ברצוננו להודות צ'אק קימל להדרכה, ג'ון דאוד לעזרה בפיתוח אסטרטגיה זו רבייה, ווקר Macie שלה לעבודה בלשפר את הכתם השלד, ואת Charline ווקר בוני אולמן לעצות מועילות דג זברה. עבודה זו נתמכה על ידי K99/R00 DE024190 כדי JTN.

כל הניסויים המתוארים פרוטוקול זה הושלמה בשנת בהתאם ותאימות עם מאוניברסיטת קולורדו, של אוניברסיטת אורגון מוסדיים טיפול בעלי חיים, שימוש ועדות (IACUC).
 1-הכנת המניה מתחילה שלא נבחרו <ol><li>זיהוי שירות heterozygous של אלל mutant הריבית על ידי פין קליפ 11 genotyping מלאי של מלא-אחים בעלי חיים על ידי שיטת הבחירה, כגון 13 , 12 , KASP 14. פרוטוקול זה בוצעה עם המתח דג זברה mef2ca b1086.</li>
	<li>KASP genotyping 
	הערה: צבעי יסוד מסוים אלל KASP תוכננו על ידי החברה המספקת את ריאגנטים (ראה טבלה של חומרים). כדי להשיג 6-carboxyl-X-rhodamine (רוקס) לצבוע הריכוז המתאים עבור המכונה PCR בזמן אמת מסוימת לבקר באתר האינטרנט של החברה.
	µL <ol><li>המקום הרקמה זנב דג זברה ב-50 מאגר פירוק (טריס 10 מ מ (pH 8.3), 50 מ מ אשלגן כלורי, MgCl 1.5 מ מ 2, 0.3% ללא יונית חומרים פעילי שטח, 0.3% Octylphenyl-פוליאתילן גליקול). להוסיף 10 µL של 10 מ"ג/מ"ל Proteinase-K לכל טוב של 96-ובכן PCR צלחת וכן תקציר הצנטרפוגה תרמי ב 55 מעלות צלזיוס במשך 2-5 h ואחריו צעד איון 94 ° C 20 דקות. להכניס למקרר תוצר פירוק לאחר עיכול. הערה: פירוק מוצרים יכול לשמש בהצלחה במשך מספר חודשים לאחר ההכנה. כאשר רקמות היה lysed באמצעות 50 מ"מ NaOH, התגובות KASP היו לא מוצלח. ממצאים אלה מראים כי שיטת NaOH ההכנה דנ א גנומי אינה תואמת ל- KASP.</li>
		<li>לכמת את הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. לדלל את תבנית DNA גנומי באמצעות מים כיתה ביולוגיה מולקולרית, כך כל התגובה מכילה כ- 20-30 ננוגרם. 
		הערה: לכמת דגימות 4 או 5, בריכה אותם ולאחר מכן להכין דילולים עבור כל הדגימות מבוסס על הממוצע. בעת שימוש בפרוטוקול זה על הזנב הבוגרים רקמות, לדילול מטריים לעתים קרובות מספיק. כימות מדויק של ריכוז הדנ א אינה נדרשת.</li>
		µL <li>הוסף 0.14 של פריימר KASP לערבב, 5 µL של המאסטר KASP לערבב עבור דגימה על קרח לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL לערבב היטב לפני בקצרה צריך שתוציאו לאסוף תוכן בתחתית השפופרת. 
		הערה: מיקס מאסטר KASP חום, אור רגיש, שומרים מלאי בקרח ולהימנע אור ישיר-</li>
		<li>Pipet 5 µL של פריימר/מאסטר לערבב פתרון לתוך הבארות של צלחת PCR 96-ובכן אופטי מתאים המכונה PCR בזמן אמת בשימוש.</li>
		<li>Pipet 5 µL של מדולל (כ 5-7 ng/µL) דגימות די אן איי תבנית לתוך כל טוב ואני האחות עם פיפטה לערבב.</li>
		<li>µL 5 להוסיף מים נטולי נוקלאז 3 בארות כדי לשמש כפקדי לא-תבנית (NTC) ולהוסיף 5 µL מסוג מדולל אישר homozygous בר, משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים homozygous מוטציה דנ א בתבנית עבור פקדים חיובי.</li>
		<li>הצב של החותם שטיחות מובהק על הבטחת הצלחת הסרט הוא אטום לחלוטין על כל טוב.</li>
		<li>Centrifuge בקצרה את הצלחת ב g x 600 כדי לאסוף את התוכן בתחתית וכדי להסיר את הבועות מהתערובת. 
		הערה: למנוע את הצלחת על קרח, מגן אור עד מוכן להמשיך.</li>
		<li>להשתמש בתוכנית אופניים שמוצג בטבלה 1 לביצוע התגובה העיקרית KASP.</li>
		<li>להציג את העלילה פיזור וכתוצאה מכך המופק על ידי המחשב ניתוח. תגובת מוצלח יציג 4 קבוצות נפרדות של נקודות על המגרש ( איור 3): שלושה לטעום קיבוצים המתאים גנוטיפ, ולקיבוץ אחד NTCs ליד המקור. הפקדים חיובית צריך לארגן עם הקיבוץ הדגימה המתאימה.</li>
		<li>אם התוכנית המחשב אינו מזהה את העלילה קיבוצים כמו המקביל ספציפיים אחרים, נוסף על אופניים ערכות עשוי להיות נחוץ (טבלה 2). חזור על התוכנית נוספים עד המחשב מזהה קיבוצים חזק על ידי גנוטיפ.</li>
		<li>לייצא את התוצאות genotyping בקובץ הגיליון האלקטרוני קל לשימוש ללא ניתוח.</li>
	</ol></li> <li>בית החיות משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מזוהה יחד על מערכת המים הראשי.</li></ol>
 2. הראשונה בסיבוב של רומא הניקוד <ol><li>של Pairwise לחצות heterozygotes אח <ol><li>אחרי החיות להתאושש הסרטון סנפיר, להגדיר pairwise intercrosses. השתמש חוצצים כדי להבטיח עוברי סינכרונית 16.</li>
		<li>לאסוף את העוברים ולשמור את זוגות הורים מבודד רביה כלובים.</li>
		<li>לפקח מבוגרים מבודד כך אגרסיבי דגים יכול להיות מופרדים או מסופק עם כיסוי (דגים גרוסים רשתות יפה עבודה). הדג צריך להיות מוזן ואת המים שלהם השתנה בעקבות הנחיות IACUC בזמן במים סטטי.</li>
	</ol></li> <li>העובר לגידול <ol><li>הבמה ומעלים את העוברים דג זברה רימות תחת תנאים סטנדרטיים 17 עד.</li>
		<li>לאסוף חיות phenotypically פראי-סוג באמצעות פיפטה מזכוכית ביום 5 או 6, כאשר השלפוחית מנופח ב 75% של המצמד. למקם סוגים הפרוע פנוטיפי בחדר הילדים הקלטה של הורים אשר הניב אותם. 
		הערה: עם אללים mutant כי הם גן # מושגים בסיסיים קטלני, מה שנכון של מוטציות רבות השלד, מוטציות homozygous להיכשל טופס שלפוחיות שחייה 18 , 19. לכן, סוגי הפרוע פנוטיפי בקלות מבחינים מן אחיהם מוטציה בהתבסס על שלפוחיות שחייה המנופח.</li>
	</ol></li> <li>מכתים עצם סחוס אדום כחול/Alizarin Alcian <ol><li>עזים ומתנגד בזחלים, אל תנפח את שלפוחיות שחייה באמצעות 0.17 g/L Tricaine-S העובר בתקשורת. לאסוף חיות לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL עם כוס רחב נשא pipet פסטר. הוספת הזחלים לא יותר מ 100 למחזור.</li>
		<li>להסיר העובר מים מהצינור כל ולתקן חיות ב מ 1 ל 2% paraformaldehyde ב 1 x PBS למחזור. 
		התראה: כדורגלן מימית דליק, יגרום לגירוי העור והעין רציני. ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כגון כפפות הגנה העין, רחץ את ידיך ביסודיות לאחר שימוש.</li>
		<li>אבן 1 h; קיבוע יותר פוגע עצם מכתים. לבדוק את הצינורות באופן קבוע במהלך זה, כל והשלבים נדנדה על מנת להבטיח את הזחלים לא להיות תקוע בצד או התגבש בתחתית השפופרת.</li>
		<li>להסיר את מקבע משפופרות באמצעות פיפטה של זכוכית, להוסיף 1 מ"ל של 50% אתנול, ו רוק במשך 10 דקות</li>
		Premix אדום Alizarin לכל 1 מ ל Alcian <li>הכן טרי מכתימה את הפתרון על-ידי הוספת 20 µL של 0.5% (0.04% Alcian כחול/10 מ מ MgCl 2 / 80% אתנול). הסר את 50% אתנול, להוסיף 1 מ"ל של צביעת לפתרון כל שפופרת, ו רוק בן לילה. הזחלים יכולה להישאר בתיקייה הכתם עד 5 ימים.</li>
		<li>להסיר הפתרון כתם של הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל של 80% אתנול/10 מ מ MgCl 2 פתרון כל שפופרת. רוק הצינורות במשך לפחות שעה; שטיפה לילה יכול לייצר כתם כחול Alcian ברור יותר.</li>
		<li>להסיר את 80% אתנול/10 מ מ MgCl פתרון 2 מן הצינורות, להוסיף 1 מ"ל של 50% אתנול; אבן 5 דק.</li>
		<li>להסיר את הפתרון אתנול 50% מן הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל של 25% אתנול וביו -רוק עבור 5 דק.</li>
		<li>להסיר הפתרון אתנול 50% מן הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל טריה 3% H 2 O 2 <פתרון הלבנת KOH /sub>/0.5%. להשאיר את כמוסות פתוח ולתת הצינורות לעמוד במעמד מיקרו-שפופרת למשך כ- 10 דקות או עד צבע חום חלש ניתן לראות את החלק העליון של הפתרון. 
		הערה: שכבה של טופס בועות על הפתרון. זהירות העיתוי נדרש בשלב זה, כמו מעל הלבנת וכתוצאה מכך כתם זוגי המסכן.</li>
		<li>להסיר הפתרון הלבנה והסרת להוסיף 1 מ"ל של 25% glycerol/0.1% קו; אבן 10 דקות לח' 1</li>
		<li>ולהסיר 25% glycerol/0.1% קו פתרון של הצינורות, להוסיף 1 מ"ל של 50% glycerol/0.1% קו פתרון כל שפופרת, רוק 10 דקות ללון.</li>
		<li>להסיר 50% glycerol/0.1% קו פתרון של הצינורות ולהוסיף שוב 50% glycerol/0.1% קו פתרון כל שפופרת. נדנדה בין לילה יסייע להסיר בועות אוויר זה יכול להצטבר בתוך הזחלים. חנות צבעונית ההכנות השלד ב 4 ° C כאשר אינו בשימוש.</li>
	</ol></li> <li>פנוטיפ הניקוד <ol><li>ציון צבעונית צאצא מוטציה. עבור penetrance של פנוטיפ שנבחר. ב. ניקולס et al. 1 מוטציות זכו עבור כל מופע של עצם חוץ רחמי- 
		הערה: מאחר דג זברה ההורים במים סטטי הכתם האדום Alizarin יכול לדעוך עם הזמן, זה חשוב להבקיע שלדים בתוך ימים ספורים של השלמת הכנת השלד.</li>
		<li>Penetrance הוא היחס גנוטיפ בעל פנוטיפ. לחשב את אחוז penetrance לפי הנוסחה הבאה: % penetrance = (מוטציות עם פנוטיפ) / (מספר כולל של מוטציות) × 100</li></ol></li></ol> 3. בחירת המשפחה penetrance גבוהה <ol><li>בחר שתי, שתי משפחות penetrance נמוך עבור הדור הבא. בנוסף penetrance, חשוב לשקול פוריות, מרץ כאשר בוחרים אילו משפחות להפיץ; ראה דיון לקבלת פרטים נוספים על זה.</li>
	<li>לתת כל זוג הורים מזהה מלאי sub: המשפחה.01,.02, וכו</li>
	<li>בית זוגות הורים במערכת המרכזית בסקס מעורב מספר &#39; לוויה &#39; דגים. לוויה דגים יכולים להיות כל קו דג זברה עם תכונות מזהות קבוע, ברור, כגון מבנה פיגמנטציה או סנפיר שינו. 
	הערה: בעוד חוקרים רבים לשמור בהצלחה רק זוגות בתוך מיכל רבייה, תוצאות חיוביות נראים על ידי דיור זוגות עם כמה דגים לוויה. שלב אופציונלי זה מאפשר זוגות של חיות יוחזקו בבתי ספר גדולים יותר, לאחזר בקלות אז הם יכולים להיות שוב ושוב חצו כנדרש. זוגות הורים ניתן חצה שוב ושוב כדי ליצור משפחות גדולות מלא-אחים; לחכות לפחות שבוע לפני חוזר חוצה את אותו זוג הורים-</li>
	<li>ללקט את המשפחות הזחל מ שלב 2.2.2. אשר לא נבחרו עבור הדור הבא.</li>
	<li>תווית המיכלים המכילים את הזחלים פראי-סוג אחים ממשפחות שנבחרו עם penetrance של אחיהם מוטציה ולגדל לבגרות כרגיל.</li>
	<li>הדור הבא יהיו לפחות ארבע משפחות מלא-אחים, 2 עבור שורת כלפי מעלה ו-2 עבור שורת כלפי מטה-</li>
	<li>כאשר הזחלים מגיעים לבגרות מינית, חזור על פרוטוקול החל השלב הראשון עם הדור החדש.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca.">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li><li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism,+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+(HDR).">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li><li>Cox, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+variant+histone+H3.3+for+ectomesenchyme+potential+of+the+cranial+neural+crest.">An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).</li><li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mef2ca+in+developmental+buffering+of+the+zebrafish+larval+hyoid+dermal+skeleton.">Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton.</a> Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).</li><li>McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Craniofacial+Morphogenesis+in+Zebrafish+Using+4D+Confocal+Microscopy.">Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190 (2014).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Lush, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progeny+test+and+individual+performance+as+indicators+of+an+animal's+breeding+value.">Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value.</a> J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).</li><li>Lerner, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).</li><li>Shinya, M., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Highly+Homogeneous+Strains+of+Zebrafish+Through+Full+Sib-Pair+Mating.">Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating.</a> G3. 1 (5), 377-386 (2011).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).</li><li>Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Efficient+Zebrafish+Genotyping+Using+PCR+with+High-resolution+Melt+Analysis.">Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).</li><li>He, C., Holme, J., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping:+the+KASP+assay.">SNP genotyping: the KASP assay.</a> Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).</li><li>Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+Kompetitive+Allele+Specific+PCR+(KASP):+overview+of+the+technology+and+its+application+in+crop+improvement.">Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement.</a> Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).</li><li>Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+high+throughput+and+cost+effective+SNP+genotyping+platforms+in+soybean.">Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean.</a> Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Schilling, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw+and+branchial+arch+mutants+in+zebrafish+I:+branchial+arches.">Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches.</a> Development. 123, 329-344 (1996).</li><li>McCune, A. R., Carlson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+ways+to+lose+your+bladder:+common+natural+mutants+in+zebrafish+and+widespread+convergence+of+swim+bladder+loss+among+teleost+fishes.">Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes.</a> Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).</li><li>Mrakov&#269;i&#269;, M., Haley, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbreeding+depression+in+the+Zebra+fish+Brachydanio+rerio+(Hamilton+Buchanan).">Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan).</a> J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).</li><li>Charlesworth, D., Willis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+inbreeding+depression.">The genetics of inbreeding depression.</a> Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).</li><li>McCune, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+genomic+number+of+recessive+lethals+in+natural+populations+of+bluefin+killifish+and+zebrafish.">A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish.</a> Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).</li><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+social+behavior+in+young+zebrafish.">Development of social behavior in young zebrafish.</a> Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).</li><li>Eames, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FishFace:+interactive+atlas+of+zebrafish+craniofacial+development+at+cellular+resolution.">FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution.</a> BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).</li><li>Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=barx1+represses+joints+and+promotes+cartilage+in+the+craniofacial+skeleton.">barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton.</a> Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).</li><li>Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edn1+and+hand2+Interact+in+early+regulation+of+pharyngeal+arch+outgrowth+during+zebrafish+development.">edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development.</a> PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ברירה מלאכותית חשפה הדקויות של הפונקציה ג'ין
הסטה פנוטיפים מוטציה כדי להיות יותר או פחות חמור על ידי ברירה מלאכותית היא דרך פשוטה לקבל תובנות חדשות הגן פונקציה. כאשר לעומת בשיטות סטנדרטיות של גידול שלא נבחרו, פרוטוקול המובאת כאן יכולות להניב הבנה יותר מלאה של פנוט?...

דג זברה היא מערכת מודל רב עוצמה להבנת התפתחות השלד. עם דג זברה מוטנטים זנים, ביולוגים יכולה לפענח תפקוד הגן במהלך skeletogenesis. עם זאת, דג זברה מוטנטים פנוטיפים השלד יכול להציג עם משתנה penetrance1,2,3,4 אשר יכול לעכב ניתוחים גנטיים ובעיות התפתחותיות. מטרת שיטה זו הוא פי שלושה. ראשית, יצירת קווי מוטציה דג זברה אשר מייצרים באופן עקבי פנוטיפים חמור מאפשר מחקרים התפתחותיים במורד הזרם כמו הקלטה זמן לשגות5 והשתלת6. אלה מיני מחקרים, יכול להיות נכה-ניסיון ללמוד פנוטיפים רק לידי ביטוי באופן בלתי עקבי. שנית, הניחוש הראשון שלי דג זברה זנים יכול להפחית וריאציה הרקע הגנטי, ובכך לקדם הפארמצבטית והעקביות ניסיוני. לדוגמה, ביצוע כל רגע בחיי עיר הכלאה ניתוחים על זן טבעי סלקטיבי אחד יכול להפחית את השתנות מבלבלים ולחזק את המסקנות. שלישית, יצירת זנים קשות ורכות תחשוף את הסידרה פנוטיפי כולה יכולה לנבוע מוטציה מסוימת.
במבט ראשון, ברירה מלאכותית של מוטציות קטלני נראה בלתי אפשרי. איך זן אחד של penetrance כאשר בעלי החיים הם הבקיע עבור הבחירה מתים? למרבה המזל, שיטות ריבוי סלקטיבי לפי בחירה משפחה, במיוחד רומא בדיקות, הדגימו יעילות תוכניות עבור שנים רבות7,8לגידול בעלי חיים. תוכניות אלה משמשים בעיקר מלאכותית עבור התכונות קיימים רק מין אחד, כמו ייצור החלב בפרות או ייצור הביצים של התרנגולות. הזכרים של המינים הללו לא הבקיע ישירות, אבל הצאצאים שלהם הם הבקיע, לאחר מכן, ערך מוקצית עם ההורים. מגזרים של אסטרטגיה זו, פרוטוקול המובאת כאן כרוכה הבקיע את קבוע, מיטה צאצא מוטציה של זוג דג זברה כי הם משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור הגן המוטנטי עניין. Penetrance של הפנוטיפ של צאצא מוטציה קטלנית homozygous מוקצה ההורים כאשר מחליטים אנשים אשר יהיה לייצר את הדור הבא של הקו. אנו מוצאים כי שיטה זו היא אמצעי יעיל של הסטה penetrance דג זברה מוטנטים השלד קטלני1.
בדומה מחקרים אחרים, פרוטוקול ריבוי סלקטיבי זה לוקח תחת שיקול קריטריונים כמו גודל תטולה, ההישרדות של הצאצאים, התפתחות תקינה של העוברים, יחס9. עם זאת, גורמים אלו כל נחשבים בהקשר של רקע מוטציה עם המטרה של הסטה של penetrance מוטציה. לכן, פרוטוקול זה מרחיב פרדיגמות מלאכותית הקודם על-ידי המציע שיטה כדי לחזק ניתוחים מוטציה התפתחותית, כמו גם להגביר את הרקע הומוגניות.
פרוטוקול זה דורש genotyping נרחב, לכן חשוב לפתח פרוטוקול אמין, מהיר genotyping מראש. ישנם רבים genotyping הפרוטוקולים הזמינים10,11, עם זאת אנו מוצאים את KASP genotyping12,13,14 הוא מהיר יותר, עלות גבוהה יותר יעילה ואמינה יותר מאשר שיטות מבוסס על אנזים הגבלה המחשוף של רצפי מוגבר10. לכן, אנו כוללים את פרוטוקול KASP בעבודה זו. בנוסף, אנו מתמקדים השלד פנוטיפים מוטציה בפרוטוקול זה, לכלול הליך של אדום כחול/Alizarin Alcian מכתים ששונה בין הפרוטוקולים הקודמים15.
השיטה המתוארת כאן היא אסטרטגיה פשוטה עבור העברת penetrance מוטציה קטלנית כלפי מעלה או כלפי מטה. בעוד פרוטוקול זה מתמקד פנוטיפים מוטציה השלד, אנו מאמינים שזה יהיה שימושי אסטרטגיה האחזקה של כל הקווים דג זברה מוטנטים. למעשה, התועלת של אסטרטגיה זו רבייה סביר חורג דג זברה. אנו צופים כי פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להזיז penetrance במגוון רחב של אורגניזמים. הסטה penetrance קטלני על-ידי בדיקת רומא יכול לעזור לדחוף קדימה את ההתקדמות של כל חוקר גנטיקה התפתחותית.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde, pelleted, solid</td><td>Ted Pella Co.</td><td>18501</td><td>Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, solid</td><td>Acros Organics</td><td>223210010</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, Aqueous</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>190 proof Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue, solid</td><td>Anatech Ltd.</td><td>867</td><td>Must be from Anatech</td></tr><tr><td>Alizarin Red, solid</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP229 1</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP263500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide,&amp;nbsp; solid</td><td>Fisher</td><td>P250 500</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-time PCR Machine</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; seal</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>KASP Master Mix, High ROX</td><td>LGC</td><td>KBS-1016-022</td><td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td></tr><tr><td>KASP By Design Primer Mix</td><td>LGC</td><td>KBS-2100-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl, solid</td><td>Fisher</td><td>BP153 500</td><td></td></tr><tr><td>potassium chloride, solid</td><td>Fisher</td><td>BP366 500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP337 100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700 100</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Drop Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>for DNA quantitation</td></tr></tbody></table>

shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing

דג זברה מוטנטים פנוטיפים לעיתים קרובות שהיישום penetrant, מתבטא רק בכמה מוטציות. מעניין פנוטיפים המופיעים באופן בלתי עקבי יכול להיות קשה ללמוד, יכול להוביל משתנה מתערב תוצאות. פרוטוקול המתואר כאן הוא פרדיגמה הרבייה פשוטה כדי להגדיל או להקטין penetrance של מוטציות שלד דג זברה קטלני. כי מוטציות קטלני לא יכול להיות bred סלקטיבי ישירות, האסטרטגיה הקלאסי ברירה מלאכותית של רומא בדיקות הוא מועסק. שיטה זו כוללת גם פרוטוקולים עבור דג זברה genotyping Kompetitive אלל PCR ספציפיים (KASP), צביעת דג זברה זחל סחוס ועצם. יישום האסטרטגיה גידול שמתואר כאן יכול להגביר את penetrance של פנוטיפ השלד מעניין הפעלת עוד תוצאות לשחזור ביישומים במורד הזרם. בנוסף, הפחתת את penetrance מוטציה באמצעות אסטרטגיה זו ברירה מלאכותית יכול לחשוף תהליכים התפתחותיים רוב מכריע דורשות בפונקציה של גן שעבר מוטציה. בעוד השלד במיוחד נחשב כאן, אנו מציעים כי מתודולוגיה זו יהיה שימושי עבור כל השורות דג זברה מוטנטים.

פרוטוקול זה היא טכניקה גידול לטווח ארוך שימושי עבור הבנה דג זברה מוטנטים השלד (איור 1). ברירה מלאכותית על ידי רומא בדיקות אמור להניב משמרת ב- penetrance הכללית כלפי מטה והן כלפי מעלה תוך מספר דורות (איור 2). בעבודה הקודמת, שני סיבובים של ברירה מלאכ?...

Watch this Scientific Journal Video about Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing at JoVE.com

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

המטרה של פרוטוקול זה היא לשנות את penetrance של פנוטיפים קטלני השלד מוטציה בדג זברה באמצעות ברירה מלאכותית. מוטציות קטלני זין לבגרות וגדלתי עצמם, לכן פרוטוקול זה מתאר שיטת מעקב ובחירה penetrance לאורך הדורות מרובים על-ידי רומא בדיקות.

הסטה דג זברה קטלני השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

shifting-zebrafish-lethal-skeletal-mutant-penetrance-progeny

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Developmental Biology

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

7.5K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus. המטרה של פרוטוקול זה היא לשנות את penetrance של פנוטיפים קטלני השלד מוטציה בדג זברה באמצעות ברירה מלאכותית. מוטציות קטלני זין לבגרות וגדלתי עצמם, לכן פרוטוקול זה מתאר שיטת מעקב ובחירה penetrance לאורך הדורות מרובים על-ידי רומא בדיקות.

Video: Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Genetics

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Cancer Research

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Biology

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...