Este estudio fue apoyado por la investigación, desarrollo e innovación oficina de Hungría (grant 116912 a ÁH), la oficina de costos (alimentación y agricultura costo acción FA1205: AQUAGAMETE), el programa de becas beca Hungaricum (ayuda a ZM) y el nuevo Húngaro nacional excelencia Beca Predoctoral (grant EK).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la ley de Bienestar Animal Húngaro.
1. preparación del reactivo
<ol><li>Soluciones madre<ol>
<li>Preparar 1 M trehalosa agregando 0,378 g de trehalosa dihidrato en 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.</li>
		<li>Preparar 1 M sacarosa añadiendo 0,342 g de sacarosa en 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.</li>
		<li>Preparar 1 M HEPES añadiendo 0,238 g de HEPES y 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.</li>
		<li>Preparar la colagenasa (290 U/mg) de 20 mg/mL mediante la adición de 100 mg en 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar tripsina 15 mg/mL (~ 10000 U/mg) mediante la adición de 75 mg para 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar 1 mg/mL DNasa I (~ 3000 U/mg) mediante la adición de 5 mg en 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar tripano 0.4% azul mediante la adición de 40 mg de azul de tripano a 10 mL de PBS. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Alícuota 1 mL en tubos de 1,5 mL.</li>
		<li>Preparar 200 mg/L MS-222 (sulfonato de metano Metanosulfonato) mediante la adición de 200 mg de MS-222 en 1 L de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo. Además, el MS-222 tampón con bicarbonato de sodio a un pH neutro de 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluciones de vitrificación<ol>
<li>Preparar la solución de equilibrado (ES): preparar 2 mL de CE mezclando 121.5 μl de metanol (MeOH; 1,5 M), 220 μl de glicol de propileno (PG; 1,5 M), 200 μL de FBS (10%), 200 μL de solución stock de trehalosa (0,1 M), 50 μl de la solución madre de HEPES (25 mM) y 1208.5 μl de L-15 en un 2 tubo mL.</li>
		<li>Preparar la solución de vitrificación (VS): preparar 2 mL de VS mezclando 439 μl de PG (3 M), 426 μl de dimetilsulfóxido (Me2. 3 M), 200 μL de FBS (10%), 200 μL de solución stock de trehalosa (0,1 M), 50 μl de HEPES stock solución (25 mM) y 685 μl de L-15 en un tubo de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluciones para el calentamiento<ol>
<li>Preparar la solución calentamiento 1 (WS1): preparar 1,5 mL de WS1 en un tubo de 2 mL mediante la mezcla de 150 μL de FBS (10%), 450 μl de solución de sacarosa (3 M) y 900 μl de L-15.</li>
		<li>Preparar la solución calentamiento 2 (WS2): preparar 1,5 mL de WS2 en un tubo de 2 mL mediante la mezcla de 150 μL de FBS (10%), 150 μL de solución de sacarosa (1 M) y 1200 μl de L-15.</li>
		<li>Preparar solución calentamiento 3 (WS3): preparar mezcla 150 μL FBS (10%) 1.5 mL de WS2 en un tubo de 2 mL y μl de 1350 de L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la solución de digestión: para cada muestra preparar 500 μl de la solución de digestión mezclando 50 μl de la solución madre de colagenasa (2 mg/mL), 50 μl de la solución madre de tripsina (1,5 mg/mL), 10 μl de DNasa I (20 μg/mL) y 390 μl de L-15 en 2 mL del tubo.</li>
	<li>Obtener herramientas de disección: tijeras, microscissors, pinzas, pinzas curvas y agujas de acupuntura.</li>
</ol>2. testículos colección
<ol><li>Eutanasia a los peces colocando en un recipiente que contiene 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Antes de continuar con la disección, asegúrese de que las branquias han detenido y por lo menos 10 minutos han pasado desde ese momento para asegurar la muerte por hipoxia.</li>
	<li>El pescado seco acariciando sobre una toalla de papel y colóquela sobre su lado dorsal en una estera de la disección.<ol>
<li>En primer lugar cortar las aletas pélvicas y pectorales para la disección más fácil.</li>
		<li>Horizontal, cortar la piel en el vientre de los peces entre las aletas pectorales y cortar la piel y el músculo subyacente a lo largo del vientre hasta la aleta anal.</li>
		<li>Abra la cavidad del cuerpo de los peces y la clavija de la pared izquierda y derecha del cuerpo a la estera de la disección con agujas. Nota: Los testículos se encuentran por encima de los órganos gastrointestinales en ambos lados de la vejiga natatoria (figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para evitar la contaminación, no sacar los órganos gastrointestinales, pero suavemente empuje hacia un lado y quitar el testículo del lado opuesto. Los testículos están conectados con la pared del cuerpo así que quitarlos con cuidado y cortar el peritoneo de conexión por microscissors.</li>
	<li>Además, con el fin de evitar la contaminación, en primer lugar esterilizar los testículos poniendo en etanol al 70% durante 2 s y entonces lugar ellos en L-15 en una placa de 96 pozos en el hielo. Nota: Si es necesario, limpiamos testículos grandes y del tejido adiposo vasos sanguíneos precisamente bajo el estereomicroscopio</li>
</ol>3. ultra rápido enfriamiento del tejido Testicular
<ol><li>Agujas de marca con etiquetas apropiadas dependiendo de la muestra tipo y preparan las soluciones de vitrificación (VS) y equilibrado (ES).</li>
	<li>Transferir los testículos a una placa bien grande o plato y perno de dos a tres los testículos (o más dependiendo del tamaño de la aguja) en una aguja de acupuntura estériles.<ol>
<li>En primer lugar colocar el testículo en la parte superior curva pinzas. Coloque la punta de la aguja en el centro del testículo y tire cuidadosamente el testículo hacia arriba con las pinzas.</li>
		<li>Después de pinchar los testículos, con cuidado tirar hacia arriba hacia la parte superior de la aguja. Asegúrese de que los testículos están separados unos de otros y que no son caerse o deslizarse.</li>
		<li>Lugar las agujas con testículos anclados en un tubo de 2 mL con L-15 hasta vitrificación (a 25 ° c; tiempo de almacenamiento no debe exceder 1 h). Nota: La fijación de los testículos en la aguja debe hacerse rápidamente para impedir que los testículos se sequen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir la aguja con los testículos en la solución de equilibrado e incubar durante 5 min a 25 °.</li>
	<li>La aguja de transferencia en la solución de vitrificación e incube durante 30 s a 25 °.</li>
	<li>Retire la aguja de la solución de vitrificación, suavemente y rápidamente absorben el resto de la solución en el tejido por una toalla de papel estéril. Tenga cuidado para evitar los testículos pegarse a la toalla de papel o caerse.</li>
	<li>Rápidamente Coloque la aguja en nitrógeno líquido colocada en una caja de espuma de poliestireno. Nota: Hacer este paso rápidamente para evitar la exposición del tejido a los vapores de nitrógeno líquido. Utilizar volúmenes bajos de nitrógeno líquido para evitar la contaminación cruzada de las muestras.</li>
	<li>Mantener la aguja en nitrógeno líquido en una caja cerrada de la espuma de poliestireno de 5-10 minutos.</li>
	<li>Preenfriar un criotubo abierto 4,5 mL y su tapa en la misma caja.</li>
	<li>Después de 5-10 min, transferir cada aguja en un criotubo separado debajo de la superficie de nitrógeno líquido y cerrar el criotubo. PRECAUCIÓN: Siempre use ropa protectora (tales como guantes aislados) cuando trabajo con nitrógeno líquido como exposición puede llevar a congelación severa.</li>
	<li>Coloque el criotubo en un bastón de metal y coloque en el recipiente de cryobank tan rápido como sea posible. Almacenar las muestras en un almacenamiento de información de vaso dewar hasta su uso posterior.</li>
</ol>4. procedimiento de calentamiento
<ol><li>Caliente cada aguja por separado. Todas las soluciones de calentamiento deben ser a 25 ° C.</li>
	<li>Separar el criotubo de la caña de metal y sumergirse en nitrógeno líquido, almacenado en una caja de espuma de poliestireno.</li>
	<li>Abrir el criotubo en el vapor del nitrógeno líquido (con pinzas) y suelte la aguja en el nitrógeno líquido.</li>
	<li>Transferir la aguja muy rápido en la primera solución calentamiento e incubar durante 1 min (a 25 ° C). Asegúrese de transferir la aguja rápidamente para evitar su calentamiento en el aire durante la transferencia.</li>
	<li>Transferencia de la aguja en la segunda solución calentamiento e incubar durante 3 minutos (a 25 ° C).</li>
	<li>Transferencia de la aguja en la tercera solución calentamiento e incubar durante 5 minutos (a 25 ° C).</li>
	<li>Liberar los testículos de la aguja deslizándolo hacia abajo con una pinza curva. Lugar cada testículo calentado individualmente en un pozo independiente (placa de 96 pocillos) con 250 μl de L-15 suplementado con 10% FBS. Asegúrese de que los pozos están etiquetados según la muestra. Mantenga la placa bien en el hielo hasta que todas las muestras se calientan y hasta más trabajo.</li>
</ol>5. tejido digestión
<ol><li>Preparar 500 μl de la solución de disociación para cada muestra en tubos separados 2 mL. Etiquetar los tubos de acuerdo con el código de la muestra. Incubar la solución preparada de disociación por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir el tejido calentado en la solución de digestión y cortar en trozos pequeños por lo menos 30 movimientos de tijeras pequeñas.</li>
	<li>Incubar el tejido cortado en una placa de agitación durante 90 minutos a 25 ° c.</li>
	<li>Detener el proceso de digestión mediante la adición de 400 μL de L-15 y 100 μl de FBS (SFB 10% v/v). Brevemente agitar la solución e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Filtrar la solución obtenida a través de 50 filtros del μm en un tubo de 1,5 mL. Etiquetar los tubos por consiguiente.</li>
	<li>Centrifugue la solución filtrada a 200 x g durante 10 min a 25 ° c.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 20 μl de L15 suplementado con 10% FBS. Agitar manualmente el tubo hasta que el precipitado se haya disuelto completamente. Mantener la suspensión de células en hielo o a 4 ° c hasta su uso posterior.</li>
</ol>6. viabilidad evaluación y recuento celular
<ol><li>Mezcla 5 μl de suspensión celular y 5 μl de solución de azul de tripano 0.4% en un tubo PCR de 0.2 mL debidamente etiquetado. Si se utilizan volúmenes diferentes, asegúrese de que la relación de dilución de 1:1 restos.</li>
	<li>Incubar la suspensión de 1 a 3 min a temperatura ambiente (25 ° C).</li>
	<li>Comprobar la viabilidad de cada muestra en un hemocitómetro bajo el microscopio.</li>
	<li>Contar el número de células vivas (sin mancha de azul tripán) en 15 campos. Calcular el número total de células de 20 μm de la suspensión de células. La suspensión está lista para cualquier aplicación posterior. Nota: Cuando optimizar el procedimiento para otras especies con tamaño de cuerpo más grande, utilizar fragmentos de testículos de igual peso. Utilice los testículos de un individuo para todos los grupos experimentales con el fin de evitar la variabilidad individual en los resultados. En el caso del pez cebra, aprovechamos el hecho de que izquierda y testículo derecho debe contener un número igual (o muy similar) de las células germinales13 (véase los resultados de representante). El testículo izquierdo se mantuvo como un control, mientras que el testículo derecho era vitrificados/calentados. Porcentaje de viabilidad se calculó el número de células aisladas del testículo vitrificados/calentados en comparación con el número de células aisladas de los testículos frescos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de enfriamiento ultra rápido desarrollado para especies de aves y mamíferos10,11,12 a la crioconservación de testículo de pez (pez cebra como modelo organismo). La mayoría de los estudios anteriores con respecto a la criopreservación de los recursos genéticos del pez cebra se centraron principalmente en criopreservación de esperma de pez ...

Nuevas tendencias en la ciencia y la biotecnología han llevado a la creación de miles de nuevas líneas mutantes de Drosophila, pez cebra, ratones y otras especies usadas como organismos modelo en biomedicina y otras ciencias1. Además, como nuevas tecnologías se desarrollan y se convierten en disponibles, los números de líneas mutantes aumentan constantemente2. Esto conduce a la necesidad de un almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. Como un método que permite el almacenamiento seguro de los recursos genéticos por un período indefinido de tiempo, criopreservación ofrece muchas ventajas tales como extensión de la temporada reproductiva, evita la necesidad de un mantenimiento continuo de los reproductores, y es más costo - y mano de obra eficiente2.
Protocolos de criopreservación de esperma desarrollado durante los últimos varios años2,3,4 ofrecen la oportunidad para el almacenaje acertado del material genético masculino de pez cebra. Sin embargo, la criopreservación de óvulos o embriones de peces todavía no es posible debido a su compleja estructura y grandes cantidades de material de la yema de huevo. Recientemente, la práctica del trasplante de células de germen primordiales (PGCs) o las células madre espermatogonias (SSCs) ofrece un puente a esta barrera mediante el desarrollo funcional de la esperma y huevos después de trasplante5. Por lo tanto, la criopreservación de SSCs ofrece una nueva frontera en la conservación de los recursos genéticos raros y valiosos.
A pesar de que la criopreservación ofrece muchas ventajas, el proceso de congelación lenta tasa genera varias condiciones que pueden llevar a daño de la célula2. Estos incluyen la formación de hielo intracelular y extracelular, deshidratación y toxicidad del crioprotector. Hielo daña las células, hielo extracelular puede conducir a trituración mecánica de las células, mientras que la difusión de agua desde las células durante la tasa lenta de congelación puede conducir a deshidratación6. Recientemente, se ha aplicado vitrificación como una técnica que evita los efectos negativos de la formación de hielo en la criopreservación de gametos de peces7,8,9. Presenta una técnica de enfriamiento ultra rápida a través del cual los medios de comunicación internos y externos se convierten en un estado amorfo/vidrioso sin crystalizing en hielo7,10. Éxito vitrificación de tejido ovárico y testicular ha sido evidenciado en especies de aves y mamíferos10,11,12, abriendo posibilidades para su aplicación en los peces, así.
En este estudio, presentamos el procedimiento de vitrificación (NIV) aguja sumergido para la criopreservación de los testículos todo pez cebra. Demostrar un método confiable para el aislamiento de las células de germen incipiente pez cebra sin contaminación y un proceso de criopreservación que produce cantidades relativamente altas de células de germen incipiente con una baja presencia de otras células, especialmente de espermatozoides. A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es el primer estudio en demostrar un protocolo detallado visualizado para el enfriamiento ultra rápido de tejido gonadal de peces y pez cebra del germline células. Además, la repetibilidad del método se demuestra en cinco cepas diferentes de pez cebra: AB tipo salvaje, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] y línea transgénica de Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplemented with L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td></tr></tbody></table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

Tendencias actuales en ciencia y biotecnología conducen a la creación de miles de nuevas líneas en organismos modelo lo lleva a la necesidad de nuevos métodos para el almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Criopreservación de células de germen incipiente por los testículos todo NIV ofrece posibilidades para el almacenamiento de pez cebra recursos genéticos, especialmente puesto que después maduran a gametos masculinos y femeninos. Los testículos fueron suprimidos, en una aguja de acupuntura, equilibrada en dos medios crioprotectores (solución de equilibrado que contiene 1,5 M metanol y glicol de propileno de 1.5 M; y solución de vitrificación que contiene dimetilsulfóxido de 3 M y 3 M propilenglicol) y sumergida en nitrógeno líquido. Las muestras fueron calentadas en una serie de tres soluciones de calentamiento consiguientes. Las principales ventajas de esta técnica son (1) la falta de espermatozoides después de la digestión de los testículos caliente facilitando manipulaciones posteriores; (2) ultra rápido de enfriamiento que permite la óptima exposición de los tejidos a nitrógeno líquido, por lo tanto maximizar la refrigeración y reducir la necesaria concentración de crioprotectores, reduciendo así su toxicidad; (3) exposición sincrónica de varios testículos crioprotectores y nitrógeno líquido; y repetibilidad (4) demostró mediante la obtención de la viabilidad de sobre el 50% en cinco cepas diferentes de pez cebra.

En promedio, el número de células de germen inicial aislada de un testículo de pez cebra dulce solo varió entre 40.000 y 200.000 células dependiendo del tamaño de los peces. Al digerir los testículos frescos de pez cebra en todas las 5 cepas, células germinales tempranas no eran las células sólo presentes en las suspensiones de la célula (figura 2). Al lado de las células de germen incipiente, numerosos espermatozoides fueron encontrados también....

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Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido

El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Además, se evaluó la repetibilidad del método en cinco cepas diferentes de pez cebra.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K vistas.  Szent István University. El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Además, se evaluó la repetibilidad del método en cinco cepas diferentes de pez cebra.

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Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

La manipulación de ploidía de embriones de pez cebra con el Heat Shock Treatment 2

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Preparación de las propagaciones del cromosoma meiótico a partir de espermacitos de peces cebra

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Genética

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Detección de espermatozoides para el aislamiento rápido de ediciones de la línea germinal en el pez cebra

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Biología

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Hacer pez cebra Gynogenetic diploides por presión inicial

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separación de células foliculares y ocitos en folículos ováricos de pez cebra

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilización

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperación de adultos de pez cebra Corazones para aplicaciones de alto rendimiento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Repetida extracción de sangre para pruebas de sangre en adultos de pez cebra

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Rabbit Embryo Vitrification Using Cryogenic Straw:  An Ultra-Rapid Cooling Technique to Preserve Rabbit Embryos for Long-term Storage

For embryonic vitrification, immerse the embryos in equilibrating solution for 2 minutes, followed by a 1-minute incubation in vitrification solution. At the end of the incubation, load the embryos into a 125-microliter plastic ministraw, and couple the closed end of the straw with an appropriate 1-milliliter microdispenser. Aspirate base medium up to one-third of the straw length, followed by a small air bubble.
Next, use a stereomicroscope to aspirate the embryos in 40 microliters of vitrification solution, followed by another small air bubble in enough base medium to move first liquid fraction up to the cotton end of the ministraw. Then, close the opened end of the ministraw with a straw plug, plunge the ministraw directly into liquid nitrogen to achieve vitrification, and store the ministraw in a liquid nitrogen dewar.

Vitrificación de embriones de conejo con paja criogénica: una técnica de enfriamiento ultrarrápido para preservar embriones de conejo para su almacenamiento a largo plazo