Name: cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי הלאומית למחקר, פיתוח חדשנות Office הונגריה (גרנט 116912 כדי ÁH), המשרד עלות (מזון, חקלאות עלות פעולה FA1205: AQUAGAMETE), התכנית מלגת Hungaricum Stipendium (מענק ZM) והמעבד החדש ההונגרית הלאומית Predoctoral הצטיינות (מענק EK).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי לחוק לרווחת בעלי חיים הונגרי.
1. מגיב הכנה
<ol><li>פתרונות מניות<ol>
<li>להכין טרהלוז 1 מ' על-ידי הוספת 0.378 גר' טרהלוז וגופרית והרכבו לתוך 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>להכין סוכרוז 1 מ' על-ידי הוספת 0.342 גר' סוכרוז לתוך 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>להכין 1 מ' HEPES על-ידי הוספת 0.238 גר' HEPES 1 מ"ל של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>להכין collagenase 20 מ"ג/מ"ל (U 290/mg) על-ידי הוספת 100 מ ג מ ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.</li>
		<li>להכין טריפסין 15 מ"ג/מ"ל (~ 10000 U/mg) על-ידי הוספת 75 מ"ג עד 5 מ"ל ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.</li>
		<li>להכין 1 מ"ג/מ"ל DNase אני (~ 3000 U/mg) על-ידי הוספת 5 מ"ג עד 5 מ"ל ל- PBS. מערבבים היטב עד הוא מתמוסס. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. Aliquot 50 µL לתוך 0.2 מ ל PCR צינורות ומקפיאים ב- 20 º C.</li>
		<li>להכין 0.4% trypan blue על-ידי הוספת 40 מ"ג trypan blue 10 מ"ל ל- PBS. מסנן סטרילי דרך 0.2 µm מסננים. 1 מ"ל aliquot לתוך צינורות 1.5 mL.</li>
		<li>להכין 200 mg/L MS-222 (Tricaine מתאן סולפונאט) על-ידי הוספת 200 מ ג של MS-222 לתוך 1 ליטר של dH2O. לערבב היטב עד הוא מתמוסס לחלוטין. בנוסף, MS-222 בופר עם סודיום ביקרבונט כדי pH נייטרלי של 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>פתרונות עבור ויטריפיקציה<ol>
<li>להכין פתרון Equilibration (ES): להכין 2 מ"ל של ES על ידי ערבוב 121.5 µL של מתנול (MeOH; 1.5 M), 220 µL של פרופילן גליקול (פ"ג; 1.5 M), 200 µL של FBS (10%), 200 µL של טרהלוז מניות פתרון (0.1 M), 50 µL של HEPES מניות פתרון (25 מ מ) ו- µL 1208.5 של L-15 לתוך 2 mL שפופרת.</li>
		<li>להכין ויטריפיקציה פתרון (לעומת): להכין 2 מ ל VS על ידי ערבוב µL 439 של PG (3 מ'), µL 426 של דימתיל סולפוקסיד (לי2; 3 מ'), 200 µL של FBS (10%), 200 µL של פתרון מניות טרהלוז (0.1 M), 50 µL של HEPES במניה פתרון (25 מ מ) ו- 685 µL של L-15 לתוך צינור 2 מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>פתרונות חימום<ol>
<li>להכין פתרון חימום 1 (WS1): להכין 1.5 מ של WS1 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב µL 150 של FBS (10%), 450 µL של פתרון מניות סוכרוז (3 מ'), 900 µL של L-15.</li>
		<li>להכין פתרון חימום 2 (WS2): להכין 1.5 מ של WS2 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב µL 150 של FBS (10%), 150 µL של סוכרוז מניות פתרון (1 מ') ו- 1200 µL של L-15.</li>
		<li>להכין פתרון התחממות כדור הארץ 3 (WS3): להכין 1.5 מ של WS2 בשפופרת 2 mL על ידי ערבוב 150 µL FBS (10%) ו- 1350 µL של L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין פתרון עיכול: עבור כל דגימה להכין µL 500 של הפתרון לעיכול על ידי ערבוב 50 µL של collagenase מניות פתרון (2 מ"ג/מ"ל), 50 µL של פתרון מניות טריפסין (1.5 mg/mL), µL 10 של DNase (20 µg/mL) ואני µL 390 של L-15 ב mL 2 צינור.</li>
	<li>להשיג כלי חיתוך: מספריים, microscissors, פינצטה, פינצטה מעוקל, דיקור מחטים.</li>
</ol>2. האשכים אוסף
<ol><li>המתת חסד הדג על-ידי הצבתו לתוך תבשיל המכיל 200 mg/L MS-222 (ה-pH = 7). לפני שתמשיך עם הקרע, ודא כי הגג יש הפסיק לזוז, זה לפחות 10 דקות חלפו מאז הרגע כדי להבטיח מוות על-ידי היפוקסיה.</li>
	<li>יבש את הדג על ידי לכם בערגה על מגבת נייר ומניחים אותו על צדו הגבי על מזרון ויבתר.<ol>
<li>קודם כל לחתוך את הסנפירים האגן, החזה עבור ניתוח קל יותר.</li>
		<li>אופקית לגזור את העור על בטנו של הדג בין במינימום וחותכים את העור והשרירים הבסיסית לאורך הבטן עד הפרק אנאלי.</li>
		<li>פתח לתוך חלל הגוף של הדג, להצמיד לקיר הגוף ימינה ושמאלה על המזרן הקרע עם מחטים. הערה: האשכים נמצאים מעל אברי מערכת העיכול משני הצדדים של שחייה שלפוחית השתן (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי למנוע זיהום, לא להוציא את האיברים במערכת העיכול, אבל בעדינות לדחוף אותם לצד אחד ולהסיר בזרמה מן הצד היריב. האשכים מחוברים לקיר הגוף אז להסיר אותם בקפידה, קיצוץ של הצפק חיבור microscissors.</li>
	<li>בנוסף, על מנת למנוע זיהום, ראשית לעקר את האשכים על ידי לשים אותם 70% אתנול עבור s 2, ולאחר מכן מקם אותם בתוך L-15 על צלחת 96-ובכן על קרח. הערה: אם זה הכרחי, נקי האשכים של רקמות שומן וגדולים דם כלי בדיוק מתחת stereomicroscope</li>
</ol>3. אולטרה צינון מהיר של רקמת האשכים
<ol><li>מארק מחטים עם תוויות המתאים בהתאם הדגימה הקלד ולהכין את equilibration (ES) והפתרונות ויטריפיקציה (לעומת).</li>
	<li>העבר את האשכים צלחת גדולה יותר טוב או תבשיל, הסיכה שלושה האשכים (או יותר בהתאם לגודל של המחט) על מחט אקופונקטורה סטרילי.<ol>
<li>ראשית הצב בזרמה על פינצטה מעוקל. מקם את נקודת של המחט באמצע בזרמה, משוך בזהירות בזרמה כלפי מעלה עם הפינצטה.</li>
		<li>לאחר ניקב בזרמה, משוך אותו בעדינות כלפי מעלה לכיוון החלק העליון של המחט. ודא האשכים מופרדים אחד מהשני, כי הם לא ליפול או מחליק במורד.</li>
		<li>המקום מלא המחטים עם האשכים מוצמדים צינור 2 מ"ל עם L-15 עד ויטריפיקציה (ב 25 הלעפה תרוטרפמט; אחסון זמן לא יעלה על 1 h). הערה: הצמדה האשכים המחט צריך להיעשות במהירות כדי למנוע את האשכים ממנו להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את המחט עם האשכים אל הפתרון equilibration, תקופת דגירה של 5 דקות ב- 25˚C.</li>
	<li>להעביר את המחט לתוך הפתרון ויטריפיקציה ואת תקופת דגירה של 30 s ב 25˚C.</li>
	<li>הסר את המחט מהפתרון ויטריפיקציה, במהירות ובעדינות סופגים את הפתרון הנותרים של הרקמה על ידי מגבת נייר סטרילי. . בזהירות כדי למנוע את האשכים נדבקות מגבת הנייר או ליפול.</li>
	<li>במהירות למקם את המחט לתוך חנקן נוזלי ממוקמים בתוך קופסת קלקר. הערה: לבצע שלב זה במהירות כדי למנוע חשיפה של רקמות לאדים חנקן נוזלי. השתמש כמויות נמוכות של חנקן נוזלי למניעת זיהום צולב של דגימות.</li>
	<li>שמור את המחט חנקן נוזלי בתוך קופסת קלקר סגורה למשך 5-10 דקות.</li>
	<li>Precool של cryotube מ ל 4.5 שנפתחו והכובע שלו באותה תיבת.</li>
	<li>לאחר 5-10 דקות, להעביר כל המחט לתוך cryotube נפרדים מתחת לפני השטח של חנקן נוזלי וסגור את cryotube. התראה: השתמש תמיד ביגוד מגן (כגון כפפות מבודדות) כאשר עובד עם חנקן נוזלי, כמו חשיפה יכולה להוביל כווית קור חמורה.</li>
	<li>מניחים את cryotube על מקל מתכת ומניחים אותו בתוך המיכל cryobank מהר ככל האפשר. לאחסן את הדגימות לאחסון מיכל דיואר עד שימוש נוסף.</li>
</ol>4. תהליך התחממות כדור הארץ
<ol><li>חמים כל המחט בנפרד. כל הפתרונות התחממות כדור הארץ צריך להיות ב 25 º C.</li>
	<li>לנתק את cryotube של המקל מתכת, טיבלו זה חנקן נוזלי המאוחסנים בתוך קופסת קלקר.</li>
	<li>לפתוח את cryotube האדים חנקן נוזלי (באמצעות מלקחיים) ולשחרר את המחט לתוך החנקן הנוזלי.</li>
	<li>להעביר את המחט מהר מאוד לתוך הפתרון התחממות כדור הארץ הראשונה, תקופת דגירה של 1 דקה (25 ° C). הקפד להעביר את המחט במהירות כדי למנוע את ההתחממות באוויר במהלך העברת.</li>
	<li>להעביר את המחט לתוך הפתרון ההתחממות השניה, תקופת דגירה של 3 דקה (25 ° C).</li>
	<li>להעביר את המחט לתוך הפתרון התחממות כדור הארץ השלישי, תקופת דגירה של 5 דקות (ב- 25 ° C).</li>
	<li>שחרר את האשכים מן המחט על-ידי הזזה אותם כלפי מטה עם פינצטה מעוקל. המקום לכל testis ומחוממת בנפרד לבאר נפרד (96-ובכן צלחת) מלא עם 250 µL של L-15 בתוספת 10% FBS. ודא כי הבארות מסומנות על פי המדגם. לקחת את הצלחת היטב על הקרח עד כל דוגמאות מחוממות, ועד עבודה נוספת.</li>
</ol>5. רקמות עיכול
<ol><li>היכונו µL 500 של הפתרון דיסוציאציה כל דגימה נפרדת mL 2 צינורות. תווית הצינורות על פי הקוד של המדגם. דגירה הפתרון דיסוציאציה מוכן עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בוזקים את הרקמה ומחוממת הפתרון עיכול, לחתוך אותו לחתיכות קטנות על ידי לפחות 30 תנועות מספריים קטנים.</li>
	<li>דגירה הרקמה שנגזרו על צלחת חזק במשך 90 דקות ב 25 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	<li>להפסיק את תהליך העיכול על-ידי הוספת 400 µL של µL L-15 ו- 100 של FBS (10% FBS וי/v). בקצרה לנער את הפתרון, תקופת דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לסנן את הפתרון שהושג דרך 50 מיקרומטר מסננים לתוך צינור 1.5 מ. תווית הצינורות בהתאם.</li>
	<li>Centrifuge הפתרון המסוננות ב 200 g × 10 דקות ב 25 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	<li>בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 20 µL של L15 בתוספת 10% FBS. יש לנער את הצינור באופן ידני עד התפרקה לחלוטין בגדר. לשמור התליה תא על קרח או הלעפה תרוטרפמט 4 עד להמשך השימוש.</li>
</ol>6. הכדאיות הערכה וספירת תא
<ol><li>µL מיקס 5 של הבולם תא, µL 5 של 0.4% פתרון trypan blue בצינור PCR mL 0.2 שכותרתו כראוי. אם אמצעי אחסון שונים משמשים, ודא כי היחס דילול שרידי 1:1.</li>
	<li>דגירה ההשעייה 1 עד 3 דקות בטמפרטורת החדר (25 ° C).</li>
	<li>בדוק את הכדאיות של כל מדגם hemocytometer מתחת למיקרוסקופ.</li>
	<li>לספור את מספר תאים חיים (מוכתם על ידי trypan blue) בשדות 15. לחשב את המספר הכולל של תאים ב- 20 מיקרומטר של התליה תא. ההשעיה מוכן כעת עבור כל יישום במורד הזרם. הערה: כאשר ייעול ההליך עבור מינים אחרים עם גודל הגוף גדול יותר, השתמש testis שברי משקל שווה. השתמש האשכים מאדם אחד עבור כל קבוצות ניסוי על מנת להימנע השתנות בודדים בתוצאות. במקרה של דג זברה, ניצלנו את העובדה כי שמאלה, testis נכון צריך להכיל מספר זהה (או דומה) בתאי הנבט13 (ראה את התוצאות נציג). בזרמה שמאל נשמר כפקד בזמן בזרמה נכון היה vitrified/מחמם. הכדאיות אחוז מחושב מספר התאים מבודד בזרמה vitrified/חימם לעומת מספר התאים מבודד בזרמה טריים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

המטרה העיקרית של מחקר זה היתה להתאים את המחט שקוע אולטרה מהירה הליך קירור שפותח עבור מינים העופות בתרבית של10,11,12 הקפאה קריוגנית של דגים testis (דג זברה כמודל האורגניזם). רוב המחקרים הקודמים לגבי הקפאה קריוגנית של משאבים גנטי דג זברה התמקדו בע...

הרומן מגמות מדעים וביוטכנולוגיה הובילו ליצירתו של אלפי שורות מוטציה חדשה של עכברים, דרוזופילה, דג זברה, מינים אחרים משמשים והאורגניזמים מודל ביורפואי ו- מדעים אחרים1. יתר על כן, כפי טכנולוגיות חדשות שפותחו ולהיות זמין, מספרי הקווים המוטנטים להגדיל בהתמדה2. זה מוביל הצורך אחסון בטוח של משאבים גנטי מעבר השיטות הנפוצות אצל לשמור. על גידול במושבות. כמו שיטה המאפשרת אחסון בטוח של משאבים גנטי לתקופה לא מוגבלת של זמן, הקפאה קריוגנית מציע יתרונות רבים כגון הארכת עונת הרבייה, עוקף את הצורך תחזוקה רציפה של broodstock, זה יותר עלות - ו עבודה יעיל2.
פרוטוקולים עבור זרע הקפאה קריוגנית פיתחה במהלך בעבר מספר שנים2,3,4 מציעים את ההזדמנות לאחסון מוצלחת של חומר גנטי זכר דג זברה. עם זאת, הקפאה קריוגנית של ביציות או עוברים בדגים אינו אפשרי עדיין בשל המבנה המורכב שלהם ואת כמויות גדולות של חומר חלמון. לאחרונה, המנהג של השתלת בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) או בתאי גזע spermatogonial (SSCs) מציע ניתוח מעקפים כדי מחסום זה מתפתח זרע פונקציונלי וביצים לאחר השתלת5. לכן, הקפאה קריוגנית של SSCs מציע אפיק חדש בתחום שימור משאבים גנטי נדיר ורב ערך.
אף-על-פי הקפאה קריוגנית מציע יתרונות רבים, תהליך ההקפאה של קצב איטי מייצר מספר תנאים שעלולות להוביל לנזק תא2. אלה כוללים היווצרות קרח תאיים חוץ-תאית, התייבשות, רעילות cryoprotectant ואחרים. קרח תאיים גורם נזק לתאים, קרח חוץ-תאית עשויה להוביל ריסוק מכני של תאים, תוך פיזור מים מתאי במהלך קצב איטי קפוא עלול להוביל להתייבשות6. לאחרונה הוחל ויטריפיקציה כמו שיטה אשר מונע את ההשפעות השליליות של היווצרות קרח ב הקפאה קריוגנית של דגים גמטות7,8,9. הוא מציג שיטת הקירור אולטרה מהירה שדרכו התקשורת פנימיים וחיצוניים להפוך מצב אמורפי מזוגגות ללא crystalizing לתוך קרח7,10. ויטריפיקציה מוצלחת של רקמת האשכים ואת השחלות העגום מינים העופות בתרבית של10,11,12, ובכך לפתוח אפשרויות היישום שלה בדגים, כמו גם.
במחקר זה, אנו מציגים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) נוהל הקפאה קריוגנית של כל דג זברה האשכים. נדגים שיטה אמינה עבור בידודו של דג זברה בשלב מוקדם בתאי הנבט ללא זיהום, תהליך הקפאה קריוגנית המניבה כמות גבוהה יחסית בתאי הנבט בשלב מוקדם עם נוכחות נמוכה של תאים אחרים, במיוחד spermatozoa. לפי מיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון להדגים פרוטוקול מטמיעים מפורט לקירור אולטרה מהירה של רקמת האשכים דגים דג זברה germline תאים. בנוסף, הדיר של השיטה הוא הפגינו חמישה זנים שונים דג זברה: AB פראי סוג, קספר (רוי- / -; נאקרה- / -), נמר (ליאוt1/t1), "ואסה" [Tg (vas::eGFP)] וקו Wilms הגידול [Tg (wt1b::eGFP 1)] מהונדס.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplemented with L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td></tr></tbody></table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

המגמות הנוכחיות מדעים וביוטכנולוגיה להוביל יצירה של אלפי קווים חדשים דגם אורגניזמים ובכך מובילים והצורך שיטות חדשות עבור אחסון בטוח של משאבים גנטי מעבר השיטות הנפוצות אצל לשמור. על גידול במושבות. המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. הקפאה קריוגנית תאי נבט בשלב מוקדם על ידי האשכים כל ניב מציע אפשרויות האחסון של דג זברה משאבים גנטי, במיוחד לאחר ההשתלה יכולה פירעונם לתוך גמטות גם זכר וגם נקבה. האשכים היו טוחנות, על מחט אקופונקטורה, equilibrated בתקשורת cryoprotective שני (equilibration לאודנום מתנול 1.5 M ו- 1.5 M פרופילן גליקול; ופתרון ויטריפיקציה המכילה 3 מ' דימתיל סולפוקסיד ו 3 מ' פרופילן גליקול) צלל לתוך חנקן נוזלי. הדגימות היו חימם בסדרה של שלושה פתרונות חימום הסוגר. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם (1) חוסר spermatozoa לאחר העיכול של האשכים ומחוממת למוצא מניפולציות במורד הזרם; (2) אולטרה מהירה קירור המאפשרים את החשיפה האופטימלית של רקמות לחנקן נוזלי ולכן למקסם את הקירור ואת הקטנת הריכוז הנדרש של cryoprotectants, ובכך מקצר את הרעילות שלהם; (3) סינכרונית חשיפת האשכים מספר cryoprotectants, חנקן נוזלי; והפגינו הדיר (4) על-ידי רכישת יכולת הקיום של מעל 50% ב- 5 זנים שונים דג זברה.

בממוצע, המספר בתאי הנבט בשלב מוקדם מבודד מבחן יחיד דג זברה טריים מגוונות בין תאים 40,000 ו- 200,000 בהתאם לגודל הדג. כאשר מעכל האשכים דג זברה טריים בכל 5 זנים, בתאי הנבט המוקדמות היו לא התאים רק נוכח המתלים תא (איור 2). ליד תאי נבט בשלב מוקדם, spermatozoa רבים נמצאו גם כן. מ...

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling at JoVE.com

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. בנוסף, נבדקה את הדיר של שיטת חמישה זנים שונים דג זברה.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Views.  Szent István University. המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. בנוסף, נבדקה את הדיר של שיטת חמישה זנים שונים דג זברה.

Video: Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Developmental Biology

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Genetics

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

ביצוע דיפלואידי דג הזברה Gynogenetic על ידי לחץ מוקדמת

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...