Gli autori non hanno nulla a rivelare.

1. preparare il mezzo di crescita Nota: la composizione chimica di M63 medio minimo è il seguente: 62 mM K 2 HPO 4, 39mm KH 2 PO 4, 15mm (NH 4) 2 SO 4, 1,8 µM FeSO 4, 15 µM tiamina-HCl, 0,2 mM MgSO 4 e 22 millimetri di glucosio. M63 è fatto mescolando tre soluzioni di riserva: soluzione X cinque, 20% glucosio e soluzione di MgSO 4 della tiamina. Conservare tutte le soluzioni a 4 ° C.
<ol><li>Preparare la soluzione di cinque X <ol><li>per preparare FeSO 4 soluzione, utilizzare una pipetta elettrica e una pipetta sierologica per aggiungere ddH 2 O a una provetta da centrifuga da 50 mL. Utilizzare un P-200 per aggiungere 0,06 mL HCl 36mg FeSO 4 M HCl. aggiungere 0.01-7h 2 O e mescolare bene.</li>
		<li>Misurare 160 mL ddH 2 O in un cilindro graduato e aggiungerlo a un becher da 500 mL. Aggiungere il codice seguente in questo ordine: 10,72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2,0 g (NH 4) 2 SO 4 e 0,5 mL di soluzione di 4 FeSO (preparata al punto 1.1.1).</li>
		<li>Utilizzando un misuratore di pH di precisione, regolare il pH a 7.0 con l'aggiunta di 2 M di KOH. Versare la soluzione in un cilindro graduato e aggiungere ddH 2 O a un volume totale di 200 mL. Sterilizzare la soluzione utilizzando un'unità di filtrazione da 250 mL (PVDF, da 0,22 µM).</li>
	</ol></li> <li>Preparazione della soluzione di glucosio 20% <ol><li>misurare 200 mL ddH 2 O in un cilindro graduato e versarlo in un recipiente di 500 mL. Continuando a mescolare con un agitatore magnetico, aggiungere 50 g di glucosio. Diluire la soluzione in un cilindro graduato per un volume totale di 250 mL. Sterilizzare la soluzione, come descritto al punto 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Preparazione della soluzione di tiamina MgSO 4 <ol><li>aggiungere 150 mL ddH 2 O in un becher da 500 mL. Continuando a mescolare con un agitatore magnetico, è necessario aggiungere 1,0 g di tiamina-HCl e 10 g di MgSO 4-7 H 2 O. Diluire la soluzione in un cilindro graduato per un volume totale di 200 mL. Sterilizzare la soluzione, come descritto al punto 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Preparazione minima media M63 <ol><li>posto la soluzione X cinque, la soluzione di glucosio 20%, la soluzione di MgSO 4 della tiamina, una pipetta elettronica, una pipetta P-200 e puntali per pipette 200-µ l su un banco pulito.</li>
		<li>Misurare 155,8 mL ddH 2 O in un cilindro graduato e versarlo in un becher da mL 500.</li>
		<li>Usando la pipetta elettronica e pipette sierologiche monouso, aggiungere 40 mL di soluzione X cinque e 4 mL di soluzione di 20% glucosio al ddH misurato 2 O. Quindi, aggiungere 0,2 mL di soluzione di MgSO 4 della tiamina con il P-200. Sterilizzare la soluzione, come descritto al punto 1.1.3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparare il brodo di glicerolo <ol><li>cella cultura Nota: I ceppi batterici (ad es., W3110 e suo genoma ridotto) sono disponibili da organizzazioni della banca di ceppo. I ceppi sono ottenuti solitamente sotto forma di colonie su piastre di agar.
	<ol><li>Posto cinque tubi di vetro sterilizzati con tappi di gomma del silicone, una pipetta elettronica, P-1,000, puntali per pipette 1.000-µ l, P-200, puntali per pipette 200-µ l e i ceppi di destinazione (colonie su piastre) su un banco pulito.</li>
		<li>Esporre la bocca del tubo di vetro di un becco Bunsen prima di aprire il tappo di gomma del silicone. Esporre il tappo di gomma del silicone alla fiamma dopo il tubo è aperto e poi leggermente posizionare il tappo sul tubo di vetro.</li>
		<li>Utilizzare la pipetta elettronica e pipette sierologiche monouso per aggiungere uno dei tubi di vetro e 4,5 mL M63 nelle altre quattro provette 5 mL M63.</li>
		<li>Utilizzare la punta di P-200 per prendere una Colonia e inoculare e nel tubo di vetro contenente 5 mL M63.</li>
		<li>Vortex il tubo per fare una sospensione. Quindi, la soluzione diluita 10 volte da trasferire 0,5 mL di questa soluzione a uno dei quattro tubi contenente 4,5 mL M63.</li>
		<li>Ripetere il procedimento descritto al punto 2.1.5 per i rimanenti tubi. Una serie di diluizioni con cinque diverse concentrazioni (diluizioni di 1, 10, 100, 1000 e 10.000) è ora pronto.</li>
		<li>Sterilizzare le foci dei tubi di vetro e i tappi di gomma di silicone come descritto al punto 2.1.2. Le provette con i tappi di Cap. Non arricciando i tappi di gomma di silicone per evitare contaminazione.</li>
		<li>Posizionare i cinque tubi in un'incubatrice di agitazione pre-riscaldata a 37 ° C e agitare a 200 giri/min. Incubare la cultura durante la notte o per h. 10-30</li>
	</ol></li> <li>Selezione della cultura per lo stock di glicerolo <ol><li>inserire il mezzo di temperatura pre-riscaldato M63, P-1,000, puntali per pipette 1.000-µ l e una cuvetta monouso su un banco pulito.</li>
		<li>Aggiungere 1000 µ l M63 a una cuvetta monouso con un P-1, 000. Disponga la provetta monouso con uno spettrofotometro, avviare il programma a una lunghezza d'onda fissa di 600 nm e misura lo spazio in bianco.</li>
		<li>Spostare i tubi di cinque vetro dall'incubatrice che agita il banco pulito.</li>
		<li>Scartare M63 dalla cuvette monouso e aggiungere 1.000 µ l cultura per la stessa cuvetta monouso con un P-1, 000. Misurare la torbidità ottica della coltura delle cellule (OD 600) come descritto al punto 2.2.2. 
		Nota: Per evitare qualsiasi contaminazione e per ottenere una misura precisa, esporre i tubi di vetro e i tappi per la fiamma come descritto e vortice la cultura prima del campionamento. Per garantire risultati affidabili, misurazioni ripetute sono raccomandate, in particolare quando la densità cellulare è bassa.</li>
		<li>Dei cinque colture cellulari, scegliere quello che è in fase di crescita esponenziale precoce (OD 600 = 0,01 - 0,05) per lo stock di glicerolo. 
		Nota: Se le colture multiple hanno densità all'interno della gamma ottima, quella più vicina a 0,05 è comunemente selezionata.</li>
	</ol></li> <li>Le scorte di glicerolo per ripetuti test. 
	Nota: Questo è descritto per la preparazione di dieci titoli. Quantità maggiori o minori possono essere fatti secondo i requisiti sperimentali.
	<ol><li>Posto la soluzione di glicerolo 60% sterilizzata, dieci sterilizzato microprovette da 1,5 mL, P-1,000 e P-200, puntali per pipette 1.000 e 200 µ l e una microprovetta stare su un banco pulito.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l di soluzione di glicerolo di 60% e 750 µ l della cultura cella selezionata nella microprovetta 1,5 mL e mescolare sterilizzati pipettando. 
		Nota: Il volume di stock è variabile, ma sempre mantenere un rapporto di 1:3 di 60% glicerolo alla coltura delle cellule; Questo si traduce in una concentrazione finale di glicerolo al 15%.</li>
		<li>Inserire i restanti nove microprovette nello stand conetti e pipettare 100 µ l della miscela preparata al punto 2.3.2 in ogni provetta. Ora ci sono dieci scorte di glicerolo identici per un utilizzo futuro.</li>
		<li>Conservare le scorte in un congelatore a -80 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 3. Acquisendo le curve di crescita <ol><li>impostare il lettore di micropiastre. 
	Nota: I termini riportati in virgolette Visualizza il fraseggio specifico utilizzato il lettore della piastra utilizzato qui (Vedi la tabella materiali).
	<ol><li>Apri il software. Aperto &#34; protocolli &#34; in &#34; Task Manager &#34; e scegliere &#34; Crea nuovo &#34;. Scegliere &#34; protocollo Standard &#34;.</li>
		<li>Open &#34; Procedure &#34; e regolare le impostazioni. Aperto &#34; impostare la temperatura di &#34; e selezionare &#34; incubatore su &#34;. Impostare &#34; temperatura &#34; a 37 ° C e &#34; gradiente &#34; a 0 ° C. Check &#34; Preheat &#34; prima di continuare con il passaggio successivo. Aperto &#34; avviare Kinetic &#34;, set &#34; Runtime &#34; per 24:00:00 o 48:00:00, e &#34; intervallo &#34; per 00:30:00 o 01:00. 
		Nota: Ci vuole circa 1 minuto per leggere un intero 96 piastra ben.</li>
		<li>Open &#34; Shake &#34; e impostare &#34; Shake modalità &#34; come &#34; lineare &#34;. Verifica &#34; Constitution Shake &#34; e impostare &#34; frequenza &#34; al cpm 567. Aperto &#34; lettura &#34;, controllare &#34; assorbanza &#34;, &#34; Endpoint/cinetica &#34;, e &#34; monocromatori. &#34; Set &#34; lunghezza d'onda &#34; a 600.</li>
		<li>Clic &#34; Validate &#34; per confermare che la procedura è corretta. Fare clic su &#34; salvare &#34; per salvarlo come un nuovo programma per un uso futuro.</li>
	</ol></li> <li>Registrazione di crescita in tempo reale <ol><li>disegnare un pittogramma di piastra a 96 pozzetti (8 × 12 tavolo) per indicare le posizioni dei campioni inoculati cultura sulla piastra 96 pozzetti. Stampare la tabella e utilizzarlo come riferimento per l'esperimento. 
		Nota: I pozzetti situati sui bordi della micropiastra devono contenere solo mezzo vuoto a causa di evaporazione.</li>
		<li>Posto un piatto sterilizzato di 96 pozzetti fondo micropiastra con coperchio, P-1000, puntali per pipette 1000-µ l, P-200, puntali per pipette 200-µ l, diversi microprovette da 1,5 mL, una pipetta multicanale 8, un serbatoio del reagente sterilizzato, temperatura ambiente M63 e glicerolo scorte (preparate al punto 2.3) su un banco pulito.</li>
		<li>Aggiungere circa 25 mL M63 per il serbatoio del reagente. Utilizzare questo stock di serbatoio per tutti i passaggi seguenti.</li>
		<li>µ L aggiungere 900 M63 per microprovette in preparazione per effettuare diluizioni seriali.</li>
		<li>Scongelare il brodo di glicerolo a temperatura ambiente. µ L 900 M63 alla Stock in glicerolo scongelati e vortice. Questo si traduce in una diluizione di 10 volte del titolo originale glicerolo.</li>
		<li>Trasferire 100 µ l della diluizione 10 volte ad un'altra microprovetta contenente 900 µ l di M63 e vortex. Questo si traduce in una diluizione di 100 volte.</li>
		<li>Ripetere il punto 3.2.6 fino al raggiungimento del numero desiderato di diluizioni.</li>
		<li>Riempire i pozzetti al bordo della micropiastra con 200 µ l M63 utilizzando una pipetta a 8 canali (P-200). 
		Nota: Questi pozzi possono essere utilizzati come il vuoto.</li>
		<li>Carico 200 µ l di ogni campione preparato nei passaggi 3.2.4 - 3.2.7 dei pozzetti di micropiastra secondo la tabella di riferimento (punto 3.2.1) diluito. Vortice il priore di campioni diluiti a carico e carico lo stesso campione in pozzi multipli alle varie posizioni sulla piastra.</li>
		<li>Appoggiare la micropiastra a 96 pozzetti al lettore di piastra.</li>
		<li>Open &#34; lettura ora &#34; in &#34; Task Manager &#34; e scegliere il programma (sezione 3.1). Fare clic su &#34; OK &#34; per avviare la misurazione. Salvare la registrazione come un nuovo file sperimentale per l'analisi dei dati (sezione 4).</li>
	</ol></li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li>esportazione i risultati dei dati in tempo reale del tasso di crescita (sezione 3.2) da una memoria USB stick come un file di testo. 
	Nota: Un risultati formattati 96 pozzetti (curve) visualizzerà il lettore della piastra in tempo reale. I record orari (valori OD) possono essere esportati come un tavolo; le righe e le colonne rappresentano i numeri ben (ad esempio, A1, B1) e il tempo di misurazione (ad es., 00:00:59), rispettivamente.</li>
	<li>Aprire il file di testo con un software di foglio di calcolo.</li>
	<li>Copiare le letture di 600 OD orarie della micropiastra 96 pozzetti in un nuovo foglio di lavoro per ulteriori analisi.</li>
	<li>Subtract background legge al tempo zero dalla legge orarie di ciascun campione ben. 
	Nota: Per comodità, il valore medio del bianco pozzetti contenenti M63 (punto 3.2.8) può essere utilizzato come il valore background.</li>
	<li>Calcolare la media dei cinque consecutivi OD 600 letture per stimare la densità di popolazione massima. 
	Nota: Il valore medio più grande dei cinque consecutivi OD 600 legge è definito come il massimo OD 600 della curva corrispondente crescita.</li>
	<li>Calcolare il tasso di crescita, µ (h -1), applicando la seguente equazione per tutte le coppie di valori consecutivi di OD 600: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg" /> Nota: In questa equazione, C i e C i + 1 rappresentano i valori di 600 OD di due qualsiasi punti di volta consecutiva (t i e t i + 1, rispettivamente). LN indica il logaritmo naturale.</li>
	<li>Calcola i cambiamenti nel tasso di crescita nel corso del tempo basati su orario OD 600 legge secondo punto 4.6. Calcolare la media e la deviazione standard dei cinque tassi di crescita consecutiva di stimare il tasso di crescita massima. 
	Nota: La media più grande con la più piccola deviazione standard è definita come il tasso di crescita massima della curva corrispondente crescita.</li>
</ol> 5. Confermando la tendenza globale del legge 96 pozzetti (opzionale) Nota: entrambe la piastra reader e la piastra a 96 pozzetti consumabili possono causare misurazioni distorte. Per ottenere risultati quantitativi altamente precisi e riproducibili, confermando la tendenza globale della piastra 96 pozzetti è altamente raccomandato.
<ol><li>Preparare la piastra a 96 pozzetti e il lettore di piastre per il bias test come descritto nella sezione 3.2.2.</li>
	<li>Aggiungere 20 mL M63 a una provetta da centrifuga da 50 mL sterilizzato. Aggiungere il brodo di glicerolo alla stessa provetta da centrifuga e vortice. Trasferire la soluzione sospesa ad un serbatoio di reagente sterilizzato.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta a 8 canali per trasferire 200 µ l della soluzione sospesa la piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Appoggiare la piastra a 96 pozzetti al lettore di piastra e avviare la misurazione.</li>
	<li>Record oraria OD 600 legge e analizzare come descritto nella sezione 4. Confronta la densità di tasso e popolazione di crescita massima calcolata di ciascun pozzetto per determinare la localizzazione bias del legge 96 pozzetti.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kovarova-Kovar, K., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+kinetics+of+suspended+microbial+cells:+from+single-substrate-controlled+growth+to+mixed-substrate+kinetics.">Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).</li><li>Soupene, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+studies+of+Escherichia+coli+strain+MG1655:+growth+defects+and+apparent+cross-regulation+of+gene+expression.">Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression.</a> J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+and+physiology:+a+call+for+better+craftsmanship.">Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship.</a> Front Microbiol. 6, 287 (2015).</li><li>Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. 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Ringraziamo Kohei Tsuchiya per fornire l'esempio di analisi CFU. Questo lavoro è stato parzialmente finanziariamente supportato da una sovvenzione per ricerca scientifica (C) n. 26506003 (con BWY) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia, Giappone.

Fasi critiche nel protocollo prevedono la preparazione di un fondo comune delle cellule e la replica di stessi campioni in pozzi multipli in diverse posizioni sulla micropiastra in crescita esponenziale. Microbiologi avviato in precedenza, la cultura da una pre-cultura durante la notte. Mentre questo metodo può ridurre il tempo di ritardo di crescita batterica, è difficile da realizzare curve di crescita riproducibile. Come mostrato nella Figura 2, le misure indipendenti utilizzando le sco...

Studi microbiologici spesso iniziano con la cultura delle cellule batteriche e la valutazione delle curve di crescita batterica, che rappresentano un fenomeno fondamentale della fisiologia batterica1,2,3. Principi di cultura di base sono ampiamente disponibili nella letteratura di ricerca pubblicata e libri di testo perché la coltura batterica è una metodologia fondamentale. A livello di banco, notevole attenzione è stata concentrata tradizionalmente su ottimizzando la crescita media e condizioni di coltura, ma controllando il tasso di crescita, che sarebbe probabilmente fornire anche una maggiore comprensione della fisiologia microbica, non è stato estesamente studiato4. Per i batteri in crescita esponenziale, un parametro chiave dello stato cellulare è il tasso di crescita, che è stato segnalato per essere coordinato con il genoma, trascrittoma e proteoma5,6,7,8 . Pertanto, la valutazione quantitativa della crescita batterica è cruciale per capire la fisiologia microbica.
Per valutare la crescita batterica, i metodi sperimentali usati per stimare la biomassa sono affermati9,10 e si basano sulla rilevazione di parametri biochimici, fisici o biologici, come torbidità ottico. Inoltre, i metodi analitici utilizzati per catturare le proprietà dinamiche dei cambiamenti di crescita comunemente sono basati su modelli non lineari consolidati11,12,13, ad esempio, logistiche equazioni. Tasso di crescita è generalmente acquisite mediante campionamento temporizzato della crescita delle cellule in coltura da misura della torbidità ottico o eseguire dosaggi di formanti colonie (CFU) unità. La limitazione di questi metodi di rilevamento e di coltura è che i punti dati non sono un vero riflesso della dinamica di popolazione, poiché gli intervalli di misurazione sono spesso in ore e poiché la condizione di cultura (ad esempio, variazioni di temperatura e aerazione) è disturbato al momento del campionamento. Tecniche di analisi e cultura devono essere aggiornate utilizzando recenti sviluppi nella tecnologia e nella comprensione. Gli avanzamenti recenti in lettori di micropiastre consentono l'osservazione in tempo reale di crescita batterica e ridurre notevolmente i costi di manodopera. Utilizzando questi dispositivi avanzati, gli ultimi studi sulla crescita batterica sono riportati metodi analitici per misure ad alta velocità14,15.
Lo scopo del presente protocollo è quello di valutare la dinamica di crescita precise in un modo ad alta velocità, che si riveleranno utile per studi quantitativi che, infine, affrontare le questioni di come viene determinato il tasso di crescita e fattori che influenzano il tasso di crescita. Il protocollo risolve tutti i fattori che dovrebbero essere presi in considerazione per la quantificazione precisa e ripetibile di crescita batterica. Il metodo sperimentale e l'analisi sono descritti dettagliatamente nel testo principale. Questo metodo permette l'analisi precisa e riproducibile della crescita batterica in un modo ad alta velocità. Microbiologi possono utilizzare questo protocollo per derivare ulteriori risultati quantitativi da loro evidenza sperimentale. Questo protocollo è utilizzabile anche per gli studi in biologia dei sistemi che tentano di trarre conclusioni concettuale o per ottenere una panoramica teorica della crescita.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>138-00415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine-HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>094-01082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>075-00611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (50 mL, sterilized)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 200 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-705Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube (1.5 mL)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>131-715C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 multichannel-pipette</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>NT-8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PASORINA STIRRER</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>2-4990-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cylinder (200 mL)</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-8562-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision pH mater</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>AS800 / 1-054-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-200</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-1000</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube stand</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>801-02Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>BM-V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar reagent reservoir (50 mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &#181;M)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>DRUMMOND</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0053778-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal cell (1.5 mL)</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>1938 / 2-478-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A23616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>82-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIO clean bench</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCV-B131F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td>NICHIDEN RIKA GLASS</td>
			<td>P-10M~P-30 /101019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber stoppers</td>
			<td>ShinEtsu Polymer</td>
			<td>T-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td>Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise, high-throughput analysis of bacterial growth

Crescita batterica è un concetto centrale nello sviluppo della moderna fisiologia microbica, così come nelle indagini di dinamica cellulare a livello di sistemi. Studi recenti hanno riferito le correlazioni tra la crescita batterica e gli eventi di genoma, come riorganizzazione di riduzione e del trascrittoma di genoma. Analizzare correttamente la crescita batterica è cruciale per capire il coordinamento di crescita-dipendente delle funzioni geniche e componenti cellulari. Di conseguenza, la precisa valutazione quantitativa della crescita batterica in un modo ad alta velocità è richiesta. Gli sviluppi tecnologici emergenti offrono nuovi strumenti sperimentali che consentono aggiornamenti dei metodi utilizzati per studiare la crescita batterica. Il protocollo introdotto qui impiega un lettore di micropiastre con una procedura sperimentale altamente ottimizzata per la valutazione precisa e riproducibile di crescita batterica. Questo protocollo è stato usato per valutare la crescita di diversi ceppi di Escherichia coli in precedenza. Le fasi principali del protocollo sono come segue: la preparazione di un gran numero di cellule Stock in piccole fiale per ripetuti test con risultati riproducibili, l'uso di piastre a 96 pozzetti per valutazione di crescita ad alta velocità e il calcolo manuale delle due grandi parametri (cioè, crescita massima frequenza e densità di popolazione) che rappresenta il tasso di crescita. Rispetto ai tradizionali test di unità (CFU) formanti colonie, che conta le celle che sono coltivate in tubi di vetro nel tempo su piastre di agar, il presente metodo è più efficiente e fornisce documenti più dettagliati temporale dei cambiamenti di crescita, ma ha una più rigorosa limite di rilevabilità a bassa densità. In sintesi, il metodo descritto è vantaggioso per l'analisi di alto-rendimento preciso e riproducibile della crescita batterica, che può essere utilizzata per trarre conclusioni concettuale o effettuare osservazioni teoriche.

Il metodo descritto fornisce un mezzo per catturare la dinamica crescita batterica in modo continuo, ad alta velocità utilizzando un lettore di formato da 96 pozzetti che prende misurazioni multiple di densità ottica a vari intervalli di tempo (da minuti a ore o giorni). Le curve di crescita di un assortimento di ceppi di Escherichia coli che esprimono vari genomi possono essere acquisite proprio in un singolo esperimento (Figura 1A). In confronto ...

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Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Analisi precisa, High-throughput di crescita batterica

Valutazione quantitativa della crescita batterica è essenziale per comprendere la fisiologia microbica come un fenomeno di livello dei sistemi. Un protocollo per la manipolazione sperimentale e un approccio analitico vengono introdotti, per consentire analisi precisa, ad alta velocità di crescita batterica, che è un tema chiave di interesse in biologia dei sistemi.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.7K Views.  University of Tsukuba. Valutazione quantitativa della crescita batterica è essenziale per comprendere la fisiologia microbica come un fenomeno di livello dei sistemi. Un protocollo per la manipolazione sperimentale e un approccio analitico vengono introdotti, per consentire analisi precisa, ad alta velocità di crescita batterica, che è un tema chiave di interesse in biologia dei sistemi.

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High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Ricerca

Biologia

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Un saggio di legame High Throughput MHC II per l&#39;analisi quantitativa dei peptidi epitopi

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Automatizzata Modular High Throughput Screening esopolisaccaride piattaforma Accoppiato con altamente sensibile Analisi Carboidrati impronte digitali

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

-High Throughput, Multi-Image Cryohistology di mineralizzati tessuti

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Analisi precisa, High-throughput di crescita batterica

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