Name: precise, high-throughput analysis of bacterial growth
Uploaded: 2017-09-19T13:00:00.000+00:00
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1. Vorbereitung das Wachstumsmedium Hinweis: die chemische Zusammensetzung der minimale mittlere M63 lautet wie folgt: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4 1,8 µM FeSO 4, 15 µM Thiamin-HCl, 0,2 mM MgSO 4 und 22 mM Glukose. M63 erfolgt durch das Mischen von drei Stammlösungen: 5 X Lösung, 20 % Glukose und MgSO 4 Thiamin-Lösung. Speichern Sie alle Lösungen bei 4 ° c
<ol><li>Herstellung der fünf X-Lösung <ol><li>, FeSO 4 Lösung vorzubereiten benutzen eine elektrische Pipette und ein Einweg-serologische Pipette eine 50 mL Zentrifugenröhrchen DdH 2 O hinzu. Verwenden Sie eine P-200 hinzufügen 0,06 mL HCl zu erhalten 0,01 M HCl. Add 36 mg FeSO 4-7 H 2 O und gut verrühren.</li>
		<li>160 mL DdH 2 O in einem Messzylinder messen und einen 500-mL-Becherglas hinzufügen. Fügen Sie die folgenden in dieser Reihenfolge: 10,72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2, 0 g (NH 4) 2 SO 4 und 0,5 mL FeSO 4-Lösung (vorbereitet in Schritt 1.1.1).</li>
		<li>Mit dem Präzisions-pH-Meter, den pH-Wert auf 7,0 durch Zugabe von 2 M KOH einstellen. Gießen Sie die Lösung in einen Glaszylinder und einem Gesamtvolumen von 200 mL fügen Sie DdH 2 O hinzu. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 250-mL-Filteranlage (PVDF, 0,22 µM).</li>
	</ol></li> <li>Herstellung der 20 % Glukoselösung <ol><li>200 mL DdH 2 O in einem Messzylinder zu messen und um einen 500-mL-Becherglas gießen. Fügen Sie beim Mischen mit einem Magnetrührer, 50 g Glukose. Verdünnen Sie die Lösung in einem Messzylinder auf ein Gesamtvolumen von 250 mL. Die Lösung zu sterilisieren, wie unter Schritt 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Herstellung der MgSO 4 Thiamin Lösung <ol><li>einen 500-mL-Becherglas 150 mL DdH 2 O hinzufügen. Fügen Sie beim Mischen mit einem Magnetrührer ein Gesamtvolumen von 200 mL 1,0 g Thiamin-HCl und 10 g MgSO 4-7 H 2 O. verdünnt die Lösung in einem Messzylinder hinzu. Die Lösung zu sterilisieren, wie unter Schritt 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Vorbereitung minimale mittlere M63 <ol><li>legen die fünf X-Lösung, die 20 % Glukoselösung MgSO 4 Thiamin Lösung, eine elektronische Pipette, einer P-200-Pipette und 200 µL Pipettenspitzen auf einer sauberen Werkbank.</li>
		<li>Maßnahme 155,8 mL DdH 2 O in einem Messzylinder und gießen Sie sie in einen 500-mL-Becherglas.</li>
		<li>Mit dem elektronischen Pipette und Einweg-serologische Pipette, Hinzufügen der gemessenen DdH 2 O. 40 mL 5 X und 4 mL 20 % Glucoselösung Fügen Sie dann 0,2 mL MgSO 4 Thiamin-Lösung mit der P-200. Die Lösung zu sterilisieren, wie unter Schritt 1.1.3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Glycerin-Lager <ol><li>Zelle Kultur Hinweis: die Bakterienstämme (z.B., W3110 und seine reduzierte Genome) gibt es von Belastung Bank Organisationen. Die Stämme werden in der Regel in Form von Kolonien auf Agarplatten erhalten.
	<ol><li>Platz fünf sterilisierte Glasröhren mit Silikon Gummistopper, eine elektronische Pipette, P-1,000, 1.000 µL Pipettenspitzen, P-200, 200-µL-Pipettenspitzen und die Ziel-Stämme (Kolonien auf Tellern) auf einer sauberen Werkbank.</li>
		<li>Aussetzen die Mündung des Glasrohrs auf dem Bunsenbrenner vor dem Öffnen des Silikon-Gummistopfens. Setzen Sie den Silikon-Gummistopfen in die Flamme nach dem Öffnen der Tube und leicht setzen Sie die Kappe wieder auf die Glasröhre.</li>
		<li>Verwenden die elektronische Pipette und Einweg-serologische Pipette eines der Glasröhren und 4,5 mL M63, die anderen vier Röhrchen 5 mL M63 hinzu.</li>
		<li>P-200 Tipp verwenden, um eine Kolonie zu wählen und in das Glasrohr mit 5 mL M63 impfen.</li>
		<li>Vortex das Rohr zu einer Suspension. Verdünnen Sie die Lösung dann 10-fach durch Übertragung von 0,5 mL dieser Lösung auf eine der vier Röhren mit 4,5 mL M63.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang im Schritt 2.1.5 für die übrigen Röhren beschrieben. Eine Verdünnungsreihe mit fünf verschiedenen Konzentrationen (Verdünnungen von 1, 10, 100, 1000 und 10.000) ist jetzt bereit.</li>
		<li>Sterilisieren die Mündern von Glasröhren und Silikon-Gummistopfen wie unter Punkt 2.1.2 beschrieben. Verschließen Sie die Rohre mit dem Stopfen. Kontamination vermeiden, indem Sie nicht knittern die Silikon-Gummistopper.</li>
		<li>Legen die fünf Röhren in einem vorgewärmten schütteln Inkubator bei 37 ° C und bei 200 u/min schütteln. Inkubation die Kultur über Nacht oder für 10 bis 30 h</li>
	</ol></li> <li>Auswahl der Kultur für das Glycerin Lager <ol><li>legen das vorgewärmte Raumtemperatur M63 Medium, P-1,000, 1.000 µL Pipettenspitzen und ein Einweg-Küvette auf einer sauberen Werkbank.</li>
		<li>Hinzufügen 1000 µL M63, eine Einweg-Küvette mit einem p-1, 000. Legen Sie die Einweg-Küvette in einem Spektrophotometer, starten Sie das Programm bei einer festen Wellenlänge von 600 nm und Maßnahme des Rohlings.</li>
		<li>Ans der sauberen Bank die fünf Glasröhren aus dem Schütteln Inkubator.</li>
		<li>Verwerfen M63 von Einweg-Küvette und die gleichen Einweg-Küvette mit einem p-1, 000 1.000 µL Kultur hinzufügen. Die optische Trübung der Zellkultur (OD 600) zu messen, wie in Schritt 2.2.2 beschrieben. 
		Hinweis: Um eine Kontamination zu vermeiden und eine präzise Messung zu erreichen, setzen Sie die Glasröhren und die Stopper der Flamme wie beschrieben und Wirbel der Kultur vor der Probenahme. Um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten, sind wiederholte Messungen empfohlen, besonders wenn die Zelldichte niedrig ist.</li>
		<li>Der fünf Zellkulturen, wählen Sie in der frühen Phase des exponentiellen Wachstums (OD 600 = 0,01 - 0,05) für den Glycerin bestand. 
		Hinweis: Wenn mehrere Kulturen dichten im optimalen Bereich, die am nähsten zu 0,05 ist allgemein ausgewählt.</li>
	</ol></li> <li>Machen die Glycerin-Bestände für wiederholte Prüfungen. 
	Hinweis: Dies ist für die Zubereitung von zehn Aktien beschrieben. Größere oder kleinere Mengen können je nach den experimentellen Anforderungen erfolgen.
	<ol><li>Legen Sie die sterilisierten 60 % Glycerin Lösung, zehn sterilisiert 1,5 mL Mikroröhrchen, P-1,000 und P-200, 1.000 und 200 µL Pipettenspitzen und eine Reaktionscup auf einer sauberen Werkbank stehen.</li>
		<li>Fügen Sie 250 µL 60 % Glycerin Lösung und 750 µL der ausgewählten Zellkultur 1,5 mL Reaktionscup und Mischung von Pipettieren sterilisiert. 
		Hinweis: Das Lager Volumen ist variabel, aber behalten Sie immer eine 1:3-Verhältnis von 60 % Glycerin, Zellkultur; Dadurch wird eine Endkonzentration von 15 % Glycerin.</li>
		<li>Stellen die restlichen neun Mikroröhrchen in die Reaktionscup Ständer und 100 µL der Mischung in 2.3.2 Schritt für jedes Rohr vorbereitet zu verzichten. Mittlerweile gibt es zehn identische Glycerin-Beständen für die zukünftige Verwendung.</li>
		<li>Speichern die Bestände in einer Tiefkühltruhe bei-80 ° c</li>
	</ol></li></ol> 3. Erwerb der Wachstumskurven <ol><li>der Mikrotestplatte Leser einrichten. 
	Hinweis: Die Begriffe in Anführungszeichen zeigen die spezifische Formulierung auf der Platte-Leser verwendet hier verwendet (siehe Tabelle Materialien).
	<ol><li>Offene Software. Offene &#34; Protokolle &#34; in &#34; Task-Manager &#34; und wählen Sie &#34; neu erstellen &#34;. Wählen Sie &#34; Standardprotokoll &#34;.</li>
		<li>Open &#34; Verfahren &#34;, und passen Sie die Einstellungen. Offene &#34; Set Temperatur &#34;, und wählen Sie &#34; Inkubator auf &#34;. Set &#34; Temperatur &#34; auf 37 ° C und &#34; Gradient &#34; auf 0 ° C. Check &#34; vorheizen &#34; bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Offene &#34; starten kinetische &#34;, Set &#34; Laufzeit &#34; für 24:00:00 oder 48:00:00, und &#34; Intervall &#34; 00:30:00 oder 01:00. 
		Hinweis: Es dauert ca. 1 min zu lesen, eine gesamte 96 gut Platte.</li>
		<li>Open &#34; schütteln, &#34; und &#34; Shake Modus &#34; als &#34; Linear &#34;. Überprüfen Sie &#34; CoNstitution Shake &#34; und &#34; Frequenz &#34; auf 567 cpm. Offene &#34; lesen &#34;, überprüfen &#34; Absorption &#34;, &#34; Endpunkt/kinetische &#34;, und &#34; Monochromatoren. &#34; gesetzt &#34; Wellenlänge &#34; bis 600.</li>
		<li>Klicken Sie &#34; Validate &#34; zu bestätigen, dass das Verfahren korrekt ist. Klicken Sie &#34; speichern Sie &#34; als ein neues Programm für die spätere Verwendung zu speichern.</li>
	</ol></li> <li>Echtzeit-Aufnahme des Wachstums <ol><li>zeichnen einen 96-Well-Platte-Piktogramm (8 × 12 Tabelle) um die Positionen der beimpften Kultur Proben auf der 96-Well-Platte anzugeben. Drucken Sie die Tabelle und verwenden Sie es als Referenz für das Experiment. 
		Hinweis: Der Brunnen befindet sich am Rande der Mikrotestplatte sollte nur leere Medium wegen Verdunstung enthalten.</li>
		<li>Ort eine sterilisierte 96-Well-flache Unterseite Mikrotestplatte mit Deckel, P-1000, 1000 µL Pipettenspitzen, P-200, 200-µL-Pipettenspitzen, mehrere 1,5 mL Mikroröhrchen, ein 8-Mehrkanal-Pipette, sterilisierte Reagenz Reservoir, Raumtemperatur M63 und Glycerin Aktien (vorbereitet in Schritt 2.3) auf einer sauberen Werkbank.</li>
		<li>Ca. 25 mL M63 hinzufügen das Reagenz-Reservoir. Dieses Reservoir-Lager für die folgenden Schritte verwenden.</li>
		<li>Fügen Sie 900 µL M63, Mikroröhrchen in Vorbereitung für die Herstellung von Verdünnungsreihen.</li>
		<li>Lassen die Glycerin-Aktie bei Raumtemperatur auftauen. Fügen Sie 900 µL M63 aufgetauten Glycerin Lager und Wirbel. Dies führt zu einer 10-divisibel Verwässerung der ursprünglichen Glycerin Aktie.</li>
		<li>Transfer 100 µL der 10-divisibel Verdünnung zu einer anderen Reaktionscup mit 900 µL M63 und Wirbel. Dies führt zu einer 100-fold Verdünnung.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.2.6 bis die gewünschte Anzahl von Verdünnungen erreicht werden.</li>
		<li>Füllen die Brunnen am Rande der Mikrotestplatte mit 200 µL M63 mit einer 8-Kanal-Pipette (P-200). 
		Hinweis: Diese Brunnen können als Rohling verwendet werden.</li>
		<li>Last 200 µL der einzelnen verdünnt Probe vorbereitet in Schritten 3.2.4 - 3.2.7 um die Mikrotestplatte Brunnen nach der Referenztabelle (Schritt 3.2.1). Wirbel der verdünnten Proben vor dem Laden und laden die gleiche Probe in mehreren Wells in vielfältig Standorte auf der Platte.</li>
		<li>96-Well Mikrotestplatte auf der Platte-Leser legen.</li>
		<li>Open &#34; Read Now &#34; in &#34; Task-Manager &#34; und wählen Sie das Programm (Abschnitt 3.1). Klicken Sie auf &#34; OK &#34; Messung zu beginnen. Speichern Sie die Aufnahme als neue experimentelle Datei für die Datenanalyse (Abschnitt 4).</li>
	</ol></li></ol> 4. Analyse der Daten <ol><li>Export die Ergebnisse der Daten in Echtzeit Wachstumsrate (Abschnitt 3.2) auf einen USB-Speicher-stick als eine Text-Datei. 
	Hinweis: Eine 96-Well formatierte Ergebnisse (Kurven) werden auf der Platte Leser in Echtzeit angezeigt. Die Stundenaufzeichnungen (OD-Werte) können als Tabelle exportiert werden; die Zeilen und Spalten darstellen, die gut Zahlen (z.B. A1, B1) und die Messzeit (z.B. 00:00:59), beziehungsweise.</li>
	<li>Öffnen Sie die Textdatei mit einem Tabellenkalkulations-Software.</li>
	<li>Kopieren Sie die stündlichen OD 600 lautet der 96-Well Mikrotestplatte in ein neues Arbeitsblatt zur weiteren Analyse.</li>
	<li>Subtrahieren Hintergrund liest vor Zeit Null von der stündlichen liest jeder Probe gut. 
	Hinweis: der Einfachheit halber der Mittelwert des Rohlings Brunnen enthaltenden M63 (Schritt 3.2.8) kann verwendet werden, als den Hintergrundwert.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert aus fünf aufeinander folgenden OD 600 liest die maximale Bevölkerungsdichte abzuschätzen. 
	Hinweis: Der größte Mittelwert der fünf aufeinander folgenden OD 600 lautet ist definiert als die maximale OD 600 entsprechende Wachstumskurve.</li>
	<li>Berechnung die Wachstumsrate µ (h -1), durch die Anwendung der folgenden Gleichung für alle Paare aufeinander folgender Werte OD 600: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg" /> Hinweis: In dieser Gleichung C ich und C i + 1 repräsentieren die OD 600 Werte zwei aufeinander folgenden Zeitpunkten (t ich und t i + 1, beziehungsweise). LN gibt natürlichen Logarithmus.</li>
	<li>Berechnen die Veränderungen bei der Zunahme im Laufe der Zeit auf Stundenbasis OD 600 basierend liest laut Schritt 4.6. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der fünf aufeinander folgenden Wachstumsraten, die maximale Wachstumsrate zu schätzen. 
	Hinweis: Der größte Mittelwert mit der kleinsten Standardabweichung ist definiert als die maximale Wachstumsrate der entsprechenden Wachstumskurve.</li>
</ol> 5. Bestätigt die globale Vorspannung des 96-Well lautet (Optional) Hinweis: sowohl die Platte Leser und die Verbrauchsmaterialien 96-Well-Platte können dazu führen, dass voreingenommene Messungen. Um sehr präzise und reproduzierbar quantitative Ergebnisse zu erzielen, bestätigt die globale Vorspannung der 96-Well-Platte ist sehr zu empfehlen.
<ol><li>96-Well-Platte und der Platte-Leser auf den Bias Test vorbereiten, wie in Abschnitt 3.2.2 beschrieben.</li>
	<li>Fügen Sie 20 mL M63, eine sterilisierte 50 mL Zentrifugenröhrchen. Die Brühe Glycerin auf die gleichen Zentrifugenröhrchen und Wirbel. Übertragen die abgehängte Lösung zu einem sterilisierten Reagenz Reservoir.</li>
	<li>Verwenden Sie einen 8-Kanal-Pipette, um 200 µL der suspendierten Lösung auf die 96-Well-Platte zu übertragen.</li>
	<li>96-Well-Platte auf den Teller-Leser und starten Sie die Messung.</li>
	<li>Datensatz die stündliche OD 600 liest und analysiert, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Vergleichen Sie die berechnete maximale Wachstum Rate und Bevölkerung Dichte von jedem gut zu bestimmen, standortbezogene Voreingenommenheit des 96-Well lautet.</li>
</ol>

<ol>
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Wir danken für die Bereitstellung der KBE-Assay-Beispiel Kohei Tsuchiya. Diese Arbeit wurde teilweise finanziell durch eine Beihilfe für wissenschaftliche Forschung (C) Nr. 26506003 (zu BWY) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan unterstützt.

Wichtige Schritte im Protokoll sind die Vorbereitung einer Stammaktie der exponentiell wachsenden Zellen und die Replikation der gleichen Proben in mehreren Brunnen an verschiedenen Positionen auf die Mikrotestplatte. Zuvor, Mikrobiologen die Kultur angefangen eine Übernachtung Vorkultur. Während diese Methode die Verzögerungszeit des Bakterienwachstums verringern kann, ist es schwierig, reproduzierbare Wachstumskurven zu erreichen. Wie in Abbildung 2dargestellt, führte die unabhängigen...

Mikrobiologische Untersuchungen beginnen oft mit der Kultur der Bakterienzellen und der Bewertung der Bakterienwachstum Kurven, die ein grundlegendes Phänomen der bakteriellen Physiologie1,2,3darstellen. Grundlegende Kultur Prinzipien sind weit verbreitet in der veröffentlichten Literatur und Lehrbücher, weil Bakterienkultur eine grundlegende Methodik ist. Die Ebene der Bank erhebliche Aufmerksamkeit hat traditionell auf die Optimierung Wachstumsmedien und Kultivierung Bedingungen, sondern steuern die Wachstumsrate, die wahrscheinlich noch größeres Verständnis für mikrobielle Physiologie bieten würde wurde nicht ausgiebig studiert4. Für exponentiell wachsenden Bakterien, ist ein wichtiger Parameter der zellulären Staat die Wachstumsrate, die berichtet wurde, das Genom, Transkriptom und Proteom5,6,7,8 abgestimmt sein . So ist die quantitative Bewertung des Bakterienwachstums entscheidend für das Verständnis der mikrobielle Physiologie.
Um bakterielles Wachstum zu bewerten, die experimentellen Methoden zur Schätzung der Biomasse sind gut etablierte9,10 und basieren auf dem Nachweis von biochemischen, physikalische oder biologische Parameter, z. B. optische Trübung. Darüber hinaus basieren die analytischen Methoden verwendet, um die dynamischen Eigenschaften des Wachstums Änderungen erfassen häufig auf etablierte nichtlineare Modelle11,12,13, z. B. logistische Gleichungen. Wachstumsdynamik sind in der Regel durch zeitgesteuerte Sampling des Zellwachstums in der Kultur durch optische Trübungsmessung oder Durchführung von koloniebildenden Einheit (KBE) Assays erworben. Die Einschränkung dieser Kultivierung und Erkennung Methoden ist, dass die Datenpunkte kein getreues Spiegelbild der Populationsdynamik sind, da die Messintervalle oft in Stunden sind und die Kultur-Bedingung (z. B.Veränderungen in Temperatur und Belüftung) ist zum Zeitpunkt der Probenahme gestört. Kultur und Analysetechniken müssen aktualisiert werden, mit den letzten Entwicklungen in Technologie und Verständnis. Jüngste Fortschritte in der Mikrotestplatte Leser erlauben die Echtzeit-Beobachtung des Bakterienwachstums und Arbeitskosten deutlich zu verringern. Mit diesen fortschrittlichen Geräten, haben die neuesten Studien über Bakterienwachstum Analysemethoden für Hochdurchsatz-Messungen14,15berichtet.
Dieses Protokoll soll die genaue Wachstumsdynamik in gewissem Hochdurchsatz-bewerten, die quantitative Studien nützlich sein werden, die letztlich die Fragen wie die Wachstumsrate bestimmt wird und welche Faktoren beeinflussen die Wachstumsrate. Das Protokoll befasst sich mit allen Faktoren, die für die reproduzierbare und genaue Quantifizierung des Bakterienwachstums berücksichtigt werden sollten. Die experimentelle Methode und Analyse sind detailliert im Haupttext beschrieben. Diese Methode erlaubt die präzise und reproduzierbare Analyse des Bakterienwachstums in gewissem Sinne Hochdurchsatz. Mikrobiologen können dieses Protokoll verwenden, um zusätzliche quantitative Ergebnisse aus ihrer experimentellen Beweise ableiten. Dieses Protokoll kann auch für Studien in der Systembiologie verwendet werden, die versuchen, konzeptionellen Schlussfolgerungen zu ziehen oder einen theoretischen Überblick über Wachstum zu erreichen.

<table><tbody><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>166-04255</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>019-03435</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako</td><td>138-00415</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine-HCl</td><td>Wako</td><td>201-00852</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Wako</td><td>094-01082</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Wako</td><td>075-00611</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube (50 mL, sterilized)</td><td>WATSON</td><td>1342-050S</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips, 200 &amp;micro;L</td><td>WATSON</td><td>110-705Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips, 1,000 &amp;micro;L</td><td>WATSON</td><td>110-8040</td><td></td></tr><tr><td>Microtube (1.5 mL)</td><td>WATSON</td><td>131-715C</td><td></td></tr><tr><td>8 multichannel-pipette</td><td>WATSON</td><td>NT-8200</td><td></td></tr><tr><td>PASORINA STIRRER</td><td>AS ONE</td><td>2-4990-02</td><td></td></tr><tr><td>Glass cylinder (200 mL)</td><td>AS ONE</td><td>1-8562-07</td><td></td></tr><tr><td>Precision pH mater</td><td>AS ONE</td><td>AS800 / 1-054-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>GILSON</td><td>1-6855-05</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-1000</td><td>GILSON</td><td>1-6855-06</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27014</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27015</td><td></td></tr><tr><td>Microtube stand</td><td>BM Bio</td><td>801-02Y</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BM Bio</td><td>BM-V1</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 3370</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar reagent reservoir (50 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4870</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &amp;micro;M)</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>DRUMMOND</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td><td>TAITEC</td><td>0053778-000</td><td></td></tr><tr><td>Disposal cell (1.5 mL)</td><td>Kartell</td><td>1938 / 2-478-02</td><td></td></tr><tr><td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>A23616</td><td></td></tr><tr><td>EPOCH2</td><td>BioTek</td><td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td><td></td></tr><tr><td>Beaker (500 mL)</td><td>IWAKI</td><td>82-0008</td><td></td></tr><tr><td>BIO clean bench</td><td>Panasonic</td><td>MCV-B131F</td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td>NICHIDEN RIKA GLASS</td><td>P-10M~P-30 /101019</td><td></td></tr><tr><td>Silicone rubber stoppers</td><td>ShinEtsu Polymer</td><td>T-19</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial strains</td><td>Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

precise, high-throughput analysis of bacterial growth

Bakterielles Wachstum ist ein zentrales Konzept in der Entwicklung der modernen mikrobielle Physiologie, sowie bei der Untersuchung der zelluläre Dynamik auf der Systemebene. Jüngste Studien haben Zusammenhänge zwischen Bakterienwachstum und genomweite Ereignisse, z. B. Genom Reduktion und Transkriptom Reorganisation berichtet. Richtig analysieren Bakterienwachstum ist entscheidend für das Verständnis der Wachstum-abhängige Koordination von Genfunktionen und zellulären Komponenten. Dementsprechend ist die präzise quantitative Auswertung des Bakterienwachstums in gewissem Sinne Hochdurchsatz-erforderlich. Neue technologische Entwicklungen bieten neue experimentelle Tools, die Updates über die Methoden zur Untersuchung von Bakterienwachstum zu ermöglichen. Die hier vorgestellte Protokoll beschäftigt einen Mikrotestplatte Leser mit einem hochoptimierten experimentelle Verfahren für die präzise und reproduzierbare Auswertung des Bakterienwachstums. Dieses Protokoll wurde verwendet, um das Wachstum von mehreren Werten zuvor beschriebenen Escherichia-coli -Stämme. Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind wie folgt: die Vorbereitung einer großen Anzahl der Zelle Bestände in kleinen Fläschchen für wiederholte Prüfungen mit reproduzierbaren Ergebnissen, die Verwendung von 96-Well Platten für Hochdurchsatz-Wachstum-Bewertung und die manuelle Berechnung von zwei großen Parameter (d.h. maximale Wachstum Rate und Bevölkerung Dichte) repräsentieren die Wachstumsdynamik. Im Vergleich zu den traditionellen koloniebildenden Einheit (KBE) Assay, der die Zellen, die in Glasröhren im Laufe der Zeit auf Agarplatten kultiviert werden zählt, die vorliegende Methode ist effizienter und bietet detailliertere zeitliche Aufzeichnungen über Wachstum Veränderungen, aber hat eine strengere Nachweisgrenze bei niedrigen Bevölkerungsdichte. Zusammenfassend ist das beschriebene Verfahren vorteilhaft für die präzise und reproduzierbare Hochdurchsatz-Analyse des bakteriellen Wachstums, der konzeptionellen Schlussfolgerungen ziehen oder theoretische Bemerkungen verwendet werden kann.

Das beschriebene Verfahren bietet die Möglichkeit, dynamische Wachstum von Bakterien in einer kontinuierlichen, Hochdurchsatz-Weise durch den Einsatz eines 96-Well-Format-Reader, der mehrere optische Dichtemessungen in verschiedenen Zeitabständen (von Minuten bis Stunden bis Tage) nimmt zu erfassen. Die Wachstumskurven aus einer Zusammenstellung von E. Coli -Stämme, die mit dem Ausdruck verschiedener Genome können genau in einem einzigen Experiment (Abbil...

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Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Präzise, Hochdurchsatz-Analyse des Bakterienwachstums

Quantitative Bewertung des Bakterienwachstums unbedingt mikrobielle Physiologie als Systemebene Phänomen zu verstehen. Ein Protokoll für experimentelle Manipulation und ein analytischer Ansatz eingeführt, ermöglicht präzise, Hochdurchsatz-Analyse der bakteriellen Wachstum, das ist ein zentrales Thema des Interesses in der Systembiologie.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.8K Aufrufe.  University of Tsukuba. Quantitative Bewertung des Bakterienwachstums unbedingt mikrobielle Physiologie als Systemebene Phänomen zu verstehen. Ein Protokoll für experimentelle Manipulation und ein analytischer Ansatz eingeführt, ermöglicht präzise, Hochdurchsatz-Analyse der bakteriellen Wachstum, das ist ein zentrales Thema des Interesses in der Systembiologie.

Serie: Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Forschung

Genetik

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Enhanced Reproducibility and Precision of High-Throughput Quantification of Bacterial Growth Data Using a Microplate Reader

This study aimed to develop a repeatable, reliable, high-throughput protocol to monitor bacterial growth in 96-well plates and analyze the maximum growth rate. The growth curves and maximum growth rates of two bacterial species were determined. Issues including (i) lid condensation, (ii) pathlength correction, (iii) inoculation size, (iv) sampling time interval, and (v) spatial bias were investigated. The repeatability of the protocol was assessed with three independent technical replications, with a standard deviation of 0.03 between the runs. The maximum growth rates of Bacillus mycoides and Paenibacillus tundrae were determined to be&#160;(mean&#160;&#177; SD) 0.99 h&#8722;1 &#177;&#160; 0.03 h&#8722;1 and 0.85 h&#8722;1 &#177; 0.025 h&#8722;1, respectively. These bacteria are more challenging to monitor optically due to their affinity to clump together. This study demonstrates the critical importance of inoculation size, path length correction, lid warming, sampling time intervals, and well-plate spatial bias to obtain reliable, accurate, and reproducible data on microplate readers. The developed protocol and its verification steps can be expanded to other methods using microplate readers and high-throughput protocols, reducing the researchers&#39; innate errors and material costs.

Here, a high-throughput protocol is presented to measure growth data, including growth curves, growth rate, and maximum growth rate. The protocol was verified and validated using two biofilm-producing bacteria. The results and approach applied in this study can be expanded to other high-throughput protocols using microplate readers.

This study aimed to develop a repeatable, reliable, high-throughput protocol to monitor bacterial growth in 96-well plates and analyze the maximum growth ...

Umwelt

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: High-Throughput-Quantifizierung von Colony Wachstum und Verzögerungszeit

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Immunologie und Infektion

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

Mehrskalenanalyse des Bakterienwachstums unter Stressbehandlungen

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Biologie

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in seconds, which leads to accumulation of levels that approach or exceed those of GTP pools. Stress reversal occasions a rapid disappearance of (p)ppGpp, often with a half-life of less than a minute. The presence of (p)ppGpp results in alterations of cellular gene expression and metabolism that counter the damaging effects of stress. Gram-negative and Gram-positive bacteria have different response mechanisms, but both depend on (p)ppGpp concentration. In any event, there is a need to simultaneously monitor many radiolabeled bacterial cultures at time intervals that may vary from 10 seconds to hours during critical stress transition periods. This protocol addresses this technical challenge. The method takes advantage of temperature- and shaker-controlled microtiter dish incubators that allow parallel monitoring of growth (absorbance) and rapid sampling of uniformly phosphate-radiolabeled cultures to resolve and quantitate nucleotide pools by thin-layer chromatography on PEI-cellulose. Small amounts of sample are needed for multiple technical and biological replicates of analyses. Complex growth transitions, such as diauxic growth and rapid (p)ppGpp turnover rates can be quantitatively assessed by this method.

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The growth of radiolabeled bacterial cultures in microtiter dishes facilitates high throughput sampling that allows multiple technical and biological replicate assays of nucleotide pool abundance, including that of (p)ppGpp. The effects of growth transitions provoked by sources of physiological stress as well as recovery from stress can be monitored.

Verwenden von Microtiter Dish Radiolabeling für mehrere In-Vivo-Messungen von Escherichia coli (p)ppGpp gefolgt von dünnschichtiger Chromatographie

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental inputs into stress tolerance, pathogenicity, and other key components of fitness. This manuscript describes a microscope-based assay that tracks approximately 105&#160;Saccharomyces cerevisiae microcolonies per experiment. After automated time-lapse imaging of yeast immobilized in a multiwell plate, microcolony growth rates are easily analyzed with custom image-analysis software. For each microcolony, expression and localization of fluorescent proteins and survival of acute stress can also be monitored. This assay allows precise estimation of strains&#39; average growth rates, as well as comprehensive measurement of heterogeneity in growth, gene expression, and stress tolerance within clonal populations.

Yeast growth phenotypes are precisely measured through highly parallel time-lapse imaging of immobilized cells growing into microcolonies. Simultaneously, stress tolerance, protein expression, and protein localization can be monitored, generating integrated datasets to study how environmental and genetic differences, as well as gene-expression heterogeneity among isogenic cells, modulate growth.

High-Throughput Live Imaging von Mikrokolonien zur Messung der Heterogenität in Wachstum und Genexpression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...