Bu sonuçlar p53 aktivasyonu olduğunu gösterir; Ancak, doz-yanıt seçilen konsantrasyonları görülür (tersine, test en düşük doz en yüksek yanıt elde edildi). Toplam p53 açık tedaviye yanıt bu modeli sistemde göstermek değil. Biz daha önce çinko tedavi BEAS-2B hücreleri14' te toplam p53 benzer koşullar altında yüksek düzeyde yokluğunda p53 fosforilasyon aktivasyonu gözlemledim.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Resim 2 . Sinyal tükenmişlik algılamak için pozlama görüntü karşılaştırma. Lane protein konsantrasyonları ile p53-1 antikor 1:500 seyreltme at probed BEAS-2B lysates için azalan göstermek görüntüler. Kemiluminesan sinyal katsayıları, tepe yükseklikleri enstrüman yazılım olarak rapor üst üste. Tepe yükseklikleri farklı olarak görsel grup yoğunluklarda otomatik olarak oluşturulan ve bantları ve bir panelden diğerine değil karşılaştırılabilir görüş yardım etmek için aracı tarafından ayarlanır. Kemiluminesan sinyal azalma kaybolmaya başlayan sinyali ile (split tepe) substrat tükenmesi gösteren iki uzun pozlama, pozlama süresi arttıkça unutmayın. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Şekil 3 . Lysate titrasyon lane sayısı gösteriliyor. Lysate titrasyon lane gösterilen (A) BEAS-2B 1:500 p53-1 veya 1:50 ɑ-tübülin ile probed zaman lysate kez. En yüksek alan değerleri farklı olarak, görsel grup yoğunluklarda otomatik olarak oluşturulan ve bantları ve bir panelden diğerine değil karşılaştırılabilir görüş yardım etmek için aracı tarafından ayarlanır. Doğrusal regresyon çözümlemesi (B) deneyleri, 0.01 0.20 µg/µL ve 0,025-0,40 µg/µL, 0.999 ve 0.985, R2 değerleri ile sırasıyla test tüm aralığında doğrusal onaylar. Toplam protein konsantrasyonları doğrusal aralık ortasında potansiyel hedef protein değişim her iki yönde de (örneğin, α-tübülin için 0.2 µg/µL) karşılamak için seçilmiştir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Şekil 4 . İki ayrı BEAS-2B protein lysates olan ve olmayan temel normalleştirme için α-tübülin antikor seyreltme eğrileri. Kesin bir ulusTure doğrusallık üzerinden 1:50 (0.02) görülür seyreltme, doygunluk gösteren. 1:50 bu nedenle bu antikor için en uygun seyreltme olarak seçilmiştir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Şekil 5. Toplam ve serin 4 h doksorubisin (DXN) tedavisinin etkisi fosforile p53 protein ifade BEAS-2B hücre. Tepe alanları α-tübülin için normalleştirilmiş ve denetim (CTL) kat çizilen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tablo 1. Toplam ve serin 4 h doksorubisin (DXN) tedavisinin etkisi fosforile p53 protein ifade BEAS-2B hücre. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">Bu tablo daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Hedef proteinler üzerinden toplam protein ürünleri ölçmek için bir ticari platformu kullanarak bir kılcal tabanlı immunoassay gösterilmiştir. Buna ek olarak, pozlama süresi, protein konsantrasyonu ve antikor seyreltme tahlil parametreleri bir hücre kültür modeli sistemi için optimize edilmiştir.

Yordam ve anahtar optimizasyon stratejileri için bir otomatik Kapiler elektroforetik tabanlı Immunoassay yöntemi

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

procedure-key-optimization-strategies-for-an-automated-capillary

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Görüntüleme.  U.S. Environmental Protection Agency. Hedef proteinler üzerinden toplam protein ürünleri ölçmek için bir ticari platformu kullanarak bir kılcal tabanlı immunoassay gösterilmiştir. Buna ek olarak, pozlama süresi, protein konsantrasyonu ve antikor seyreltme tahlil parametreleri bir hücre kültür modeli sistemi için optimize edilmiştir.

Video: Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Paralel Sentezi ve Otomatik Liquid Handling kullanma Ugi Reaksiyon optimizasyonu

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Biyoloji

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of microbiology was transformed with the advent of Anton van Leeuwenhoek&#39;s microscope, which allowed scientists to visualize prokaryotes for the first time. The development of the polymerase chain reaction (PCR) is one of those innovations that changed the course of molecular science with its impact spanning countless subdisciplines in biology. The theoretical process was outlined by Keppe and coworkers in 1971; however, it was another 14 years until the complete PCR procedure was described and experimentally applied by Kary Mullis while at Cetus Corporation in 1985. Automation and refinement of this technique progressed with the introduction of a thermal stable DNA polymerase from the bacterium Thermus aquaticus, consequently the name Taq DNA polymerase.
PCR is a powerful amplification technique that can generate an ample supply of a specific segment of DNA (i.e., an amplicon) from only a small amount of starting material (i.e., DNA template or target sequence). While straightforward and generally trouble-free, there are pitfalls that complicate the reaction producing spurious results. When PCR fails it can lead to many non-specific DNA products of varying sizes that appear as a ladder or smear of bands on agarose gels. Sometimes no products form at all. Another potential problem occurs when mutations are unintentionally introduced in the amplicons, resulting in a heterogeneous population of PCR products. PCR failures can become frustrating unless patience and careful troubleshooting are employed to sort out and solve the problem(s). This protocol outlines the basic principles of PCR, provides a methodology that will result in amplification of most target sequences, and presents strategies for optimizing a reaction. By following this PCR guide, students should be able to: 
 
&#9679; Set up reactions and thermal cycling conditions for a conventional PCR experiment 
&#9679; Understand the function of various reaction components and their overall effect on a PCR experiment 
&#9679; Design and optimize a PCR experiment for any DNA template 
&#9679; Troubleshoot failed PCR experiments

PCR has emerged as a common technique in many molecular biology laboratories. Provided here is a quick guide to several conventional PCR protocols. Because each reaction is a unique experiment, optimal conditions required to generate a product vary. Understanding the variables in a reaction will greatly enhance troubleshooting efficiency, thereby increasing the chance to obtain the desired result.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Temel Protokol Plus, Sorun ve Optimizasyon Stratejileri

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Spatial Multiobjective Optimization of Agricultural Conservation Practices using a SWAT Model and an Evolutionary Algorithm

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals across the landscape is of primary importance in watershed management. Traditional economics methods of finding the lowest-cost solution in the watershed context (e.g.,5,12,20) assume that off-site impacts can be accurately described as a proportion of on-site pollution generated. Such approaches are unlikely to be representative of the actual pollution process in a watershed, where the impacts of polluting sources are often determined by complex biophysical processes. The use of modern physically-based, spatially distributed hydrologic simulation models allows for a greater degree of realism in terms of process representation but requires a development of a simulation-optimization framework where the model becomes an integral part of optimization.
Evolutionary algorithms appear to be a particularly useful optimization tool, able to deal with the combinatorial nature of a watershed simulation-optimization problem and allowing the use of the full water quality model. Evolutionary algorithms treat a particular spatial allocation of conservation practices in a watershed as a candidate solution and utilize sets (populations) of candidate solutions iteratively applying stochastic operators of selection, recombination, and mutation to find improvements with respect to the optimization objectives. The optimization objectives in this case are to minimize nonpoint-source pollution in the watershed, simultaneously minimizing the cost of conservation practices. A recent and expanding set of research is attempting to use similar methods and integrates water quality models with broadly defined evolutionary optimization methods3,4,9,10,13-15,17-19,22,23,25. In this application, we demonstrate a program which follows Rabotyagov et al.'s approach and integrates a modern and commonly used SWAT water quality model7 with a multiobjective evolutionary algorithm SPEA226, and user-specified set of conservation practices and their costs to search for the complete tradeoff frontiers between costs of conservation practices and user-specified water quality objectives. The frontiers quantify the tradeoffs faced by the watershed managers by presenting the full range of costs associated with various water quality improvement goals. The program allows for a selection of watershed configurations achieving specified water quality improvement goals and a production of maps of optimized placement of conservation practices.

This work demonstrates an integration of a water quality model with an optimization component utilizing evolutionary algorithms to solve for optimal (lowest-cost) placement of agricultural conservation practices for a specified set of water quality improvement objectives. The solutions are generated using a multi-objective approach, allowing for explicit quantification of tradeoffs.

SWAT modeli kullanarak Tarım Koruma Uygulamalarının Mekansal Çok Amaçlı Optimizasyon ve Evrimsel Algoritma

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: Yarı otomatik Yaprak Shape Ölçüm için bir ImageJ Plugin

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Kriyojenik Elektron Tomografi Veri Kazanımının Optimizasyonu stratejileri

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Kemilüminesans Testi ile Pirinçte İmmün Yanıtta Reaktif Oksijen Türleri Üretiminin Gerçek Zamanlı Tespiti

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplanması

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus transmission. Hemolymph collection is the basic technology for studying virus-vector interactions. Here, we describe a novel and simple method for the quantitative collection of hemolymph from small arthropods using Laodelphax striatellus (the small brown planthopper, SBPH) as a research model, as this arthropod is the main vector of rice stripe virus (RSV). In this protocol, the process begins by gently pinching off one leg of the frozen arthropod with fine-tipped tweezers and pressing the hemolymph out of the wound. Then, a simple micropipette consisting of a capillary and a pipette bulb is used to collect the transudative hemolymph from the wound according to the principle of capillary forces. Finally, the collected hemolymph can be dissolved into a specific buffer for further study. This new method for collecting hemolymph from small arthropods is a useful and efficient tool for further research on arboviruses and vector-virus interactions.

Yazar Spotlight: Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplamak İçin Kesin ve Ölçülebilir Bir Yöntem  

We describe a method to collect quantifiable hemolymph efficiently from small arthropods for subsequent analysis.