המחברים בהכרת תודה לאשר את המענק ציוד מדעי הטבע, הנדסה מחקר (NSERC) המועצה של קנדה לבדיקות, המענק ההפעלה של המכון הקנדי של הבריאות מחקר (CIHR), למחקר סרטן השד קנדי (CBCR) הברית X.Y. וו, המלגה אוניברסיטת טורונטו זאנג R.X., ג'אנג טי.

כל ניסויים בבעלי חיים היו שאושרו על-ידי חיה טיפול הוועדה של אוניברסיטת בריאות ברשת במכון הסרטן אונטריו, לפי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים-
 1. ביולוגי הכנת הדוגמא <ol><li>לאסוף את כל הדם, האיברים העיקריים, ותצמידו הגידול בנקודות מראש זמן-לאחר מינהל תוך ורידית (עירוי) המכילים תרופות פורמולציות (למשל, DMPLN, liposomal DOX) <ol><li>להזריק עירוי נושאות העכבר של השד עם ניסוח מוכן המכיל סמים.</li>
		<li>עזים ומתנגד העכבר הזמן המיועד-נקודות (למשל, 15 דקות) על ידי מתן איזופלוריין 2% נשימים בחדר אטום.</li>
		<li>הנח את העכבר anesthetized על גבו, שים את האף שלו דרך nosepiece המספק כל הזמן 2% איזופלוריין. 
		הערה: כדי להבטיח העכבר עובר הרדמה עמוקה, בעדינות לצבוט פור איבריו של העכבר על המראה עבור כל תנועה עוויתות.</li>
		<li>ניקוי יסודי אזורי החזה והבטן באמצעות אתנול 70% ולאחר מכן לבצע הליך מסוף פנצ'רים הלב על העכברים anesthetized עמוק באמצעות מזרק heparinized 1 mL מחט 23 גרם-</li>
		<li>לאסוף כל הדם לתוך נתרן שכותרתו הפארין ריסס שפופרת פלסטיק ו מערבולת בעדינות את הצינור כדי להבטיח דם שנאספו בא במגע עם הפרין מצופה של הקיר שפופרת. לאסוף מינימום של 50 µL של דם מלא. תמיד שומרים את הדגימות על קרח</li>
		<li>להקליט את כל ארבעת הגפיים של העכבר כדי לאבטח אותו ולפתוח את חלל הבטן ואת בית החזה של העכבר באמצעות זוג מלקחיים ומספריים. משמרת את המעיים לצד ודחף את הכבד כלפי מעלה כדי מספיק לחשוף את וריד שער הכבד. לחתוך וריד שער הכבד ניקוז דם.</li>
		<li>Perfuse העכבר כל הגוף עם 50 מ ל תמיסת 0.9% קר כקרח דרך הלב באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 25 גרם- 
		הערה: לכופף את המחט ב- 90° עבור המנחה את המזרק לתוך וריד שער הכבד.</li>
		סדר <li>בלו האיברים הבאים: לב, ריאות, כבד, טחול, כליות. לאחר מכן, להפריד את הגידול השד רקמות מסביב בעזרת זוג מספריים החתך משטח שומן החלב נכון של העכבר. לאסוף את כל האיברים בנפרד לתוך צינורות פוליפרופילן 1.5 mL ולהקפיא אותן במהירות בחנקן נוזלי. 
		&#8203; הערה: להפריד את כיס המרה מהכבד.</li>
		<li>לאחסן את כל. הדם 4 ° C ורקמות נכרת במקפיא-80 ° C עד ניתחה HPLC.</li>
	</ol></li> <li>DOX לחלץ, MMC ו- DOXol של מטריצות ביולוגי.
	<ol><li>שוקל כל רקמות ביתור קפוא במהירות ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי התחתון מעוגל מ"ל 13. כדי למנוע את חילוף החומרים סמים אפשריות או השפלה, שומרים את הדגימות על קרח</li>
		<li>להוסיף 1-5 מ של מאגר פירוק התא קר כקרח לתוך הצינור. 
		הערה: הנפח של מאגר להשתמש תלוי משקל הרקמה המבוסס על יחס רקמות-מאגר של ז' 1: 5 מ"ל (w/v); עבור איברים קטנים, כגון הלב, הטחול, היחס הוא ז' 1: 2 מ"ל.</li>
		<li>השתמש תנועה מעלה-מטה שבץ כדי homogenize את דגימות רקמה על הקרח במהירות של 18,000 סל ד באמצעות מהמגן יד חשמלי של. 
		הערה: המגון שהושלמו דורש כ 3 עד 5 חזרות של תהליך המגון קצרה של פחות מ- 15 s, ואחריו רקמות קירור מעל הקרח בין כל המגון קצר.</li>
		<li>לרחוץ את המכשיר מחולל שיני המסור 10 מ מ מהמגן עם מזוקקים יונים (DDI) H 2 O, 70% אתנול, ולאחר מכן DDI H 2 O בין כל דגימה רקמה כדי למנוע זיהום צולב.</li>
		µL <li>µL 50 העברה של רקמת homogenate או דם מלא לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה פוליפרופילן 1.5 mL ספייק עם 5 של פנימי רגיל (I.S.) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) לתוך הצינור. 
		הערה: פתרון 4-MU הוכן בשנת מתנול כאן.</li>
		<li>250 להוסיף µL החומר הממיס החילוץ כקרח לתוך הצינור המכילים דם מלא או רקמות homogenate. 
		הערה: הממס חילוץ מורכב של 60% acetonitrile (לחצן מצוקה) ו- 40% אמוניום אצטט (5 מ"מ) עם pH להתאים ל- pH = 3.5 באמצעות חומצה פורמית 0.05%. להשתמש במדגם (v/v) 1:5: חילוץ הממס יחס נפח.</li>
		<li>נמרצות מערבולת התערובת למשך 2 דקות, צנטריפוגה, ב-3,000 x כוח g ב 4 o C עבור 10 דקות ו- pipet 200 µL supernatant לתוך צינור אחר מיקרו-צנטריפוגה טרום מקורר טריים.</li>
		<li>תגובת שיקוע Evaporate ב 60 מעלות צלזיוס תחת זרם איטי של גז חנקן עם הגנה מפני האור.</li>
		<li>לשקם את שאריות מיובשים עם 100 µL של מתנול קר כקרח, נמרצות מערבולת עבור 30 s ו צנטריפוגה ב 3000 g x ב 4 ° C עבור עוד 5 דק.</li>
		<li>להעביר את תגובת שיקוע לתוך הוספה בקבוקון HPLC ומניחים מדגם בקבוקונים במגש תעשיה להזרקה.</li>
	</ol></li></ol> 2. מכשור HPLC ופרמטרים מבצע <ol><li>HPLC להכין נייד-פאזי עם עקבי הפארמצבטית <ol><li>למדוד 500 מ"ל של HPLC-כיתה ח 2 O באמצעות משורה של.</li>
		<li>למדוד 500 מ"ל של כיתה HPLC acetonitrile (לחצן מצוקה) באמצעות משורה נפרדים של.</li>
		<li>בזהירות להוסיף 0.5 מ ל חומצה trifluoroacetic (TFA) (זהירות) לתוך כל אחד 500 מ"ל של H 2 O ולחצן מצוקה כדי להשיג את שלב ניידים של H 2 O ולחצן מצוקה המכיל 0.1% TFA, בהתאמה. 
		הערה: TFA קורוזיבי ועוד רעילים, צריך להיות מטופל ברדס fume מעבדה. כל הממס תערובות מוכנות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מסנן שלבים נייד דרך פילטר ממברנה ניילון עם מיקרומטר 0.45 גודל הנקבוביות ולהעביר אותו לתוך בקבוקים נקיים של מאגר HPLC.</li>
	</ol></li> <li>מכשור HPLC הגדרת גילוי בו זמנית של 4-MU DOX, MMC, ו DOXol ו I.S..
	<ol><li>לעבור על משאבת הדרגתיות, דה-גסר, אוטומטי-סמפלר, גלאי מערך פוטודיודה, רב גלאי קרינה פלואורסצנטית λ.</li>
		<li>קלט את התנאים הראשוני של הנייד-הרכב ל- 16.5% H 2 O (0.1% TFA) ו- 83.5% לחצן מצוקה (0.1% TFA) (v/v).</li>
		<li>להגדיר את גלאי UV על שני ערוצים, אחד 310 ננומטר עבור 4-MU (I.S.) והאחר על 360 nm עבור MMC.</li>
		<li>להגדיר את גלאי קרינה פלואורסצנטית על שני ערוצים, אחד בכל λ ex / λ em = 365/445 nm עבור 4-MU והשני -λ ex / λ em = 480 ננומטר nm/560 עבור DOX ו- DOXol, בהתאמה.</li>
		<li>לקבוע את שיעור זרימת איזוקראטית של 1.0 מ"ל לדקה</li>
		<li>Equilibrate עמודה 18 שהותקנו מראש הפוכה שלב C (4.6 מ מ x 250 מ מ, 5 מיקרומטר) בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות של הממסד בסיסית.</li>
	</ol></li> <li>להפריד בין תרופות (DOX, MMC, DOXol ו- 4-MU) באמצעות תנאי נייד-שלב מעבר.
	<ol><li>µL להזריק 15 דוגמאות שחולצו ומרוכז מחדש באמצעות auto-סמפלר.</li>
		<li>בהדרגה לשנות את התנאי נייד-שלב ראשוני (עיין פרוטוקול שלב 2.2.2) ל- 100% לחצן מצוקה (0.1% TFA) מעל 18 דקות באמצעות המשאבה הדרגתיות אוטומטיות. 
		הערה: במהלך תהליך ההפרדה, ארבעה ערוצי (שני ספיגה UV ו פלורסנט שני) מופיעים בו זמנית עם אחד מהערוצים הצגת סמים תרכובת (עיין פרוטוקול שלב 2.2.3 ו 2.2.4).</li>
		<li>לשמור על 100% של לחצן מצוקה (0.1% TFA) 1 דקות, ואז לשוב התנאי ראשוני ניידים בתוך מינימלית 1</li>
		<li>מחדש להתנות את העמודה עם ניידים בשלב ראשון בקצב הזרימה של 1.5 mL/min במשך 4 דקות על הזריקה הדוגמה הבאה.</li>
	</ol></li></ol> 3. אימות HPLC <ol><li>להכין עבודה בסטנדרטים של DOX, MMC ו- DOXol ו- 4-MU (I.S.).
	<ol><li>שוקלים בנפרד 1 מ ג של אבקת סם DOX ו- MMC (זהירות), 4-MU-רעננה קטנות במשקל של נייר (3 x 3 ס"מ 2). 
		הערה שכל תרופות נגד סרטן נחשבים סיכון בריאותי שיכולים לגרום המוטגניות רעילות, תא הנבט חריפה על שאיפה או בליעה. הם צריכים להיות מטופלים בזהירות עם כפפות ומסכות.</li>
		<li>להעביר את שנשקל DOX, MMC ו 4-MU חדש mL 1.5 בודדים פוליפרופילן מיקרו-שפופרת צנטרפוגה.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של מתאמפטמיןanol ו מערבולת לזמן קצר כדי להשיג ריכוז 1 מ"ג/מ"ל DOX ו- MMC.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של מתנול לתוך בקבוקון המכיל מראש שנשקל 1 מ ג של DOXol (זהירות) ו מערבולת בקצרה כדי לקבל 1 מ"ג/מ"ל ריכוז DOXol. 
		הערה: DOXol הוא מטבוליט רעיל סיבולת לב ריאה ויש לטפל בזהירות.</li>
		<li>µL פיפטה 20 פתרונות מניות מוכן DOX, MMC, DOXol, 4-MU חדש נפרד צינור מיקרו-צנטריפוגה פוליפרופילן 1.5 mL ולהוסיף 980 µL של מתנול כדי לקבל תקן עובד של µg/mL 20 של כל תרופה.</li>
		<li>µG/mL 20 לדלל DOX, MMC, DOXol באמצעות מתנול כדי להשיג עבודה בסטנדרטים של 50 ng - /mL 20 µg DOX, MMC של DOXol ו- 2000 ng/mL עבור I.S. 4-MU-</li>
		<li>לסגור את הפקק של הצינור של פתרונות עבודה עם חתיכה הצר של פרפין כיסוי הסרט כדי למנוע אידוי מתנול, לעטוף את הצינור כולו ברדיד אלומיניום, כדי למנוע חשיפה אור ישיר חנות ב-20 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>לקבוע את ליניאריות, דיוק, דייקנות DOX, MMC ו- DOXol בביולוגי מטריצות (קרי, דם והגידול homogenate).
	µL <ol><li>בו זמנית ספייק 5 עובדים הסטנדרטים של DOX ו- DOXol (50 ng/mL-µg 20/mL), MMC (1,000 ng/mL-µg 16/mL), ו- 4-MU (2 µg/mL) לתוך µL 50 של דם מלא ריק או רקמות homogenate צינורות פוליפרופילן מיקרו-צנטריפוגה כדי להשיג את עקומת ריכוז רגיל החל 5-2000 ng/mL עבור תרכובות סמים ו 200 ng/mL עבור 4-MU (I.S.).</li>
		<li>ביצוע וזמינותו החילוץ הסמים המתוארות פרוטוקול 1.2.</li>
		<li>השתמש נמוך, חציון וגבוה ריכוזי DOX DOXol (50, 500 ו- 2,000 ng/mL) ו- MMC (100, 1000, 2,000 ng/mL) במשך היום "אינטרה" בין דיוק ודיוק. 
		הערה: להכין טרי ריכוזים רגיל ביום של ניתוח.</li>
	</ol></li> <li>ניתוח דוגמאות של <ol><li>µL 15 להזריק המדגם באמצעות auto-סמפלר.</li>
		<li>בהדרגה לשנות את השלב ניידים מ 0 עד 18 דקות, הגדלת את ההרכב של לחצן מצוקה על מרווח הזמן.</li>
		<li>אחרי 18 דקות, להחזיק התנאי שלב נייד דק 1</li>
		<li>לחזור למצב הראשוני מעל הבא 2 דקות, ולאחר מכן equilibrate מחדש במשך 4 דקות לפני הזריקה הבאה.</li>
		<li>לאחר כל מדגם לרוץ, שימו לב כי הפסגות של סמים תרכובות עם זמן השמירה שלהם מוצגים כדלקמן: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) ו DOX.</li>
		<li>לשלב את האזור שיא תחת עקומת (AUC) של תרכובות סמים באמצעות תוכנה HPLC.</li>
		<li>לחשב את יחס חאן אל בין מתחם בודדים סמים I.S. (משוואה 1) ולהשתמש העקומות סטנדרטי מוכן תחת אותם מיצוי הליכים כדי לקבוע את הסמים ריכוזי DOX, MMC DOXol בניסוח DMPLN. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq1.jpg" /></li> <li>חישוב האחוזים שחזור סמים (משוואה 2) על-ידי השוואת הריכוזים סמים מחדש באמצעות מתנול של תמציות של דגימות ביולוגיות מחודדים לזה תקן (&#34; מסודר &#34;) סמים פתרון מתנול. 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq2.jpg" /></li></ol></li></ol>

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים ניגודי עניינים.

לעומת שאר שיטות כרומטוגרפיות המאפשרים הגילוי של זן סמים אחד בכל פעם, פרוטוקול HPLC הנוכחי הוא מסוגל בו זמנית quantitate שלוש תרכובות סמים (DOX, MMC ו- DOXol) המטריצה הביולוגי אותו ללא צורך לשנות השלב ניידים. שיטה זו הכנה וניתוח יושם בהצלחה כדי לקבוע את פרמקוקינטיקה, ביו-והפצה של שתי מערכות משלוח סמים מבו...

כימותרפיה היא הטיפול היסודי מודאליות עבור סרטן רבים זה קשורה לעיתים קרובות עם תופעות לוואי חמורות, יעילות מוגבלת עקב עמידות לתרופות, אחרים גורמים1,2,3. כדי לשפר את התוצאה של כימותרפיה, סמים בשילוב משטרי הוחלו במרפאה בהתבסס על שיקולים כגון רעילות שאינם חופפים, מנגנונים שונים של פעולה סמים, סמים-צלב ההתנגדות4,5 , 6. בניסויים קליניים, קצב התגובה גידול טוב יותר לעיתים קרובות נצפתה באמצעות בו-זמנית מנוהל שילובים תרופתיים לעומת משטר של סמים רציפים משלוח7,8. עם זאת, בשל תת אופטימלית ביו-הפצת סמים חינם טפסים, הזרקת בו זמנית של מספר תרופות יכול לגרום לרעילות הרקמות בולט זה עולה10,9,את האפקט הטיפולי11. תרופות מבוססות Nanocarrier הוכח לשנות את פרמקוקינטיקה, ביו-והפצה של תרופות שעברו אנקפסולציה, שיפור, ממוקדות הגידול הצטברות12,13,14. כפי שנסקרו במאמרים האחרונים שלנו, חלקיקים נטען במשותף עם שילובים תרופתיים סינרגטי הפגינו יכולת להקל על הבעיות בהם נתקלים שילובים תרופתיים חינם, עקב שלהם מבוקרת הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית שיתוף מסירת תרופות מרובות רקמת הגידול, הפעלת אפקטים סמים סינרגטי נגד סרטן תאים4,15,16. כתוצאה מכך, יעילות טיפולית מעולה ורעילות נמוכה הוכחו בשני מחקרים פרה-קליניים ומחקרים קליניים4,17,18.
שלנו במבחנה מחקרים קודמים מצאו כי השילוב של שתי תרופות נגד סרטן, דוקסורוביצין (DOX) ו מיטומיצין C (MMC), המיוצר אפקט סינרגיסטי נגד מספר שורות תאים של סרטן השד וטעינה, יתרה מזאת, משותף DOX ו- MMC בתוך פולימר-השומנים היברידית חלקיקים (DMPLN) התגבר על שונות בזרימת המשויך עמידים בפני התרופה מרובה משאבות (למשל, P-גליקופרוטאין, חלבון עמיד סרטן השד)19,20,21. In vivo, DMPLN זמין המרחבית-טמפורלית מסירת שיתוף DOX ו- MMC לאתרי הגידול ואת הזמינות הביולוגית מוגברת של סמים בתוך תאי סרטן, כמצוין על-ידי צמצום של היווצרות של doxorubicinol (DOXol) מטבוליט22DOX. כתוצאה מכך, DMPLN משופרת גידול התא אפופטוזיס, עיכוב בצמיחה הגידול והישרדות מארח ממושך בהשוואה חינם לשילוב DOX של MMC או liposomal DOX ניסוח22,23,24, 25.
ניתוח הכמות בפועל של סמים מועברים במשותף על ידי nanocarrier הוא קריטי עבור תכנון יעיל nanoparticle ניסוחים. שיטות רבות פותחו כדי לנתח את רמת פלזמה של מינונים DOX או MMC יחיד באמצעות ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) לבד או בשילוב עם ספקטרומטר מסה (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. עם זאת, שיטות אלה הם לעיתים קרובות מעשי עבור טיפול משולב ועתירת כמו מספר גדול של דגימות ביולוגיות צריכים להיות מוכנים בנפרד לניתוח של תרופות מרובות (כולל לפעמים מטבוליטים סמים). בנוסף הכריכה חלבון חזקה פלזמה של DOX ו- MMC, תאי דם אדומים יש גם יכולת עצומה לאגד ולרכז תרופות נגד סרטן רבים35,36. לפיכך, ניתוח פלזמה DOX או MMC עשויים שמאפילים על פסי דם בפועל סמים ריכוזים. העבודה הנוכחית (איור 1) מתאר פשוטה וחזק מרובים שיטת ניתוח סמים באמצעות היפוך פאזה HPLC כדי לחלץ בו זמנית quantitate DOX, MMC ו- doxorubicinol מטבוליט DOX (DOXol) של דם ורקמות שונות ( למשל, גידולים). זה יושם בהצלחה כדי לקבוע את פרמקוקינטיקה ואת ביו-חלוקת DOX MMC, כמו גם היווצרות של DOXol לאחר משלוח סמים באמצעות פתרונות חינם או טפסים ננו-חלקיק (קרי, DMPLN ו- liposomal DOX) ב- orthotopically מושתל דגם העכבר מאתר הגידול השד לאחר תוך ורידית (עירוי) הזרקה22.

<table style="border-collapse:collapse;width:635pt" width="846">
	<colgroup>
		<col style="width:188pt" width="250" />
		<col style="width:122pt" width="162" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:236pt" width="315" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Doxorubicin&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Polymed Theraeutics</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">111023</td>
			<td class="xl20" style="width:236pt" width="315">Anticancer drug</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Mitomycin C</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Polymed Theraeutics</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">060814</td>
			<td class="xl20" style="width:236pt" width="315">Anticancer drug</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">Doxorubicinol (DOXol)</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Toronto Research Chemicals</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">D558020</td>
			<td class="xl21">Metabolite of DOX</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">4-Methylumbelliferone sodium salt&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">M1508</td>
			<td class="xl21">Internal standard</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Myristic Acid</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">544-63-8&#160;&#160;</td>
			<td class="xl21">Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Polyoxyethylene (100) Stearate</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Spectrum</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">M1402</td>
			<td class="xl21">Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Polyoxyethylene (40) Stearate</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">P3440</td>
			<td class="xl21">Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Pluronic F68 (PF68)</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">BASF Corp.</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">9003-11-6</td>
			<td class="xl21">Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">Ultrasonication (UP100H)</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Hielscher, Ultrasound Technology</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">Nanoparticle preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Water Bath (ISOTEMP 3016HS)</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">Nanoparticle preparation</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl20" height="105" style="width:188pt;height:78.75pt" width="250">Liposomal Doxorubicin&#160; (Caelyx)</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Janssen</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital</td>
			<td class="xl21">Clinically-approved nanoparticle formulation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">HPLC-graded Methanol</td>
			<td class="xl21">Caledon Chemicals</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">6701-7-40</td>
			<td class="xl21">HPLC mobile phase composition</td>
		</tr>
		<tr height="25" style="height:18.75pt">
			<td class="xl20" height="25" style="width:188pt;height:18.75pt" width="250">HPLC-graded H2O</td>
			<td class="xl21">Caledon Chemicals</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">8801-7-40</td>
			<td class="xl21">HPLC mobile phase composition</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">HPLC-graded Acetonitrile&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Caledon Chemicals</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">1401-7-40</td>
			<td class="xl21">HPLC mobile phase composition</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Trifluoroacetic Acid</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">302031</td>
			<td class="xl21">HPLC mobile phase composition</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">0.45 &#956;m Nylon Membrane Filter Paper</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Whatman</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">WHA7404004</td>
			<td class="xl21">HPLC mobile phase preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl29" height="42" style="height:31.5pt">1cc Plastic Syringes</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">2606-309659</td>
			<td class="xl21">Treatment injection</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl29" height="42" style="height:31.5pt">5cc Plastic Syringes</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">2608-309646</td>
			<td class="xl21">Tissue collections</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">30G 1/2 Needles</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">305106</td>
			<td class="xl21">Treatment injection</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">25G 5/8 Needles</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">305122</td>
			<td class="xl21">Tissue collections</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">Sterile 0.9% Saline</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Univeristy of Toronto House Brand</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">1011</td>
			<td class="xl21">Tissue perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl20" height="22" style="width:188pt;height:16.5pt" width="250">13 ml Rounded-bottom conical tube&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">SARSTEDT</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">62.515.006</td>
			<td class="xl21">Prolyprolene, tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl30" height="23" style="height:17.25pt">Alpha Minimum Essential Medium (MEM)&#160;</td>
			<td class="xl27">Gibco</td>
			<td class="xl28" style="width:89pt" width="119">12571063</td>
			<td class="xl21">Cell medium</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl20" height="22" style="width:188pt;height:16.5pt" width="250">1 x Phosphate Buffer Saline</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Gibco</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">10010023</td>
			<td class="xl21">Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Triton X-100</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">X100-100 ML</td>
			<td class="xl21">Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Formic acid</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Caledon Chemicals</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">1/5/3840</td>
			<td class="xl21">Adjust pH for extraction solvent</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">Sodium heparin sprayed plastic tubes</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">367878</td>
			<td class="xl21">Blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Analytical Weigh Balance&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Sartorius&#160;</td>
			<td class="xl21">CPA225D</td>
			<td class="xl21">NA</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">pH meters&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl26">13-637-671</td>
			<td class="xl21">accumet BASIC</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Vortex Mixter</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">02-215-365</td>
			<td class="xl21">Vortexing samples at desired speed</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">1.5 ml&#160; Microcentrifuge Tube</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Fisherbrand</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">2043-05408129</td>
			<td class="xl21">Prolyprolene</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Model 1000 homogenizer</td>
			<td class="xl22">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">08-451-672</td>
			<td class="xl21">Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Centrifuge 5702R</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Eppendorf</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">5702R</td>
			<td class="xl21">Extraction preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Heated Evaporator System</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Glas-Col</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">Sample reconstitution</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">HPLC Screw Thread Vials</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">DIKMA</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">5320</td>
			<td class="xl21">HPLC sample injection</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl20" height="42" style="width:188pt;height:31.5pt" width="250">HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">DIKMA</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">5325</td>
			<td class="xl21">HPLC sample injection</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">HPLC Polypropylene Insert&#160;&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Agilent Technologies</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">5182-0549</td>
			<td class="xl21">Maximum volume 250 &#956;l, HPLC sample injection</td>
		</tr>
		<tr height="25" style="height:18.75pt">
			<td class="xl20" height="25" style="width:188pt;height:18.75pt" width="250">Xbridge C18 Column</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">186003117</td>
			<td class="xl21">Drug analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Gradient pump&#160;</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">W600</td>
			<td class="xl21">Drug analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Auto-sampler</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">W2707</td>
			<td class="xl21">Drug analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Photodiode array detector&#160;</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">W2998</td>
			<td class="xl21">Drug analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Multi &#955; fluoresence detector&#160;</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">W2475</td>
			<td class="xl21">Drug analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">EMPOWER 2</td>
			<td class="xl23">Waters Corporation</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Scientist</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Micromath</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">Pharmacokinetic analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl20" height="21" style="width:188pt;height:15.75pt" width="250">Female Balb/c Mice</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Jackson Laboratory</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">001026</td>
			<td class="xl21">In vivo</td>
		</tr>
		<tr height="63" style="height:47.25pt">
			<td class="xl20" height="63" style="width:188pt;height:47.25pt" width="250">EMT6/WT Breast Cancer Cells</td>
			<td class="xl20" style="width:122pt" width="162">Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">NA</td>
			<td class="xl21">In vivo</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample extraction and simultaneous chromatographic quantitation of doxorubicin and mitomycin c following drug combination delivery in nanoparticles to tumor-bearing mice

כימותרפיה בשילוב נעשה שימוש תכוף במרפאה לטיפול בסרטן; עם זאת, תופעות לוואי המשויך אל הרקמות עלולה להגביל על התועלת טיפולית. שילוב תרופה מבוססי ננו-חלקיק הוכח להקל על הבעיות בהם נתקלים שילוב תרופתי חינם. מחקרים קודמים שלנו יש מראה כי השילוב של שתי תרופות נגד סרטן, דוקסורוביצין (DOX) ו מיטומיצין C (MMC), הפיק אפקט סינרגיסטי נגד שני מאתר, סרטן השד אנושי תאי במבחנה. DOX ו- MMC פולימרים טעונים שיתוף-השומנים היברידית חלקיקים (DMPLN) עקף משאבות טרנספורטר שונות בזרימת המקנים עמידות multidrug והיעילות משופרת והפגינו במודלים הגידול השד. לעומת פתרון קונבנציונאלי צורות, כגון יעילות מעולה של DMPLN יוחס את פרמקוקינטיקה מסונכרן DOX. MMC ואת הזמינות הביולוגית מוגברת סמים תאיים בתוך תאים סרטניים מופעל על-ידי nanocarrier PLN.
כדי להעריך את פרמקוקינטיקה והפצה ביו-של שיתוף מנוהל DOX ו- MMC פתרון חינם והן nanoparticle טפסים, שיטה פשוטה ויעילה ניתוח סמים רב באמצעות ביצועים גבוהים הפוכה-פאזי כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) היה פיתח. בניגוד לשיטות שדווחה בעבר לנתח DOX או MMC בנפרד ב הפלזמה, שיטה זו-hplc, קורס חדש הוא מסוגל בו זמנית quantitate DOX, MMC ורעיל סיבולת לב ריאה DOX מטבוליט מרכזי, doxorubicinol (DOXol), במטריצות ביולוגיים שונים ( למשל, דם, סרטן השד, לב). Methylumbelliferone 4 בדיקה סופג כפול פלורסנט, אולטרה סגול (4-MU) שימש תקן פנימי (I.S.) לגילוי בשלב אחד של ניתוח הסם מרובים עם אורכי גל שונים לזיהוי. שיטה זו הוחלה בהצלחה כדי לקבוע את ריכוזי DOX MMC מועברים על ידי גישות nanoparticle וגם פתרון בדם כל ורקמות שונים מודל מאתר הגידול השד של orthotopic. השיטה האנליטית המובאת הוא כלי שימושי עבור ניתוח קליניים מבוססי ננו-חלקיק משלוח של שילובים תרופתיים.

שתי תרופות נגד סרטן, DOX MMC, כמו גם של המטבוליט DOX, DOXol, התגלו בו זמנית בלי התערבות ביולוגי באותו יישומית הדרגתיות HPLC בתנאי שימוש 4-MU I.S. עבור קרינה פלואורסצנטית והן גלאי UV. DOX, MMC, DOXol ו- 4-MU היו היטב מופרדים אחד מהשני עם השמירה פעמים של 5.7 מינימום עבור MMC, מין 10.4 עבור DOXol, 10.9 דקות עבור ...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-b

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

פרוטוקול זה מתאר תהליך אנליטי יעיל ונוח של חילוץ מדגם ונחישות סימולטני של סמים מרובים, דוקסורוביצין (DOX), מיטומיצין C (MMC), מטבוליט רעיל אירובי DOX, doxorubicinol (DOXol), בהביולוגי דוגמאות של המודל הגידול השד פרה שטופלו nanoparticle ניסוחים שילוב סינרגטי סמים.

חילוץ מדגם, כימות כרומטוגרפי סימולטני של דוקסורוביצין, מיטומיצין C שלאחר משלוח סמים בשילוב של חלקיקים נושאות לעכברים

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

sample-extraction-simultaneous-chromatographic-quantitation

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Cancer Research

Unit 1

Pharmacokinetic Models

SCIENTISTS IN ACTION

10.8K Views.  University of Toronto. פרוטוקול זה מתאר תהליך אנליטי יעיל ונוח של חילוץ מדגם ונחישות סימולטני של סמים מרובים, דוקסורוביצין (DOX), מיטומיצין C (MMC), מטבוליט רעיל אירובי DOX, doxorubicinol (DOXol), בהביולוגי דוגמאות של המודל הגידול השד פרה שטופלו nanoparticle ניסוחים שילוב סינרגטי סמים.

Video: Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality1. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)3, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism2. Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

קולון-26 קרצינומה גידול נושאות עכבר כמודל לחקר סרטן תשישות

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the tumor milieu can possess pro- or anti-tumor capacity. One of the important cytokines regulating neutrophil functions in a tumor context are type I interferons. In the presence of interferons, neutrophils gain anti-tumor properties, including cytotoxicity or stimulation of the immune system. Conversely, the absence of an interferon signaling results in prominent pro-tumor activity, characterized with strong stimulation of tumor angiogenesis. Recently, we could demonstrate that pro-angiogenic properties of neutrophils depend on the activation of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) signaling pathway in these cells. Inhibition of this pathway in tumor-associated neutrophils leads to their potent anti-angiogenic phenotype. Here, we demonstrate our newly established model allowing in vivo evaluation of tumorigenic potential of manipulated tumor-associated neutrophils (TANs). Shortly, pro-angiogenic tumor-associated neutrophils can be isolated from tumor-bearing interferon-deficient mice and repolarized into anti-angiogenic phenotype by blocking of NAMPT signaling. The angiogenic activity of these cells can be subsequently evaluated using an aortic ring assay. Anti-angiogenic TANs can be transferred into tumor-bearing wild type recipients and tumor growth should be monitored for 14 days. At day 14 mice are sacrificed, tumors removed and cut with their vascularization assessed. Overall, our protocol provides a novel tool to in vivo evaluate angiogenic capacity of primary cells, such as tumor-associated neutrophils, without a need to use artificial neutrophil cell line models. vc

Here, we show therapeutic potential of anti-angiogenic tumor-associated neutrophils after their transfer into tumor-bearing mice. This protocol can be used to manipulate neutrophil activity ex vivo and to subsequently evaluate their functionality in vivo&#160;in developing tumors. It is an appropriate model for studying potential neutrophil-based immunotherapies.

העברה של הגידול מניפולציות הקשורים נויטרופילים לתוך הגידול עכברים נושאת ללמוד פוטנציאל אנגיוגנטי שלהם ב Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

בVivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-Zebrafish גידול Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory cytokine interleukin-1 alpha (IL-1&#945;) has been evaluated as an anticancer agent in several preclinical and clinical studies. However, dose-limiting toxicities, including flu-like symptoms and hypotension, have dampened the enthusiasm for this therapeutic strategy. Polyanhydride nanoparticle (NP)-based delivery of IL-1&#945; would represent an effective approach in this context since this may allow for a slow and controlled release of IL-1&#945; systemically while reducing toxic side effects. Here an analysis of the antitumor activity of IL-1&#945;-loaded polyanhydride NPs in a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) syngeneic mouse model is described. Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6J mice. Once tumors reached 3-4 mm in any direction, a 1.5% IL-1a - loaded 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticle (IL-1&#945;-NP) formulation was administered to mice intraperitoneally. Tumor size and body weight were continuously measured until tumor size or weight loss reached euthanasia criteria. Blood samples were taken to evaluate antitumor immune responses by submandibular venipuncture, and inflammatory cytokines were measured through cytokine multiplex assays. Tumor and inguinal lymph nodes were resected and homogenized into a single-cell suspension to analyze various immune cells through multicolor flow cytometry. These standard methods will allow investigators to study the antitumor immune response and potential mechanism of immunostimulatory NPs and other immunotherapy agents for cancer treatment.

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&amp;#945; Nanoparticles

A standard protocol is described to study the antitumor activity and associated toxicity of IL-1&#945; in a syngeneic mouse model of HNSCC.

הערכת הפעילות האנטי-סרטנית In vivo של ננו-חלקיקים פוליאנהידריד IL-1α

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These relatively simple avascular constructs mimic key aspects of in vivo tumors, such as 3D structure and pathophysiological gradients. MCTSs models can provide insights into cancer cell behavior during spheroid development and in response to drugs; however, their requisite size drastically limits the tools used for non-destructive assessment. Optical Coherence Tomography structural imaging and Imaris 3D analysis software are explored for rapid, non-destructive, and label-free measurement of regional cell density within MCTSs. This approach is utilized to assess MCTSs over a 4-day maturation period and throughout an extended 5-day treatment with Trastuzumab, a clinically relevant anti-HER2 drug. Briefly, AU565 HER2+ breast cancer MCTSs were created via liquid overlay with or without the addition of Matrigel (a basement membrane matrix) to explore aggregates of different morphologies (thicker, disk-like 2.5D aggregates or flat 2D aggregates, respectively). Cell density within the outer region, transitional region, and inner core was characterized in matured MCTSs, revealing a cell-density gradient with higher cell densities in core regions compared to outer layers. The matrix addition redistributed cell density and enhanced this gradient, decreasing outer zone density and increasing cell compaction in the cores. Cell density was quantified following drug treatment (0 h, 24 h, 5 days) within progressively deeper 100 &#181;m zones to assess potential regional differences in drug response. By the final timepoint, nearly all cell death appeared to be constrained to the outer 200 &#181;m of each aggregate, while cells deeper in the aggregate appeared largely unaffected, illustrating regional differences in the drug response, possibly due to limitations in drug penetration. The current protocol provides a unique technique to non-destructively quantify regional cell density within dense cellular tissues and measure it longitudinally.

The present protocol develops an image-based technique for rapid, non-destructive, and label-free regional cell density and viability measurement within 3D tumor aggregates. Findings revealed a cell-density gradient, with higher cell densities in core regions than outer layers in developing aggregates and predominantly peripheral cell death in HER2+ aggregates treated with Trastuzumab.

הערכה לא הרסנית של צפיפות תאים אזורית בתוך אגרגטים סרטניים בעקבות טיפול תרופתי

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These ...

כימות אורך הטלומרים באמצעות זיהוי כימילומינסנציה לא רדיואקטיבית

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

מחבר זרקור: אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...