מחקר זה נתמך על ידי הלאומית למחקר, פיתוח חדשנות Office הונגריה (גרנט 116912 כדי ÁH), המשרד עלות (מזון, חקלאות עלות פעולה FA1205: AQUAGAMETE), התכנית מלגת Hungaricum Stipendium (מענק ZM) והמעבד החדש ההונגרית הלאומית Predoctoral הצטיינות (מענק EK).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי לחוק לרווחת בעלי חיים הונגרי.
1. מגיב הכנה
<ol><li>פתרונות מניות<ol>
<li>להכין טרהלוז 1 מ' על-ידי הוספת 0.378 גר' טרהלוז וגופרית והרכבו לתוך 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>להכין סוכרוז 1 מ' על-ידי הוספת 0.342 גר' סוכרוז לתוך 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>להכין 1 מ' HEPES על-ידי הוספת 0.238 גר' HEPES 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>להכין collagenase 20 מ"ג/מ"ל (U 290/mg) על-ידי הוספת 100 מ ג מ ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.</li>
		<li>להכין טריפסין 15 מ"ג/מ"ל (~ 10000 U/mg) על-ידי הוספת 75 מ"ג עד 5 מ"ל ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.</li>
		<li>להכין 1 מ"ג/מ"ל DNase אני (~ 3000 U/mg) על-ידי הוספת 5 מ"ג עד 5 מ"ל ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.</li>
		<li>להכין 0.4% trypan blue על-ידי הוספת 40 מ"ג trypan blue 10 מ"ל ל- PBS. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. 1 מ"ל aliquot לתוך צינורות 1.5 mL.</li>
		<li>להכין 200 mg/L MS-222 (Tricaine מתאן סולפונאט) על-ידי הוספת 200 מ ג של MS-222 לתוך 1 ליטר של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין. בנוסף, MS-222 בופר עם סודיום ביקרבונט כדי pH נייטרלי של 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>פתרונות עבור ויטריפיקציה<ol>
<li>להכין פתרון Equilibration (ES): להכין 2 מ"ל של ES על ידי ערבוב 121.5 µL של מתנול (MeOH; 1.5 M), 220 µL של פרופילן גליקול (פ"ג; 1.5 M), 200 µL של FBS (10%), 200 µL של טרהלוז מניות פתרון (0.1 M), 50 µL של HEPES מניות פתרון (25 מ מ) ו- µL 1208.5 של L-15 לתוך 2 mL שפופרת.</li>
		<li>להכין ויטריפיקציה פתרון (לעומת): להכין 2 מ ל VS על ידי ערבוב µL 439 של PG (3 מ'), µL 426 של דימתיל סולפוקסיד (לי2; 3 מ'), 200 µL של FBS (10%), 200 µL של פתרון מניות טרהלוז (0.1 M), 50 µL של HEPES במניה פתרון (25 מ מ) ו- 685 µL של L-15 לתוך צינור 2 מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>פתרונות חימום<ol>
<li>להכין פתרון חימום 1 (WS1): להכין 1.5 מ של WS1 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב µL 150 של FBS (10%), 450 µL של פתרון מניות סוכרוז (3 מ'), 900 µL של L-15.</li>
		<li>להכין פתרון חימום 2 (WS2): להכין 1.5 מ של WS2 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב µL 150 של FBS (10%), 150 µL של סוכרוז מניות פתרון (1 מ') ו- 1200 µL של L-15.</li>
		<li>להכין פתרון התחממות כדור הארץ 3 (WS3): להכין 1.5 מ של WS2 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב 150 µL FBS (10%) ו- 1350 µL של L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין פתרון עיכול: עבור כל דגימה להכין µL 500 של הפתרון לעיכול על ידי ערבוב 50 µL של collagenase מניות פתרון (2 מ"ג/מ"ל), 50 µL של פתרון מניות טריפסין (1.5 mg/mL), µL 10 של DNase (20 µg/mL) ואני µL 390 של L-15 ב mL 2 צינור.</li>
	<li>להשיג כלי חיתוך: מספריים, microscissors, פינצטה, פינצטה מעוקל, דיקור מחטים.</li>
</ol>2. האשכים אוסף
<ol><li>המתת חסד הדג על-ידי הצבתו לתוך תבשיל המכיל 200 mg/L MS-222 (ה-pH = 7). לפני שתמשיך עם הקרע, ודא כי הגג יש הפסיק לזוז, זה לפחות 10 דקות חלפו מאז הרגע כדי להבטיח מוות על-ידי היפוקסיה.</li>
	<li>יבש את הדג על ידי לכם בערגה על מגבת נייר ומניחים אותו על צדו הגבי על מזרון ויבתר.<ol>
<li>קודם כל לחתוך את הסנפירים האגן, החזה עבור ניתוח קל יותר.</li>
		<li>אופקית לגזור את העור על בטנו של הדג בין במינימום וחותכים את העור והשרירים הבסיסית לאורך הבטן עד הפרק אנאלי.</li>
		<li>פתח לתוך חלל הגוף של הדג, להצמיד לקיר הגוף ימינה ושמאלה על המזרן הקרע עם מחטים. הערה: האשכים נמצאים מעל אברי מערכת העיכול משני הצדדים של שחייה שלפוחית השתן (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי למנוע זיהום, לא להוציא את האיברים במערכת העיכול, אבל בעדינות לדחוף אותם לצד אחד ולהסיר בזרמה מן הצד היריב. האשכים מחוברים לקיר הגוף אז להסיר אותם בקפידה, קיצוץ של הצפק חיבור microscissors.</li>
	<li>בנוסף, על מנת למנוע זיהום, ראשית לעקר את האשכים על ידי לשים אותם 70% אתנול עבור s 2, ולאחר מכן מקם אותם בתוך L-15 על צלחת 96-ובכן על קרח. הערה: אם זה הכרחי, נקי האשכים של רקמות שומן וגדולים דם כלי בדיוק מתחת stereomicroscope</li>
</ol>3. אולטרה צינון מהיר של רקמת האשכים
<ol><li>מארק מחטים עם תוויות המתאים בהתאם הדגימה הקלד ולהכין את equilibration (ES) והפתרונות ויטריפיקציה (לעומת).</li>
	<li>העבר את האשכים צלחת גדולה יותר טוב או תבשיל, הסיכה שלושה האשכים (או יותר בהתאם לגודל של המחט) על מחט אקופונקטורה סטרילי.<ol>
<li>ראשית הצב בזרמה על פינצטה מעוקל. מקם את נקודת של המחט באמצע בזרמה, משוך בזהירות בזרמה כלפי מעלה עם הפינצטה.</li>
		<li>לאחר ניקב בזרמה, משוך אותו בעדינות כלפי מעלה לכיוון החלק העליון של המחט. ודא האשכים מופרדים אחד מהשני, כי הם לא ליפול או מחליק במורד.</li>
		<li>המקום מלא המחטים עם האשכים מוצמדים צינור 2 מ"ל עם L-15 עד ויטריפיקציה (ב 25 הלעפה תרוטרפמט; אחסון זמן לא יעלה על 1 h). הערה: הצמדה האשכים המחט צריך להיעשות במהירות כדי למנוע את האשכים ממנו להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את המחט עם האשכים אל הפתרון equilibration, תקופת דגירה של 5 דקות ב- 25˚C.</li>
	<li>להעביר את המחט לתוך הפתרון ויטריפיקציה ואת תקופת דגירה של 30 s ב 25˚C.</li>
	<li>הסר את המחט מהפתרון ויטריפיקציה, במהירות ובעדינות סופגים את הפתרון הנותרים של הרקמה על ידי מגבת נייר סטרילי. . בזהירות כדי למנוע את האשכים נדבקות מגבת הנייר או ליפול.</li>
	<li>במהירות למקם את המחט לתוך חנקן נוזלי ממוקמים בתוך קופסת קלקר. הערה: לבצע שלב זה במהירות כדי למנוע חשיפה של רקמות לאדים חנקן נוזלי. השתמש כמויות נמוכות של חנקן נוזלי למניעת זיהום צולב של דגימות.</li>
	<li>שמור את המחט חנקן נוזלי בתוך קופסת קלקר סגורה למשך 5-10 דקות.</li>
	<li>Precool של cryotube מ ל 4.5 שנפתחו והכובע שלו באותה תיבת.</li>
	<li>לאחר 5-10 דקות, להעביר כל המחט לתוך cryotube נפרדים מתחת לפני השטח של חנקן נוזלי וסגור את cryotube. התראה: השתמש תמיד ביגוד מגן (כגון כפפות מבודדות) כאשר עובד עם חנקן נוזלי, כמו חשיפה יכולה להוביל כווית קור חמורה.</li>
	<li>מניחים את cryotube על מקל מתכת ומניחים אותו בתוך המיכל cryobank מהר ככל האפשר. לאחסן את הדגימות לאחסון מיכל דיואר עד שימוש נוסף.</li>
</ol>4. תהליך התחממות כדור הארץ
<ol><li>חמים כל המחט בנפרד. כל הפתרונות התחממות כדור הארץ צריך להיות ב 25 º C.</li>
	<li>לנתק את cryotube של המקל מתכת, טיבלו זה חנקן נוזלי המאוחסנים בתוך קופסת קלקר.</li>
	<li>לפתוח את cryotube האדים חנקן נוזלי (באמצעות מלקחיים) ולשחרר את המחט לתוך החנקן הנוזלי.</li>
	<li>להעביר את המחט מהר מאוד לתוך הפתרון התחממות כדור הארץ הראשונה, תקופת דגירה של 1 דקה (25 ° C). הקפד להעביר את המחט במהירות כדי למנוע את ההתחממות באוויר במהלך העברת.</li>
	<li>להעביר את המחט לתוך הפתרון ההתחממות השניה, תקופת דגירה של 3 דקה (25 ° C).</li>
	<li>להעביר את המחט לתוך הפתרון התחממות כדור הארץ השלישי, תקופת דגירה של 5 דקות (ב- 25 ° C).</li>
	<li>שחרר את האשכים מן המחט על-ידי הזזה אותם כלפי מטה עם פינצטה מעוקל. המקום לכל testis ומחוממת בנפרד לבאר נפרד (96-ובכן צלחת) מלא עם 250 µL של L-15 בתוספת 10% FBS. ודא כי הבארות מסומנות על פי המדגם. לקחת את הצלחת היטב על הקרח עד כל דוגמאות מחוממות, ועד עבודה נוספת.</li>
</ol>5. רקמות עיכול
<ol><li>היכונו µL 500 של הפתרון דיסוציאציה כל דגימה נפרדת mL 2 צינורות. תווית הצינורות על פי הקוד של המדגם. דגירה הפתרון דיסוציאציה מוכן עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בוזקים את הרקמה ומחוממת הפתרון עיכול, לחתוך אותו לחתיכות קטנות על ידי לפחות 30 תנועות מספריים קטנים.</li>
	<li>דגירה הרקמה שנגזרו על צלחת חזק במשך 90 דקות ב 25 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	<li>להפסיק את תהליך העיכול על-ידי הוספת 400 µL של µL L-15 ו- 100 של FBS (10% FBS וי/v). בקצרה לנער את הפתרון, תקופת דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לסנן את הפתרון שהושג דרך 50 מיקרומטר מסננים לתוך צינור 1.5 מ. תווית הצינורות בהתאם.</li>
	<li>Centrifuge הפתרון המסוננות ב 200 g × 10 דקות ב 25 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	<li>בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 20 µL של L15 בתוספת 10% FBS. יש לנער את הצינור באופן ידני עד התפרקה לחלוטין בגדר. לשמור התליה תא על קרח או הלעפה תרוטרפמט 4 עד להמשך השימוש.</li>
</ol>6. הכדאיות הערכה וספירת תא
<ol><li>µL מיקס 5 של הבולם תא, µL 5 של 0.4% פתרון trypan blue בצינור PCR mL 0.2 שכותרתו כראוי. אם אמצעי אחסון שונים משמשים, ודא כי היחס דילול שרידי 1:1.</li>
	<li>דגירה ההשעייה 1 עד 3 דקות בטמפרטורת החדר (25 ° C).</li>
	<li>בדוק את הכדאיות של כל מדגם hemocytometer מתחת למיקרוסקופ.</li>
	<li>לספור את מספר תאים חיים (מוכתם על ידי trypan blue) בשדות 15. לחשב את המספר הכולל של תאים ב- 20 מיקרומטר של התליה תא. ההשעיה מוכן כעת עבור כל יישום במורד הזרם. הערה: כאשר ייעול ההליך עבור מינים אחרים עם גודל הגוף גדול יותר, השתמש testis שברי משקל שווה. השתמש האשכים מאדם אחד עבור כל קבוצות ניסוי על מנת להימנע השתנות בודדים בתוצאות. במקרה של דג זברה, ניצלנו את העובדה כי שמאלה, testis נכון צריך להכיל מספר זהה (או דומה) בתאי הנבט13 (ראה את התוצאות נציג). בזרמה שמאל נשמר כפקד בזמן בזרמה נכון היה vitrified/מחמם. הכדאיות אחוז מחושב מספר התאים מבודד בזרמה vitrified/חימם לעומת מספר התאים מבודד בזרמה טריים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

המטרה העיקרית של מחקר זה היתה להתאים את המחט שקוע אולטרה מהירה הליך קירור שפותח עבור מינים העופות בתרבית של10,11,12 הקפאה קריוגנית של דגים testis (דג זברה כמודל האורגניזם). רוב המחקרים הקודמים לגבי הקפאה קריוגנית של משאבים גנטי דג זברה התמקדו בע...

הרומן מגמות מדעים וביוטכנולוגיה הובילו ליצירתו של אלפי שורות מוטציה חדשה של עכברים, דרוזופילה, דג זברה, מינים אחרים משמשים והאורגניזמים מודל ביורפואי ו- מדעים אחרים1. יתר על כן, כפי טכנולוגיות חדשות שפותחו ולהיות זמין, מספרי הקווים המוטנטים להגדיל בהתמדה2. זה מוביל הצורך אחסון בטוח של משאבים גנטי מעבר השיטות הנפוצות אצל לשמור. על גידול במושבות. כמו שיטה המאפשרת אחסון בטוח של משאבים גנטי לתקופה לא מוגבלת של זמן, הקפאה קריוגנית מציע יתרונות רבים כגון הארכת עונת הרבייה, עוקף את הצורך תחזוקה רציפה של broodstock, זה יותר עלות - ו עבודה יעיל2.
פרוטוקולים עבור זרע הקפאה קריוגנית פיתחה במהלך בעבר מספר שנים2,3,4 מציעים את ההזדמנות לאחסון מוצלחת של חומר גנטי זכר דג זברה. עם זאת, הקפאה קריוגנית של ביציות או עוברים בדגים אינו אפשרי עדיין בשל המבנה המורכב שלהם ואת כמויות גדולות של חומר חלמון. לאחרונה, המנהג של השתלת בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) או בתאי גזע spermatogonial (SSCs) מציע ניתוח מעקפים כדי מחסום זה מתפתח זרע פונקציונלי וביצים לאחר השתלת5. לכן, הקפאה קריוגנית של SSCs מציע אפיק חדש בתחום שימור משאבים גנטי נדיר ורב ערך.
אף-על-פי הקפאה קריוגנית מציע יתרונות רבים, תהליך ההקפאה של קצב איטי מייצר מספר תנאים שעלולות להוביל לנזק תא2. אלה כוללים היווצרות קרח תאיים חוץ-תאית, התייבשות, רעילות cryoprotectant ואחרים. קרח תאיים גורם נזק לתאים, קרח חוץ-תאית עשויה להוביל ריסוק מכני של תאים, תוך פיזור מים מתאי במהלך קצב איטי קפוא עלול להוביל להתייבשות6. לאחרונה הוחל ויטריפיקציה כמו שיטה אשר מונע את ההשפעות השליליות של היווצרות קרח ב הקפאה קריוגנית של דגים גמטות7,8,9. הוא מציג שיטת הקירור אולטרה מהירה שדרכו התקשורת פנימיים וחיצוניים להפוך מצב אמורפי מזוגגות ללא crystalizing לתוך קרח7,10. ויטריפיקציה מוצלחת של רקמת האשכים ואת השחלות העגום מינים העופות בתרבית של10,11,12, ובכך לפתוח אפשרויות היישום שלה בדגים, כמו גם.
במחקר זה, אנו מציגים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) נוהל הקפאה קריוגנית של כל דג זברה האשכים. נדגים שיטה אמינה עבור בידודו של דג זברה בשלב מוקדם בתאי הנבט ללא זיהום, תהליך הקפאה קריוגנית המניבה כמות גבוהה יחסית בתאי הנבט בשלב מוקדם עם נוכחות נמוכה של תאים אחרים, במיוחד spermatozoa. לפי מיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון להדגים פרוטוקול מטמיעים מפורט לקירור אולטרה מהירה של רקמת האשכים דגים דג זברה germline תאים. בנוסף, הדיר של השיטה הוא הפגינו חמישה זנים שונים דג זברה: AB פראי סוג, קספר (רוי- / -; נאקרה- / -), נמר (ליאוt1/t1), "ואסה" [Tg (vas::eGFP)] וקו Wilms הגידול [Tg (wt1b::eGFP 1)] מהונדס.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="948">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">Leibovitz media (L-15)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">L1518</td>
			<td style="width:296px;">Supplemented with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:232px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">F9665</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:232px;">HEPES</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">H3375</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Sucrose</td>
			<td style="width:220px;">Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trehalose</td>
			<td style="width:220px;">Acros Organics</td>
			<td>99-20-7</td>
			<td style="width:296px;">Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Methanol</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">20740-0-08-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Propylene glycol</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">08860-1-08-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">00190-1-01-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Collagenase</td>
			<td style="width:220px;">Gibco</td>
			<td style="width:200px;">9001-12-1</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trypsin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T8003</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">DNase I</td>
			<td style="width:220px;">Panreac AppliChem</td>
			<td style="width:200px;">A3778</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T6146</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

המגמות הנוכחיות מדעים וביוטכנולוגיה להוביל יצירה של אלפי קווים חדשים דגם אורגניזמים ובכך מובילים והצורך שיטות חדשות עבור אחסון בטוח של משאבים גנטי מעבר השיטות הנפוצות אצל לשמור. על גידול במושבות. המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. הקפאה קריוגנית תאי נבט בשלב מוקדם על ידי האשכים כל ניב מציע אפשרויות האחסון של דג זברה משאבים גנטי, במיוחד לאחר ההשתלה יכולה פירעונם לתוך גמטות גם זכר וגם נקבה. האשכים היו טוחנות, על מחט אקופונקטורה, equilibrated בתקשורת cryoprotective שני (equilibration לאודנום מתנול 1.5 M ו- 1.5 M פרופילן גליקול; ופתרון ויטריפיקציה המכילה 3 מ' דימתיל סולפוקסיד ו 3 מ' פרופילן גליקול) צלל לתוך חנקן נוזלי. הדגימות היו חימם בסדרה של שלושה פתרונות חימום הסוגר. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם (1) חוסר spermatozoa לאחר העיכול של האשכים ומחוממת למוצא מניפולציות במורד הזרם; (2) אולטרה מהירה קירור המאפשרים את החשיפה האופטימלית של רקמות לחנקן נוזלי ולכן למקסם את הקירור ואת הקטנת הריכוז הנדרש של cryoprotectants, ובכך מקצר את הרעילות שלהם; (3) סינכרונית חשיפת האשכים מספר cryoprotectants, חנקן נוזלי; והפגינו הדיר (4) על-ידי רכישת יכולת הקיום של מעל 50% ב- 5 זנים שונים דג זברה.

בממוצע, המספר בתאי הנבט בשלב מוקדם מבודד מבחן יחיד דג זברה טריים מגוונות בין תאים 40,000 ו- 200,000 בהתאם לגודל הדג. כאשר מעכל האשכים דג זברה טריים בכל 5 זנים, בתאי הנבט המוקדמות היו לא התאים רק נוכח המתלים תא (איור 2). ליד תאי נבט בשלב מוקדם, spermatozoa רבים נמצאו גם כן. מ...

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling at JoVE.com

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. בנוסף, נבדקה את הדיר של שיטת חמישה זנים שונים דג זברה.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Views.  Szent István University. המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. בנוסף, נבדקה את הדיר של שיטת חמישה זנים שונים דג זברה.

Video: Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

ביצוע דיפלואידי דג הזברה Gynogenetic על ידי לחץ מוקדמת

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...