Name: single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers
Uploaded: 2017-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers at JoVE.com

Os autores agradecer Meng Pan para revisão do manuscrito. Este trabalho é apoiado por Singapura Ministério da educação acadêmica pesquisa fundo Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) a JY; a Fundação Nacional de pesquisa através da Cingapura Mechanobiology Instituto de JY; Fundação Nacional de pesquisa, escritório, Singapura do primeiro-ministro, sob seu programa de Investigatorship da NRF (NRF Investigatorship Award no. NRF-NRFI2016-03, a JY; o fundo de investigação Fundamental para as universidades Central (2017KFYXJJ153) para H. Y.

1. preparação de DNA G4 para único-molécula esticão <ol><li>Prepare 5 &#39;-tiol rotulado e 5 &#39;-biotina etiquetado dsDNA alças por PCR usando polimerase DDNA em um modelo de ADN do fago lambda usando 5 &#39;-tiol e 5 &#39;-biotina as primeiras demão 14 ( Figura 1). As duas alças de dsDNA tem alto teor de GC (&#62; 60%) para evitar DNA derretendo quando o DNA é realizada em altas forças ou durante a distensão excessiva DNA transição 15.</li>
	<li>Produtos de PCR purify usando um kit de purificação comercial e digest com enzima de restrição BstXI de acordo com o fabricante &#39; protocolo de s.</li>
	<li>G4 ligate formando ssDNA e flanco ssDNA e dsDNA alças usando T4 DNA ligase de acordo com o fabricante &#39; protocolo s. Purificar o produto ligado por extração de gel usando um kit de purificação comercial de acordo com o fabricante &#39; protocolo de s.</li>
</ol> 2. Preparação do canal de fluxo <ol><li>lamela limpeza e superfície functionalization <ol><li>lugar inferior lamelas (#1.5, 22 mm × 32 mm) e lamelas superiores (#1.5, 20 x 20 mm) em vidro de tampa frascos (cada frasco pode segurar 7 peças de lamelas, de coloração o volume é ~ 20 mL). Enxagúe as lamelas nos vidrinhos com água destilada, 2 - 5 vezes.</li>
		<li>Add ~ 20 mL da solução de detergente de 5-40% em cada frasco e coloc então em um banho de limpeza ultra-sônica de 30 min. Enxágue com água destilada para &#62; 10 vezes para remover o detergente.</li>
		<li>Secar as lamelas nos frascos no forno (~ 150 ° C; Cuidado, quente), ou pelo gás de 2 N. Armazenar as lamelas top secas em um armário seco.</li>
		<li>Plasma de uso (O gás de 2) para limpar as lamelas na jarra por 10 min. Durante o 10 min, prepare-se 20 mL da solução a 1% (3-aminopropil) triethoxysilane (APTES) em metanol (cuidado, tóxico/inflamável). Usar uma coifa química para dissolver APTES em metanol. 
		Nota: Evite a umidade ao armazenar a solução APTES. APTES velho muitas vezes causa problema na superfície funcionalização de lamelas.</li>
		<li>Imediatamente após o plasma limpeza, adicionar todas da solução APTES 1% para os vidrinhos e incubar por 1 h. Despeje os resíduos para a garrafa de resíduos específico para 1% metanol APTES. Execute as etapas relacionadas com metanol a coifa para produtos químicos inflamáveis.</li>
		<li>Lavar os potes de uma vez com metanol e &#62; 10 vezes com água destilada e em seguida seco pelo forno (~ 150 ° C; Cuidado, quente). Armazenar as lamelas de fundo APTES revestido em um armário seco senão na utilização por até duas semanas. 
		Nota: Após cada etapa sub de 2.1.1 a 2.1.4, o processo de limpeza pode ser pausado antes da próxima etapa.</li>
	</ol></li> <li>Montar o canal de fluxo <ol><li>preparar dois &#34; espaçadores &#34;, ou seja, parafilm ou dobro-lado fita (~ 4 mm × 20mm) para cada canal. Coloque os dois pedaços de espaçadores sobre uma lamela inferior ao longo da borda longa. Coloque o espaçador, formando uma célula de fluxo entre uma lamela superior (~ área 10 mm × 20mm, Figura 2A , B).</li>
		<li>Se parafilm é usado como um espaçador, coloque o canal do fluxo sobre um aquecedor (60-120 ° C; Cuidado, quente) por 5-10 s pressionando suavemente os lados da lamela superior para unir as duas lamelas por parafilme. O canal de fluxo resultante tem uma altura de ~ 100 µm, e desse modo o volume do canal é ~ 20 µ l.</li>
		<li>Selar a borda longa do canal com cola de silicone para evitar fugas. Use cola de silicone para fazer uma pequena estrutura de pia em cada borda aberta do canal de fluxo, que serve como uma entrada e uma saída da solução. 
		Nota: A entrada e saída também podem ser feitas por outros meios, por exemplo, por anéis de plástico pequenos aderente usando cera.</li>
		<li>Armazenar canais em um armário seco por até 4 semanas.</li>
	</ol></li> <li>DNA baraço para a superfície inferior do canal de fluxo <ol><li>diluir as esferas de poliestireno revestido amino (diâmetro: 3 µm) por 200 X em água destilada 1 X fosfato tamponado tampão salino (PBS). Vórtice a solução do grânulo e então fluxo em canais. Incubar a solução do grânulo em canais para ~ 30 min. Retire qualquer surpresa desagradável grânulos por lavagem com 200 µ l de 1 tampão PBS X.</li>
		<li>Ajuste (aumentar/diminuir) o tempo de incubação para atingir uma densidade de superfície dos grânulos de 1-5 por área de 50 x 50 mm. Armazenar os canais depositados com os grânulos de referência até 3 dias.</li>
		Sulfosuccinimidyl <li>dilua 4-(N-maleimidomethyl) ciclo-hexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC) pó para solução de PBS X 1 (~ 0,5 mg/mL). Vórtice a solução e em seguida fluxo dentro do canal. 
		Nota: Preparar a solução de Sulfo-SMCC fresca antes da utilização e adicioná-lo imediatamente para o canal para evitar a hidrólise da SMCC.</li>
		<li>Incubar a solução SMCC no canal de 30 min. Remove a solução SMCC lavando com uma grande quantidade (mL 1, ~ 50 X o volume do canal) de 1 solução de PBS X. 
		Nota: Lave o excesso SMCC cuidadosamente. Esta etapa é essencial para a ligação do DNA na lamela.</li>
		<li>DNA amarrar <ol><li>diluir o tiol-biotina rotulado de DNA em 1X PBS, com uma concentração de DNA resultante de ~ 0,3 nM. Pipetar delicadamente para misturar a solução, a solução de DNA de fluxo dentro do canal SMCC-revestido e incubar durante 30 min à temperatura ambiente (~ 23 ° C).</li>
		</ol></li> <li>Lavar delicadamente DNA livre com 200 µ l de solução que contém 1X PBS com 10 mg/mL albumina de soro bovino (BSA) e 0,01% de 2-Mercaptoetanol de bloqueio.</li>
		<li>Bloco a superfície do canal incubando o canal em solução (10 mg/mL BSA, 0,01% 2-Mercaptoetanol) de bloqueio para &#62; 2 h; após este passo, o canal está pronto para as experiências. O canal preparado pode ser mantido a 4 ° C para ~ 1 dia. 
		Nota: A etapa de bloqueio é importante para a redução da ligação não-específica de DNA e grânulos magnéticos para as lamelas.</li>
	</ol></li></ol> 3. Magnético pinças instalação e identificação de único dsDNA Tether <ol><li>instalação de pinça magnética <ol><li>iniciar o magnético pinças controlam o programa. Aqui, a pinça magnética eram controlada por um programa LabVIEW escrito casa.</li>
		<li>Alinhar os centros do ímã antes de montar o canal. Use uma lente de objetivo 4 X para ajustar para o x - e eixo y dos ímãs no eixo óptico do microscópio.</li>
		<li>Usar um manipulador motorizado controlado por computador para mover os ímãs na direção-z ( Figura 2A) e defina a distância como d = 0 (d: distância entre os ímãs e lamela) quando os ímãs anexar a uma lamela no microscópio.</li>
		O movimento dos ímãs através da manipulação para conseguir o controle da força, incluindo a força constante (ou seja, constante d) do programa de <li>e tempo variando a força F (t) (ou seja, variando o tempo d(t )).</li>
		<li>Brilhante use uma fonte de luz do diodo emissor de luz (LED) para a iluminação difusa de volta do cordão com o objetivo de. Recolher as imagens do grânulo, a uma taxa de amostragem de 100 Hz por uma câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD). < / lEu ></ol></li> <li>configuração da amostra e identifique o baraço dsDNA único <ol><li>formação Tether <ol><li>suavemente o fluxo em 200 X diluído grânulos M-280, paramagnéticos na solução de ensaio (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10mm Tris-pH 7,4 ) para um canal. Incube durante 10 minutos permitir que os grânulos vincular a biotina-rotulado moléculas de DNA imobilizadas na superfície de SMCC-revestido através da extremidade do thiol-rotulados. Lavar delicadamente grânulos un-amarrados usando 200 µ l da solução de reação padrão. 
			Nota: Os grânulos de M-280 mostram menor ligação não específica para a superfície em comparação com outros grânulos magnéticos comerciais tais como M-270.</li>
		</ol></li> <li>Montar o canal para o palco do microscópio. Pesquisa para os grânulos na superfície de fundo usando o 100 X objetivo de imersão de óleo.</li>
		<li>Selecione um grânulo de referência na superfície e um grânulo amarrado em movimento. Construir as bibliotecas de imagem inicial do grânulo de referência e do grânulo amarrado em aviões diferentes desfocagem.</li>
		<li>Calibração da imagem de grânulos <ol><li>antes de experimentos, use um atuador piezo objetiva para obter imagens de referência e grânulos amarrados em aviões diferentes desfocagem espaçadas de 20-50 nm, que são armazenados como dois imagem separada do grânulo bibliotecas e são respectivamente indexados com a distância de desfocagem ( Figura 2D).</li>
		</ol></li> <li>x, y, determinação de posição z <ol><li>durante as experiências, determinar a posição do cordão de no plano x-y pelo centroide do grânulo. Determine a mudança de altura do cordão amarrado de comparando a imagem atual do grânulo com aqueles armazenados na biblioteca. Usar a análise de função autocorrelação do espectro de energia da transformada de Fourier do grânulo imagens 16.</li>
		</ol></li> <li>Do ADS gabarito usando a conta de referência <ol><li>durante as experiências, usar o piezo para &#34; bloqueio &#34; a distância entre o objectivo e uma imagem de grânulo de referência específicas armazenadas na biblioteca através de uma frequência baixa controle de gabarito, para que a imagem do grânulo preso tem a melhor correlação com uma imagem específica armazenada na biblioteca ( Figura 2D).</li>
		</ol></li> <li>Determinar se o baraço é uma molécula única dsDNA aplicando ~ 65 pN força determinar uma molécula dsDNA único se o baraço sofre o ADN característico distensão excessiva transição 17 , 18 , 19. Repita o processo até que seja encontrado um única dsDNA baraço. (Consulte a próxima seção para calibração de força e DNA distensão excessiva transição).</li>
	</ol></li></ol> 4. Calibração de força de pinça magnética <ol><li>determinar diretamente a força (até 100 pN) para longa (λ 48.502 bp-DNA) as moléculas de DNA utilizando a flutuação do grânulo através de: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq1.jpg" /> , onde k B é a constante de Boltzmann, T é a temperatura na escala Kelvin, δ 2 y é a variância de flutuação do grânulo na direção perpendicular ao campo magnético e a força direção. Nesse sentido, o movimento da esfera pode ser descrito como uma flutuação de pêndulo com um comprimento de l + r 0, onde l é a distância de ponta a ponta na direção da força (extensão) do DNA, e é r 0 o raio do grânulo 10 ( Figura 3A).</li>
	<li>Determinar a curva de calibração para a força F como uma função de ímãs para distância do grânulo, d e F (d) para contas diferentes usando o longo λ-DNA. Geralmente, a distância entre o ímã e a lamela é usada como o comprimento do cabo do DNA pode ser ignorado. Encaixar o F-d curva pela função dupla-exponencial de decaimento: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq2.jpg" /> , onde o encaixe parâmetros α1, α2, γ1, γ2 são determinados pela pinça magnética e o parâmetro C é determinada pela propriedade heterogênea dos grânulos magnéticos. Deslocando o C, o F-d curva Obtida de missanga diferentes pode ser sobreposto 10 ( Figura 3B).</li>
	<li>Experimentos de calibração de parâmetro C para esferas magnéticas individuais para curto ADN.
	<ol><li>Determinar a força baseada a flutuação requer gravação da posição do grânulo em uma frequência maior do que a frequência de canto: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq3.jpg" /> , onde γ é o arrasto coeficiente do talão. Para DNA curta em alta força, requer frequência de gravação mais rápido do que 100 Hz, portanto, a força não pode ser medida diretamente com base na flutuação com a câmera. No entanto, o parâmetro C pode ser determinada medindo a força em uma baixa força gama (&#60; pN 15) utilizando a flutuação e encaixe os dados com um calibrado F-d curva para obter o parâmetro C 20.</li>
		<li>, Alternativamente, para experiências com dsDNA, determinar o parâmetro C usando DNA distensão excessiva transição com uma força de ~ 65 pN ( Figura 3) 21 , 22 , 23, gravando a posição d no qual salto de extensão mostrou dsDNA (0,6 X aumento de comprimento de comprimento de contorno). Depois de determinar o parâmetro C, calcular a força para os grânulos amarrados.</li>
	</ol></li> <li>Controlar a taxa de carregamento através da programação do movimento dos ímãs através da função inversa de F (d). O ímã deve aproximar a amostra dupla exponencialmente. 
	Nota: O erro relativo da força determinada por tal um método de extrapolação é ~ 10% e é causada principalmente pelo raio de grânulo heterogeneidade 20.</li>
</ol> 5. Único-molécula manipulação do G4 na presença e na ausência de ligação a proteínas <ol><li>força-rampa experimentos <ol><li>depois de identificar o baraço dsDNA, executar uma verificação de aumento de força a uma taxa de carregamento de 0.2 pN/s seguido de um verificação de força-falecimento em-0.2 pN/s. Após cada ciclo de alongamento, segure a molécula de DNA em 1 pN por 30 s para permitir que o ssDNA a redobrar a G4.</li>
	</ol></li> <li>Experimentos de força-salto <ol><li>a força do ciclo entre 54 pN por 30 s sob as quais um G4 dobrado pode ser desdobrado e 1 pN para 60, sob a qual um G4-15T dobrado pode redobrar.</li>
	</ol></li> <li>Solução de proteína flui <ol><li>fluxo de solução da proteína quando em ~ 20 pN força para evitar o apego dos grânulos a lamela. A helicase DEAH-caixa RHAU, que mostrou alta especificidade para a estrutura de G4, foi usado 24. A Drosophila melanogaster RHAU (DmRHAU) helicase recombinante foi expressa em Escherichia coli e purificado conforme descrito anteriormente, 25. O G4 atividade desenrolamento de DmRHAU foi analisada em um tetramoleculares G4 ADN substrato 13.</li>
	</ol></li> <li>Analisar a desdobramento força usando um in-house escrito Matlab programa 14.</li></ol>

<ol>
	<li>Rhodes, D., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes+and+their+regulatory+roles+in+biology.">G-quadruplexes and their regulatory roles in biology.</a> Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).</li><li>Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+quadruplex-binding+proteins.">DNA and RNA quadruplex-binding proteins.</a> Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).</li><li>Gonzalez, V., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminus+of+nucleolin+promotes+the+formation+of+the+c-MYC+G-quadruplex+and+inhibits+c-MYC+promoter+activity.">The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity.</a> Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=telomerase-interacting+protein+that+unfolds+telomere+G-quadruplex+and+promotes+telomere+extension+in+mammalian+cells.">telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).</li><li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes+and+helicases.">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li><li>Schiavone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+Is+Required+for+Replicative+Tolerance+of+G+Quadruplexes+in+Vertebrate+Cells.">PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells.</a> Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).</li><li>Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+kinetics+of+G-quadruplex+structures.">Stability and kinetics of G-quadruplex structures.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).</li><li>Woodside, M. T., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+folding+energy+landscapes+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy.</a> Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+high-force+magnetic+tweezers+for+stretching+and+refolding+of+proteins+and+short+DNA.">Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA.</a> Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+equilibrium+folding+and+unfolding+transitions+of+titin+immunoglobulin+domain+under+constant+forces.">Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces.</a> J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).</li><li>You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+kinetics+of+c-MYC+promoter+G-quadruplexes+studied+by+single-molecule+manipulation.">Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation.</a> J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).</li><li>You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RHAU+helicase+stabilizes+G4+in+its+nucleotide-free+state+and+destabilizes+G4+upon+ATP+hydrolysis.">RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).</li><li>You, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+stability+of+polymorphic+human+telomeric+G-quadruplex+under+tension.">Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension.</a> Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).</li><li>Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+states.">Two distinct overstretched DNA states.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).</li><li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers:+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level.">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching.">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li><li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements.">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA,+melting+bubbles,+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry.">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+High-Force+Magnetic+Tweezers+for+Stretching+and+Refolding+of+Proteins+and+Short+DNA.">Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA.</a> Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).</li><li>Fu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching.">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li><li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements.">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA,+melting+bubbles,+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry.">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li><li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates.">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li><li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA.">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+magnetic+tweezers.">Recent advances in magnetic tweezers.</a> Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).</li><li>Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-field-magnetic-tweezer+manipulation+of+single+DNA+molecules.">Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).</li><li>Le, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbance-free+rapid+solution+exchange+for+magnetic+tweezers+single-molecule+studies.">Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies.</a> Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).</li><li>Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadruplex+Nucleic+Acids+as+Novel+Therapeutic+Targets.">Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets.</a> J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).</li><li>Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes:+Emerging+roles+in+neurodegenerative+diseases+and+the+non-coding+transcriptome.">G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).</li><li>Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+G-quadruplexes+in+gene+promoters:+a+novel+anticancer+strategy?.">Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).</li><li>Amato, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+Development+of+Specific+G-Quadruplex+Binders:+Synthesis,+Biophysical,+and+Biological+Studies+of+New+Hydrazone+Derivatives.">Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives.</a> J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).</li><li>Wells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-B+DNA+conformations,+mutagenesis+and+disease.">Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease.</a> Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Conforme descrito acima, uma plataforma para estudar a estabilidade mecânica do ADN do G4 e as interações da proteína para G4 usando pinças de único-molécula magnética é relatada. Que acompanha a plataforma, são desenvolvidos protocolos altamente eficientes de encontrar DNA G4 baraço e medição da dobradura-revelação dinâmica e estabilidade da estrutura G4 com resolução especial nanômetros. O plano focal de travamento permite controle de anti drift altamente estável, que é importante para a detecção...

Quatro-hélice do DNA ou RNA G4 estruturas desempenham um papel crítico em muitos processos biológicos importantes1. Muitas proteínas envolvidas no G4 vinculação e regulamento, incluindo proteínas obrigatórias do telômero (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, fatores de transcrição (nucleolin, PARP1)3, proteínas (hnRNP A1, de processamento de RNA hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, AVI, Dna2, Pif1)5e replicação de DNA relacionadas com proteínas (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Emperramento da proteína pode estabilizar ou desestabilizar estruturas G4; assim, regula as funções biológicas subsequentes. A estabilidade do G4 foi medida por térmica fusão usando radiação ultravioleta (UV) ou de métodos de Dicroísmo circular (CD)7. No entanto, tais condições não são fisiológicas relevantes e são difíceis de aplicar para estudar os efeitos de ligação a proteínas7.
O rápido desenvolvimento em tecnologias de manipulação do único-molécula permitiu estudos de dobramento e desdobramento de uma biomolécula, tais como um DNA ou uma proteína, a um nível único-molécula com resolução nanômetros em tempo real8. Microscopia de força atômica (AFM), pinça óptica e pinças magnéticas são os mais comumente usados métodos de manipulação de único-molécula. Comparado a AFM e pinça óptica9, pinça magnética permite medições estáveis de dobradura-revelação dinâmica de uma única molécula de dias usando uma técnica do ADS10,11.
Aqui, uma plataforma de manipulação do único-molécula usando uma pinça magnética para estudar a regulação da estabilidade do G4 por proteínas de ligação é relatado12,13. Este trabalho descreve as abordagens básicas, incluindo a preparação de amostra e fluxo de canal, a instalação de uma pinça magnética e a calibração de força. O controle de força e os protocolos do ADS como descrito no passo 3 permitem medições em longo tempo sob diversos controles de força, tais como a força constante (braçadeira de força) e constante carregando taxa (força-rampa) e medição de força-salto. O protocolo de calibração de força descrito na etapa 4 permite a calibração de força do &#60; 1 µm curto baraços ao longo de uma vasta força variam até 100 pN, com um erro relativo dentro de 10%. Um exemplo de regulamento da estabilidade do RNA Helicase associado com AU-rico elemento (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1) que tem um papel essencial na resolução de que RNA G4 é usado para demonstrar as aplicações desta plataforma13.

<table><tbody><tr><td>DNA PCR primers</td><td>IDT</td><td></td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>DNA PCR chemicals</td><td>NEB</td><td></td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>restriction enzyme BstXI</td><td>NEB</td><td>R0113S</td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)</td><td>BMH.BIOMEDIA</td><td>72204</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Decon90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td></td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>440140-500ML</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22322</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>M-280, paramganetic beads,streptavidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11205D</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Polybead Amino Microspheres 3.00 &amp;mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17145-5</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250-250ML</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Olympus Microscopes IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Piezo-Z Stages P-721</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-721</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON-Oil 100X</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>CCD/CMOS camera</td><td>AVT</td><td>Pike F-032B</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Translation linear stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>MoCo DC</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Cubic Magnets</td><td>Supermagnete</td><td></td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>OriginPro/Matlab</td><td>OriginLab/MathWorks</td><td></td><td>Data analysis</td></tr></tbody></table>

single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers

Estrutura secundária não-canônicos do ácido nucleico que g-quadruplexes (G4) estão envolvidos em diversos processos celulares, tais como a replicação do DNA, transcrição, processamento de RNA e alongamento do telômero. Durante estes processos, várias proteínas ligam e resolver estruturas G4 para desempenhar a sua função. Como a função do G4 muitas vezes depende da estabilidade de sua estrutura dobrada, é importante investigar como proteínas obrigatórias do G4 regulam a estabilidade do G4. Este trabalho apresenta um método para manipular o único G4 moléculas usando uma pinça magnética, que permite estudos do Regulamento das proteínas de ligação G4 em uma única molécula de G4 em tempo real. Em geral, este método é adequado para uma ampla gama de aplicações em estudos para interações de proteínas/ligantes e regulamentos sobre várias estruturas secundárias DNA ou RNA.

A montagem da experiência de uma única molécula de G4 de alongamento é mostrada na Figura 4. Uma sequência de formação single-stranded G4 que se expandiu entre duas alças de dsDNA foi amarrada entre uma lamela e um grânulo paramagnético. Para encontrar uma pérola de dsDNA único amarrados, realizou-se um ensaio overstretching, aumentando a força em taxas de carga constante. Três tipos de medidas muitas vezes foram usados para estudar o dobramento...

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers at JoVE.com

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Uma plataforma de único-molécula magnética pinças para manipular G-quadruplexes é relatada, o que permite o estudo da estabilidade de G4 e regulamento por várias proteínas.

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

single-molecule-manipulation-of-g-quadruplexes-by-magnetic-tweezers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K visualizações.  Huazhong University of Science and Technology. Uma plataforma de único-molécula magnética pinças para manipular G-quadruplexes é relatada, o que permite o estudo da estabilidade de G4 e regulamento por várias proteínas.

Vídeo: Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Uma Abordagem DNA afinidade G-quadruplex para a purificação de enzimaticamente activa G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Bioquímica

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Bioengenharia

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinças magnéticas para a Medição do Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Identificando G-Quadruplexes em um modelo de DNA usando mapeamento químico

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Autor em destaque: Caracterizando o DNA G-Quadruplex por mapeamento químico baseado em bis-3-cloropiperidina 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In vitro Mapeamento químico de estruturas do DNA G-Quadruplex por bis-3-cloropiperidinas;

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Uma Abordagem DNA afinidade G-quadruplex para a purificação de enzimaticamente activa G4 Resolvase1

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

Pinças magnéticas para a Medição do Twist and Torque

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

In vitro Mapeamento químico de estruturas do DNA G-Quadruplex por bis-3-cloropiperidinas;

In vitro Mapeamento químico de estruturas do DNA G-Quadruplex por bis-3-cloropiperidinas;

In vitro Mapeamento químico de estruturas do DNA G-Quadruplex por bis-3-cloropiperidinas;

Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força