Name: mass isolation and in vitro cultivation of intramolluscan stages of the human blood fluke schistosoma mansoni
Uploaded: 2018-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni at JoVE.com

מומן בחלקו על ידי מענק-NIH RO1AI015503. עכברים נגועים schistosome נמסרו על ידי המרכז משאב NIAID בילהרציה מכון המחקר הביו-רפואי (Rockville, MD) דרך NIH-NIAID חוזה HHSN272201000005I להפצה באמצעות משאבים BEI.

כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון תחת פרוטוקול אין. V005717. להלן כללי התנהגות כרוך עובד במתקן אבטחה ברמה 2 (BSL2) עבור האדם פתוגנים, אף אחד השלבים schistosome מצטיירת פרוטוקול זה אמנם זיהומיות בני אדם או יונקים אחרים. בצע את מדיניות מוסדית לטיפול פתוגנים האנושי הסיכון קבוצה 2 (RG2).
הערה: אנו משתמשים הנשי עכברים שוויצרי-וובסטר (6 - בן שבועיים) עקב הרגישות שלהם גבוה יותר זיהום10, ובכך מניב בנטל ביצה גדולה יותר. טאקר. et al. תאר את הפרוטוקולים זיהום עכבר וחילזון המשמשים את מערכת דגם11. טבלה של חומרים מפורטים כל ציוד ספציפי, חומרים, ריאגנטים, מקורות בעלי חיים צריכה לבצע פרוטוקול ניסיוני זה.
1. עיבוד של כבדי נגוע
<ol><li>המתת חסד עכברים, 6-7 שבועות לאחר הפגיעה, בעזרת CO2 (בשיעור של 10-30% נפח החדר לדקה). לפקח על עכברים על הפסקת נשימה, פעימות הלב. הערה: בדרך כלל, עד 20 עכברים יכול לעבד בזמן נתון.</li>
	<li>לאחר העברת עכברים לאללה אבטחה cabinet, במקום עכברים על גבם, לרסס משטחים הגחון שלהם עם 70% אתנול. תן משרים למשך 1 דקות.</li>
	<li>לצבוט למשוך את העור של הבטן התחתונה, חצו הבסיס של העור צבט הקרוב ביותר אל הבטן עם מספריים כירורגיים סטרילי. משוך את העור חתוך anteriorly (קרי, לכיוון הראש) כדי לחשוף את הכבד. שים לב לכך הכבד צריך להיות מוגדל מנומר עקב ביצה-induced גרגירומת ממושכת מענה (איור 2 א).</li>
	<li>להסיר את הכבד ומניחים אותו בתוך המכיל 200 מיליליטר סטרילי 1.2% NaCl פתרון המכיל עט/סטרפ.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.3 ו 1.4 עם עכברים הנותרים. הערה: עכברים עשרים מעובדים בדרך כלל הקציר יחיד.</li>
	<li>מקם את הכבדים בצלחת פטרי סטריליות ולהסיר שומן שאינו כבד/ורקמות עם מלקחיים סטרילי.</li>
	<li>העברה כבדי חיתוך/לנקות בקבוק צנטריפוגה 250-mL סטרילי המכיל ~ 200 מ ל- 1.2% NaCl פתרון סטרילי עם עט/סטרפ.</li>
	<li>נמרצות לנער את הבקבוק המכיל את הכבדים ולהסיר, באמצעות פיפטה חד פעמי סטרילי, פני השטח עודף קצף צף פסולת. לאט לאט יוצקים את תמיסת מלח שנותרו לתוך מכולה או כיור המכיל 1% מלבין (מחטא).</li>
	<li>~ 200 מ"ל תמיסת טריים להוסיף הכבדים, חזור על שלב 1.8 שלוש פעמים נוספות.</li>
</ol>2. הכבד בידוד חילוץ ו- miracidial
<ol><li>מקם את הכבדים לתוך כוס בלנדר נירוסטה סטרילי קטן ולהוסיף ~ 2 מ"ל של 1.2% NaCl פתרון (איור 2B).</li>
	<li>לכסות את הספל עם רדיד, צלחת פטרי כדי למנוע נשפך, תערובת של 1 דקות, לסירוגין מהירות נמוך וגבוה (20 s מהירות נמוכה/10 s במהירות גבוהה; repeat) (איור 2C).</li>
	<li>פזר באופן שווה ההשעיה הכבד מעורב לתוך צנטריפוגה 250-mL סטרילי בקבוקים (עבור כבדי 20 להשתמש 4 בקבוקים).</li>
	<li>להוסיף מלח סטרילית עם אנטיביוטיקה ~ 200 מל סה כ נפח/בקבוק. שוקלים/איזון בקבוקים לפני צנטריפוגה.</li>
	<li>צנטריפוגה הכבדים מעורבב ב 290 x g למשך 15 דקות בבית 4 oC. בעדינות יוצקים את supernatants לתוך מיכל עם אקונומיקה לפני השלכת.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.4-2.5 פעם אחת. הקפד ביסודיות resuspend משקע כבד לפני צנטריפוגה.</li>
	<li>לאחר השמטת את תמיסת המלח האחרון לשטוף (שלב 2.6), להוסיף 200 מ ל מים בריכה סטרילית עם עט/דלקת רקמת הכבד pelleted, ללחוץ כדי resuspend משקעים, ולהעביר את המתלים מעוקר 1-L סטריליות זה כבר מכוסה לגמרי עם אלומיניום רדיד, למעט החלק העליון 3 ס מ של הצוואר (איור דו-ממדי). הערה: השתמש שני בקבוקים (= 10 כבדי) לכל 1-L את הבקבוק. אגם מים המדמה את הסביבה הטבעית מים מתוקים צריך לעורר miracidial הבקיעה מביצים.</li>
	<li>באמצעות מים בריכה סטרילית, למלא את הבקבוק כדי כ- 3 ס מ מעל רדיד האלומיניום מכסה על הצוואר. ואז, ללא דיחוי (כפי miracidia בקרוב מתחילות לבקוע), להסיר קצף שיורית ואת רקמת הכבד צפים אל פני השטח על ידי מהר pipetting למעלה ~ 12 מ ל מים בריכה המכילים פסולת וזורקים השמטת את זה לתוך נפרדת שפופרת. להחליף מים טריים בריכה סטרילית.</li>
	<li>חזור על 2.8 שלב הניקוי, עוד שלוש פעמים, בדיקת נוכחות של miracidia בצינור להשליך. להפסיק את החזרה על ניקוי שלב אם miracidia מופיע בהפתרון לשטוף.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה לאט להוסיף ~ 12 מ ל מים חמים בריכה סטרילית (טרום התחמם עד 30 oC) ליצירת מעבר צבע הטמפרטורה במים חמים נקי, סטרילי על העליונה. הערה: זו מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי לאט מתרוקנת מים לאורך צדי בצוואר הבקבוק כדי למנוע ערבוב.</li>
	<li>הצב כיסוי פטרי קטן מעל הפתח הבקבוק והשכם אור בהיר לרוחב החלק העליון של הבקבוק מעל השער בנייר כסף כדי להאיר את המשטח העליון של מים. הערה: בדרך כלל, בתוך 5-10 דקות, לשחות miracidia, נמשך אל האור, נתמקד במספר גדול בתוך הראשונה 2-3 ס מ של אגם המים (איור 3 א).</li>
</ol>3. Miracidial קציר והטיפוח -תרגול
<ol><li>כאשר miracidia צבר על פני השטח לאחר 10 דקות, באמצעות pipet של העברת סטרילי, להסיר ~ 8 מ של אגם מים, העברת שפופרת צנטרפוגה 15-mL סטרילי. מקם את הצינור המכיל miracidia על הקרח.</li>
	<li>להוסיף גב 8 מ ל מים חמים בריכה סטרילית לאורך החלק הפנימי של סטריליות ולא לחכות עוד 10 דקות.</li>
	<li>באמצעות צינורות חדשים בכל פעם, חזור על שלבים 3.1 ו- 3.2 שלוש פעמים נוספות. לאחר לאוסףה 4, לשמור את הצינור הסופי על קרח למשך 10 דקות לאפשר את miracidia להתיישב. קבוצה זו של צינורות כוללת הקציר הראשון.</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות המכיל miracidia ב g x 290 דקות 1-4 oC ומפרידה בקירור טרום מקורר.</li>
	<li>להסיר לאלתר את רוב תגובת שיקוע (~ 7 מ"ל) נזהר שלא להפריע בגדר טפיל (איור 3B).</li>
	<li>בריכה כל miracidia מ זה הקציר הראשון לתוך אחד צינור, ואז לשטוף את כל הצינורות המקוריים עם בריכה סטרילית ~ 1 מ"ל מים ולהוסיף הצינור"במאגר".</li>
	<li>לאפשר טפילים להתיישב על קרח ~ 5 דקות, שוב centrifuge הטפילים ב g x 290 דקות 1-4 oC.</li>
	<li>בזהירות להסיר את תגובת שיקוע והוסף שמאוזן טשערנין סטרילי של 6-8 מ ל תמיסת מלח (CBSS +; ראה טבלה של חומרים) המכיל עט/סטרפ.</li>
	<li>בעדינות להשעות את miracidia ואת aliquot אותם לתוך צלחת 24-ובכן התרבות (1 מ"ל לכל טוב), ואחריו שטיפה הצינור ב- 6-8 מ ל CBSS + הוספת 1 מ"ל של שטיפה מכל קידוח. דגירה טפילים-26 oC בתנאים normoxic. ריכוזי miracidia מבודדים משתנים, אך בדרך כלל יהיה בממוצע ~ 7000/mL.</li>
	<li>אם טפילים עדיין מתרכז ב מקור האור, חזור על השלבים 3.1 ל 3.9 להמשיך לקצור מאוחר-הבקיעה miracidia אך להגדיל את מרווח הזמן בין אוספי ל 15-20 דקות. הערה: זו קבוצה חדשה של צינורות מייצג את הקציר השני. עם זאת, כי miracidial מספרים נמוכים בדרך כלל, הזחלים משפופרות כל בדרך כלל הם איחדו לתוך תרבות טוב המכיל 2 מ"ל CBSS +.</li>
	<li>24 שעות לאחר הקציר, טיפוח, בעדינות resuspend sporocysts בבארות שלהם על-ידי pipetting.</li>
	<li>המתן מספר דקות כדי לאפשר טפילים להתיישב לתחתית הבארות. ברגע שהם התיישבו, הסר בזהירות את תגובת שיקוע (~1.5 מ"ל), אשר יכיל רוב ciliated באפידרמיס הצלחות לשפוך על ידי miracidia במהלך טרנספורמציה זחל. זה "שינוי" supernatant עשויים שנמחקו או שולבו מחקרי מעקב של מוצרים הפרשה זחל.</li>
	<li>להוסיף 1.5 מ של CBSS טריים + כל טוב, בעדינות פיפטה כדי resuspend sporocysts. חזור על שלב 3.12 אם עוד כביסה או שינוי למדיום אחר רצוי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+schistosomiasis.">Human schistosomiasis.</a> Lancet. 383, 2253-2264 (2014).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis:+number+of+people+treated+worldwide+in+2013.">Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013.</a> Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).</li><li>Yoshino, T. P., Gourbal, B., Th&#233;ron, A., Jamieson, B. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+sporocysts.">Schistosoma sporocysts.</a> Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).</li><li>Bayne, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+parasitism+of+vector+snail+Biomphalaria+glabrata+by+the+human+blood+fluke+(trematode)+Schistosoma+mansoni:+a+2009+assessment.">Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).</li><li>Yoshino, T. P., Coustau, C., Toledo, R., Fried, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+Biomphalaria-trematode+interactions.">Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions.</a> Biomphalaria snails and larval trematodes. , 159-189 (2011).</li><li>Coustau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gastropod+immunity+from+the+study+of+the+interaction+between+the+snail+Biomphalaria+glabrata+and+its+parasites:+A+review+of+research+progress+over+the+last+decade.">Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade.</a> Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).</li><li>Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+molluscan+host+resistance+and+of+parasite+strategies+for+survival.">Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival.</a> Parasitology. 123, S159-S167 (2001).</li><li>McMullen, D. B., Beaver, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+schistosome+dermatitis.+IX.+The+life+cycles+of+three+dermatitis-producing+schistosomes+from+birds+and+a+discussion+of+the+subfamily+Bilharziellinae+(Trematoda:+Schistosomatidae).">Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae).</a> Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).</li><li>Voge, M., Seidel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+vitro+of+miracidia+of+Schistosoma+mansoni+and+S.+japonicum+into+young+sprocysts.">Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts.</a> J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).</li><li>Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+mortality,+pathophysiology,+and+susceptibility+differences+in+male+and+female+mice.">Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice.</a> Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).</li><li>Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).</li><li>Basch, P. F., DiConza, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miracidium-sporocyst+transition+in+Schistosoma+mansoni:+surface+changes+in+vitro+with+ultrastructural+correlation.">The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation.</a> J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).</li><li>Hansen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+daughter+sporocysts+of+Schistosoma+mansoni:+their+occurrence+and+cultivation.">Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).</li><li>Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosome+sporocyst-killing+amoebae+Isolated+from+Biomphalaria+glabrata.">Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata.</a> J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).</li><li>DiConza, J. J., Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axenic+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts.">Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts.</a> J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).</li><li>Hansen, E. L., Maramorosch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+line+from+embryos+of+Biomphalaria+glabrata+(Pulmonata):+Establishment+and+characteristics.">A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics.</a> Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).</li><li>Yoshino, T. P., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).</li><li>Ivanchenko, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+in+vitro+propagation+and+differentiation+of+cultures+of+the+intramolluscan+stages+of+the+human+parasite+Schistosoma+mansoni.">Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).</li><li>Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molluscan+cells+in+culture:+primary+cell+cultures+and+cell+lines.">Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines.</a> Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).</li><li>Coustau, C., Yoshino, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flukes+without+snails:+Advances+in+the+in+vitro+cultivation+of+intramolluscan+stages+of+trematodes.">Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes.</a> Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).</li><li>Milligan, J. N., Jolly, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cercarial+transformation+and+in+vitro+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+schistosomules.">Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules.</a> J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoniin+vitro.+II+production+of+infertile+eggs+by+worm+pairs+cultured+from+cercariae.">Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae.</a> J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).</li></ol>

לעורכים יש דבר לחשוף.

Miracidia של S. mansoni, מבודד ולמניפולציה כמתואר להלן, יכול להדביק רק חילזון המארח ביניים, ולכן אינם מייצגים הביולוגי האנושי במהלך שלב זה של התפתחות הזחל. עם זאת, כדי למנוע חשיפה מקרית/זיהום של חלזונות, להקפיד לבצע miracidial ומשום במיקום שונה מאזורים שבו רגישים מינים חילזון Biomphalaria עשוי להיות ...

האדם דם spp. עלקת הבילהרציה פספוסים, הסוכנים סיבתי של בילהרציה, מחלה טרופית מוזנח מתעצמת משוער 230 מיליון בני אדם ברחבי העולם1. המין הנפוץ ביותר, עלקת הבילהרציה mansoni, מופץ גיאוגרפית בדרום אמריקה, האיים הקריביים, המזרח התיכון, אפריקה לסהרה2. מחזור החיים של S. mansoni, ו schistosomes אחרים, היא מורכבת, מעורבים שורה מהווים הסופית יונקים ו חלזונות מים מתוקים של הסוג Biomphalaria המשמשים כפונדקאים ביניים בלבד.
S. mansoni מבוגר זכר ונקבה תולעת זוגות המתגוררים וורידי מצע המעי העליון האחורי להתרבות בתרבית של המארח, וכתוצאה מכך שחרורו של embryonated ביציות (פשוט) זה להיות תקוע בעצם venules קטן של רירית המעי. הביצים ואז פורץ דרך הקירות כלי השיט, דרך רקמות mucosal והזן בסופו של דבר לומן מעיים היכן הם נמצאים בוטל עם הצואה. כאשר ביצית מזין את הצוהר הזחלים מים מתוקים, free-swimming (miracidia), שהם חייבים, סדר קצר, למצוא חילזון Biomphalaria מתאימים כדי להדביק על מנת להמשיך את מחזור חייו. תהליך זיהום זה כרוך miracidial מצורף משטח הגוף החיצוני של החילזון ואחריו חדירה פעיל, כניסה של הזחל לתוך המחשב המארח. זמן קצר לאחר הכניסה, miracidium מתחיל לשפוך צלחות אפידרמיס ciliated החיצוני שלה כמו צורות syncytium שיהפכו את המשטח החיצוני החדש (tegument) של הזחל הבא, sporocyst ראשי או אמא. דרך רבייה אל-זוויגית, כל sporocyst ראשית מייצרת ומשחרר דור שני של sporocysts, כינה משני או הבת sporocysts, אשר בתורו, לייצר ולשחרר מספר גדול של השלב הסופי intramolluscan, cercaria3 . על הבריחה מהמחשב המארח חילזון, free-swimming cercariae מסוגלים הצמדת וחודר ישירות על העור של האדם או אחר מתאים שורה יונקים. כשנכנסתי אל הפונדקאי החדש שלהם, cercariae להפוך לבמה schistosomula טפיליות ו לפלוש במערכת כלי הדם. הם, בתורו, נודדים הריאה ולאחר מכן את וריד הכבד שבו הם התבגרת. תולעים בוגרות, יוצרות זוגות זכר ונקבה, לנסוע אל הורידים מצע המעי העליון כדי להשלים את מחזור החיים שלהם.
מוצלחת intramolluscan או "חילזון שלב" התפתחות הזחל schistosomes חיוני המשכיות המחזור של שידור מארח למארח אנושי. חשיבות קריטית היא הערך הבא תקופה של miracidium free-swimming לתוך המחשב המארח חילזון וטרנספורמציה מוקדם שלה על הבמה הראשית sporocyst. בהתאם התאימות פיזיולוגי ו בין המארח לבין טפיל, זה במהלך שלב זה של התפתחות הזחל את ההצלחה הראשונית או כשל ליצור זיהומים הוא נחוש4,5,6 . עוקבות התפתחות מסוגל לייצר asexually sporocysts משני, אשר לאחר מכן ליצור cercariae אנוש-זיהומיות, ראשי sporocysts נוספות דורשות סביבה מארח פיזיולוגיים מתירניות מספק עבור כל הצמיחה של הטפיל, הרבייה צריך.
עד כה, מעט מאוד ידוע על הבסיסית פיסיולוגי, ביוכימי, תהליכים מולקולריים אינטראקציות schistosome-חילזון לשליטה, במיוחד מולקולות מסלולים מעורבים בוויסות התפתחות הזחל ורביה, או להתכוונן תגובות מערכת החיסון של הפונדקאי. מוכן גישה לכמויות גדולות של אלה שדרגות בתנאים in vitro לקשרי תרבות כי היתר מניפולציה ניסויית מאוד להקל על הגילוי של מסלולים התפתחותית ומנגנונים הבסיסית של צמיחת תאים, בידול רבייה... נתיבים קריטיים טפיל או מנגנונים, מזוהה באמצעות ניסויים במבחנה , יוכל לשמש לאחר מכן כדי לשבש את הזחל הצמיחה רבייה במארח חילזון, או כדי לזהות חילזון מארח המערכת החיסונית מנגנונים מעורבים זיהוי ולמניעת שלבים miracidial או sporocyst.
זה מאמר, מצגת וידאו, אנו מספקים תיאור מפורט של שיטה לבודד מספר רב של free-swimming S. mansoni miracidia עבור מבוא לתרבות במבחנה זה עלולים להיות נתונים מעקב ניסיוני מניפולציה (ראו איור 1 מבט סכמטי של זרימת העבודה לפרוטוקול). אף על פי נהלים דומים שתוארו קודם לכן7,8,9, הרגשנו כי פרוטוקול מפורט יהיה שימושי לחוקרים המעוניינים להעסיק. את מודל זה להפנות שאלות שלא נענו עדיין קשורים פיתוח זחל intramolluscan תאית שגשוג, אינטראקציות המערכת החיסונית schistosome-חילזון. בנוסף, גישה זו יכולה להתאים בקלות עבור בידוד של הביצים אחרים trematodes חשוב מבחינה רפואית כגון שלפוחית השתן-דיור ס haematobium, פספוסים הכבד או הריאות פספוסים.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chernin&#039;s balanced salt solution (CBSS+)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 1L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>2.8 g sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Dissolve salts, except calcium chloride, and&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.15 g of potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>sugars in 800 mL ddH2O</td></tr><tr><td>0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Dissolve calcium chloride separately in 200&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.45 g magnesium sulfate heptahydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>mL ddH2O</td></tr><tr><td>0.53 g calcium chloride dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Mallinckrodt</td><td>4160</td><td>Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.05 g sodium bicarbonate&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>with constant mixing</td></tr><tr><td>1 g glucose</td><td>MP Biomedicals</td><td>152527</td><td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 g trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td>0.22 &amp;micro;m disposable bottle-top filter</td></tr><tr><td>10 mL 100X penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add filtered penicillin and streptomycin soln&amp;nbsp;&lt;br/&gt; prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Incomplete Bge&amp;nbsp; medium (Ibge)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 900 mL solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>220 mL Schneider&amp;rsquo;s Drosophila medium modified</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td>Mix Schneider&#039;s medium with 680 mL ddH2O</td></tr><tr><td>4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9010</td><td>Add lactalbumin hydrolysate and galactose</td></tr><tr><td>1.3 g galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 &amp;micro;m&lt;br/&gt; pre-sterilized disposable bottle-top filter</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Complete Bge medium (cBge)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 100 mL of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>90 mL Incomplete Bge medium</td><td></td><td></td><td>To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>waterbath at 60&amp;deg;C for 1 hr while gently&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 mL 100X penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>swirling the bottle every 10 min&lt;br/&gt; Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes&amp;nbsp;&lt;br/&gt; and store at -20&amp;deg;C.&amp;nbsp; Mix medium + FBS and&lt;br/&gt; filter sterilize using a 0.22 &amp;micro;m pre-sterilized&amp;nbsp;&lt;br/&gt; disposable bottle-top filter&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Add penicillin and streptomycin prior to use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pond water (stock solution)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1L of stock solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>12.5 g calcium carbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Mix all salts in 1L of ddH2O</td></tr><tr><td>1.25 g magnesium carbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M27-500</td><td>Note that the salts will not have completely&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.25 g&amp;nbsp; sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>dissolved.&amp;nbsp; Shake vigorously to suspend&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.25 g&amp;nbsp; potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>salts prior to making the working soln&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pond water (working solution)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1.5L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix stock to ddH2O</td></tr><tr><td>1500 mL of ddH2O</td><td></td><td></td><td>Sterilize pond water by autoclaving (slow&amp;nbsp;cycle)</td></tr><tr><td>1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add penicillin and streptomycin prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Saline solution (1.2% NaCl)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1.5L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Autoclave saline solution to sterilize</td></tr><tr><td>1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add penicillin and streptomycin prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional equipment and material:&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-L mouse euthanizing chamber</td><td></td><td></td><td>Following approved IACUC protocol no. V001551</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Taconic Biosciences</td><td></td><td>Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; tank and regulator</td><td></td><td></td><td>pathogen-free</td></tr><tr><td>24-well tissue culture plate</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>1-L volumetric flasks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light source (150W)</td><td>Chiu Tech Corp</td><td>Model F0-150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, refrigerated, swinging bucket</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (250 mL)</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-mL centrifuge tubes, sterile</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Sterile disposable transfer pipets&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m pre-sterilized disposable bottle-top filter&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel blender</td><td>Waring Commercial</td><td>Model 51BL31</td><td></td></tr><tr><td>Blender cup, 100 mL capacity</td><td>Waring Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted compound microscope</td><td>Nikon Instruments&amp;nbsp;</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr></tbody></table>

mass isolation and in vitro cultivation of intramolluscan stages of the human blood fluke schistosoma mansoni

פספוסים דם אנושי, עלקת הבילהרציה spp., יש מחזור חיים מורכב שמערב שלבים התפתחותיים אל-זוויגית, מיניות בתוך השבלול ביניים, יונקים הסופי מארח, בהתאמה. היכולת לבודד ולקיים את שלבי מחזור החיים שונים בתנאים תרבות ' במבחנה הנחתה במידה רבה את חקירות של המנגנונים הסלולר, הביוכימי והמולקולרי ויסות טפיל צמיחה, פיתוח, מארח אינטראקציות. שידור של בילהרציה דורש רבייה אל-זוויגית ופיתוח של שלבים רבים זחל בתוך שבלול המארח; מ miracidium זיהומיות, דרך sporocysts ראשיים ומשניים, ועד השלב הסופי cercarial זה מסוגל להזיק לבני. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור המוני הבקיעה ובידוד של עלקת הבילהרציה mansoni miracidia מביצים המתקבל הכבדים של עכברים נגועים, מבוא עוקבות שלהם לתוך התרבות במבחנה . הוא צפוי כי פרוטוקול מפורט יעודד חוקרים חדשים לעסוק ולהרחיב שדה חשוב זה של מחקר schistosome.

הרוב המכריע של miracidia בדרך כלל שנאסף ב- "יבולים" שני הראשונים. דגירה של מבודדים miracidia ב CBSS + מפעיל על תהליך הטרנספורמציה miracidium-אל-sporocyst (איור 4A- C). בתוך שעה הראשונה העברה הבא לתרבות בארות המכיל CBSS +, הרוב המכריע של miracidia הפסקת שחייה (איור 4A</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni at JoVE.com

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד axenic בקנה מידה גדול ואוסף של miracidia free-swimming של הלוויתן דם אנושי עלקת הבילהרציה mansoni ועיבוד עוקבות שלהם עבור מבוא לתרבות במבחנה .

בידוד המוני וטיפוח במבחנה Intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי Mansoni עלקת הבילהרציה

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

mass-isolation-vitro-cultivation-intramolluscan-stages-human-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

9.1K Views.  University of Wisconsin, School of Veterinary Medicine. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד axenic בקנה מידה גדול ואוסף של miracidia free-swimming של הלוויתן דם אנושי עלקת הבילהרציה mansoni ועיבוד עוקבות שלהם עבור מבוא לתרבות במבחנה .

Video: Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Immunology and Infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

שימוש ביצים מ<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; כמו<em&gt; ב-vivo</em&gt; דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

התמרה חולפת של הצורות הסטרוביליות של אכינוקוקוס גרנולוסוס

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Genetics

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש<em&gt; Vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

בידוד המוני וטיפוח במבחנה Intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי Mansoni עלקת הבילהרציה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

שימוש ביצים מ

התמרה חולפת של הצורות הסטרוביליות של אכינוקוקוס גרנולוסוס

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

הר שלם