Name: mass isolation and in vitro cultivation of intramolluscan stages of the human blood fluke schistosoma mansoni
Uploaded: 2018-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni at JoVE.com

NIH 그랜트 RO1AI015503에 의해 일부를 투자. Schistosome에 감염 된 쥐 바이 리소스를 통해 배포에 대 한 NIH NIAID 계약 HHSN272201000005I 통해 NIAID Schistosomiasis 리소스 센터 생물 의학 연구소 (락 빌, 메릴랜드)에 의해 제공 되었다.

모든 동물 보호 및 실험 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 위스콘신-매디슨 대학 의정서에 의해 승인 되었다 아니. V005717입니다. 다음 프로토콜 포함 인간 병원 체에 대 한 Biosafety 수준 2 (BSL2) 시설에서 근무 없음이 프로토콜에 묘사 된 schistosome 단계는 인간이 나 다른 포유류를 감염 있습니다. 위험 그룹 2 (RG2) 인간 병원 체를 처리 하는 기관의 정책을 따릅니다.
참고: 우리가 사용 하 여 감염10, 그들의 더 높은 민감도 때문 (6 주 된) 여성 스위스-웹스터 쥐 그로 인하여 더 큰 계란 부담 저조한. 터 커 외. 이 모델 시스템11에 사용 되는 마우스 및 달팽이 감염 프로토콜을 설명 합니다. 테이블의 자료 의 특정 장비, 재료, 시 약 및 동물 소스가 실험 프로토콜을 수행 하는 데 필요한 모든 나열 합니다.
1. 감염 된 간을의 처리
<ol><li>CO2 질 (분당 챔버의 볼륨의 10-30%의 속도)에 의해 감염 된 6-7 주 후, 마우스를 안락사. 호흡 및 심장 박동의 정지에 대 한 마우스를 모니터링 합니다. 참고: 일반적으로, 20 쥐까지 처리할 수 있습니다 주어진된 시간에.</li>
	<li>Biosafety 내각에 안락사 마우스를 옮긴 후 그들의 뒤에 마우스 놓고 그들의 복 부 표면을 70% 에탄올 스프레이 합니다. 1 분 동안 담가 보자.</li>
	<li>꼬집어 낮은 복 부의 피부를 당겨 하 고 메 마른 외과 위 복 부에 가장 가까운 슬쩍된 피부의 기지에서 잘라. Anteriorly 잘라 피부를 당겨 (즉, 머리 쪽으로) 간 공개. Note 간 확대 하 고는 계란 유도 granulomatous 응답 (그림 2A)으로 인해 얼룩 덜 룩 합니다.</li>
	<li>간 제거 하 고 포함 하는 살 균 1.2 %NaCl 솔루션 포함 펜/strep의 200 mL 비 커에 배치.</li>
	<li>1.3-1.4 나머지 마우스 단계 반복 합니다. 참고: 20 쥐 단일 수확 일반적으로 처리 됩니다.</li>
	<li>멸 균 페 트리 접시에는 간을 놓고 소독 집게와 비 간 지방/결합 조직을 제거 합니다.</li>
	<li>펜/strep 살 균 1.2 %NaCl 솔루션의 ~ 200 mL를 포함 하는 메 마른 250 mL 원심 분리기 병 정돈/청소 간 전송.</li>
	<li>적극적으로 포함 하는 간 병을 동요 하 고, 거품/부동 파편 초과 표면 제거 살 균 일회용 피 펫을 사용 하 여. 천천히 용기에 남은 소금물을 부 어 또는 싱크대 포함 1% 표 백제 (소독 제).</li>
	<li>있는 간은을 신선한 염 분 해결책의 ~ 200 mL를 추가 하 고 단계 1.8 세 번 더 반복.</li>
</ol>2. 간 추출 및 miracidial 격리
<ol><li>작은 살 균 스테인리스 믹서 기 컵에는 간을 놓고 1.2 %NaCl 용액 (그림 2B)의 ~ 2 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>호 일와 유출 방지 하기 위해 낮은 및 높은 속도 (20 s 낮은 속도/10의 고속; 반복)를 대체 하 여 1 분 동안 혼합 배양 접시 컵 커버 (그림 2C).</li>
	<li>(20 간 4 병을 사용)에 대 한 균등 하 게 살 균 250 mL 원심 병에 혼합된 간 정지를 배포 합니다.</li>
	<li>~ 200 mL 전체 볼륨/병에 항생제와 살 균 염 분을 추가 합니다. 체중/밸런스 원심 분리 전 병.</li>
	<li>원심 분리기 4 oc. 부드럽게 15 분 290 x g에서 혼합된 간 부 supernatants 어 버리기 전에 표 백제와 함께 용기에.</li>
	<li>2.4-2.5 단계를 한 번 반복 합니다. 철저 하 게 원심 분리에 앞서 간 토사를 resuspend 해야 합니다.</li>
	<li>마지막 염 분 삭제 후 세척 (단계 2.6), 수송과 간 조직, 침전 물, resuspend 알루미늄으로 완전히 덮여 있다 멸 균된 1 L 체적 술병에 정지를 전송 하는 악수에 펜/strep 메 마른 연못 물 200 mL를 추가 호 일 톱 목 (그림 2D)의 3 cm 제외 참고: 1 L 플라스 크 당 두 병 (= 10 간)를 사용 합니다. 연못 물 계란에서 부 화 miracidial를 자극 하는 데 필요한 자연 민물 환경을 시뮬레이션 합니다.</li>
	<li>메 마른 연못 물을 사용 하 여, 목에 취재 호 일 위에 약 3 cm에 플라스 크를 작성. 다음, 지체 없이 (로 miracidia는 곧 부 화 하기 시작), 잔여 거품과 간 조직 파편을 포함 하는 연못 물 ~ 12 mL를 pipetting 신속 하 게 하 여 표면에 부동을 제거 하 고 튜브를 취소는 별도의 삭제. 신선한 메 마른 연못 물 바꿉니다.</li>
	<li>청소 단계 2.8, 3 더 많은 시간, 폐기 관에 miracidia의 존재에 대 한 검사를 반복 합니다. Miracidia 세척 솔루션에 표시 하는 경우 단계를 청소의 반복을 중단.</li>
	<li>마지막 세척 후 천천히 위에 깨끗 한, 마른 따뜻한 물으로 온도 기울기를 만들려고 따뜻한 메 마른 연못 물 (미리 30 oC 예 열) ~ 12 mL를 추가 합니다. 참고:이 가장 천천히 혼합을 피하기 위해 플라스 크 목의 측면을 따라 물 방전에 의해 수행 됩니다.</li>
	<li>플라스 크 오프닝에 작은 배양 접시 덮개를 배치 하 고 수 위 면을 밝히는 포 일 덮개 위에 플라스 크의 위쪽에 밝은 빛을. 참고: 일반적으로 5-10 분 이내 수영 miracidia, 매력, 빛을 집중할 것 이다 연못 물 (그림 3A)의 첫 2-3 cm 내에서 많은 수에서.</li>
</ol>3. Miracidial 수확 및 재배
<ol><li>Miracidia 10 분 후 표면에 축적, 살 균 전송 피펫으로 사용 하 여 제거 ~ 8 mL 연못 물과 살 균 15 mL 원심 분리기 튜브를 전송 합니다. 얼음에 miracidia를 포함 하는 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>다시 8 mL 부피 플라스 크의 내부를 따라 따뜻한 메 마른 연못 물 추가 하 고 다른 10 분 기다립니다.</li>
	<li>매번 새로운 튜브를 사용 하 여, 3.1, 3.2 단계 세 번 더 반복 합니다. 4번째 컬렉션 후 정착 miracidia 수 있도록 10 분 동안 얼음에 최종 관 유지. 튜브의이 세트 구성 첫 수확.</li>
	<li>원심 분리기 튜브 290 x g 4 oC에서 미리 냉각된 냉장된 원심 분리기에서 1 분 동안에 miracidia를 포함 하.</li>
	<li>바로 기생충 펠 릿 (그림 3B)를 방해 하지 않도록 주의 되 고 상쾌한 (~ 7 mL)의 대부분을 제거 합니다.</li>
	<li>수영장 하나에이 첫 번째 추수에서 모든 miracidia 튜브, ~ 1 mL 균 연못 물으로 원래 관의 모든 씻어 그리고 "합동된" 튜브에 추가.</li>
	<li>~ 5 분 동안 얼음에 정착 하는 기생충을 허용 하 고 다시 원심 290 x g 4 oc.에 1 분 동안에 기생충</li>
	<li>조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 6-8 mL 살 균 Chernin 소금 솔루션 (CBSS +; 참조 테이블의 재료) 포함 펜/strep 균형 추가.</li>
	<li>부드럽게 miracidia와 약 수 24-잘 문화 접시 (우물 당 1 mL)으로 6-8 ml CBSS + 튜브를 헹 구 고 린스의 1 mL 각 잘 추가 다음 일시 중단 합니다. 26 oC normoxic 조건에서 기생충 알을 품으십시오. 격리 된 miracidia의 농도, 다르지만 ~ 7000/mL 평균 일반적으로 것입니다.</li>
	<li>기생충은 아직도 광원에 집중, 단계 3.1 3.9 늦은 해칭 miracidia 수확 계속 반복 하지만 컬렉션 15-20 분 사이의 시간 간격을 증가. 참고:이 새로운 집합 관의 두 번째 수확을 나타냅니다. 그러나, 일반적으로 miracidial 숫자는 낮은, 때문에 일반적으로 모든 튜브에서 애벌레 잘 CBSS + 2 mL를 포함 하는 단일 문화권에 풀링됩니다.</li>
	<li>수확 후 24 h와 재배, 부드럽게 pipetting으로 그들의 우물에서 sporocysts resuspend.</li>
	<li>우물의 바닥에 침전 하는 기생충 수 있도록 몇 분을 기다립니다. 그들은 정착, 신중 하 게 상쾌한 (~1.5 mL), 애벌레 변환 하는 동안 miracidia에 의해 창 고 ciliated 상피 접시의 대부분을 포함 하는 제거. 이 "변환" 표면에 뜨는 폐기 하거나 애벌레 분 비 제품의 후속 연구에 통합 될 수 있습니다.</li>
	<li>각 잘 고 부드럽게 sporocysts resuspend에 피 펫의 신선한 CBSS + 1.5 mL를 추가 합니다. 추가 세척 또는 다른 매체를 변경 원하는 경우 단계 3.12를 반복 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

S. mansoni, 절연 및 여기에 설명 된 대로 조작의 Miracidia만 달팽이 중간 호스트를 감염 시킬 수 있습니다 그리고 그러므로 애벌레 발달의이 단계 동안 인간의 생물 학적 변하지 않습니다. 그러나, 감염을 피하기 위해 사고 노출/달팽이의 배려는 감염 Biomphalaria 달팽이 종 수 있습니다 존재 또는 유지 하는 지역에서 다른 위치에 miracidial 격리를 수행 하기 위해가지고 한다. BSL2 공간으로, 등...

인간의 혈액 마리가 Schistosoma 종, schistosomiasis, 한 약된 230 백만 사람들 전세계1afflicting 소홀히 열 대 질병의 원인이 되는 에이전트입니다. 가장 광범위 한 종, Schistosoma mansoni, 지리적으로 남아메리카, 카리브 제도, 중동, 사하라 사막 이남의 아프리카2에 배포 됩니다. S. mansoni, 다른 schistosomes의 수명 주기는 복잡 하다, 포유류 확실 한 호스트 및 의무 중간 호스트 역할 속 Biomphalaria 의 민물 달팽이.
S. mansoni 남성과 여성의 성인 웜은 쌍 창 자 점 막의 작은 venules에 박 혀 되 embryonated 계란 (ova)의 출시에 따른 포유류 호스트 재현의 후부 mesenteric 정 맥에서 생활 합니다. 계란 다음 혈관 벽을 통해 휴식 점 막 조직을 통해 마이그레이션 하 고 결국 대변으로 무효 처리는 어디 장 루멘을 입력 합니다. Ova는 민물 및 free-swimming 애벌레 (miracidia) 해치를 입력, 그들은 해야 합니다, 짧은 순서로 찾아 감염의 수명 주기를 계속 하기 위해 적당 한 Biomphalaria 달팽이. 이 감염 과정 miracidial 첨부 파일을 달팽이 외부 몸 표면 활성 침투와 유 충의 항목 호스트에 다음을 포함 한다. 항목, 직후는 miracidium 다음 애벌레의 단계로, 기본 또는 어머니 sporocyst의 새로운 외부 표면 (tegument) 될 것 이다 syncytium 형성으로 그것의 외부 ciliated 상피 접시를 발산 하기 시작 합니다. 성별이 없는 재생산을 통해 각 기본 sporocyst 생성 하 고 보조 나 sporocysts 또는 딸 sporocysts, 차례 차례로, 생성 하 고 intramolluscan 결선, cercaria3 의 다 수 출시의 2 세대를 출시 . 달팽이 호스트에서 탈출, 따라 free-swimming cercariae를 연결 하 고 직접 인간 또는 다른 적합 한 포유류 호스트의 피부를 관통 할 수 있다. 그들의 새로운 주인으로 입국, 시 cercariae 기생 schistosomula 단계로 변환 하 고 혈관 시스템을 침공. 그들은, 차례 차례로, 폐 그리고 그들이 어른 벌레로 성숙, 남성과 여성의 쌍을 형성 하 고 그들의 수명 주기를 완료 하는 데 mesenteric 정 맥에 여행 간 정 맥을 마이그레이션합니다.
성공 intramolluscan 또는 "달팽이 단계" 개발 애벌레 schistosomes의 인간의 호스트-전송의 사이클의 지속에 필수적 이다. 중요 한 중요성의 달팽이 호스트와 기본 sporocyst 단계에 그것의 초기 변화에 free-swimming miracidium의 기간 다음 항목이입니다. 호스트와 기생충 간의 생리 및 면역학 호환성에 따라 그것은 애벌레의 개발의이 단계는 초기 성공 또는 실패 결정된4,5,6 감염을 설치 하 . 기본 sporocysts asexually 다음에 인간 infective cercariae 생성, 보조 sporocysts 생산 능력의 후속 개발 추가 모든 기생충의 성장을 제공 하는 관대 한 생리 호스트 환경을 요구 하 고 생식이 필요합니다.
날짜 하려면, 작은 기본 생리, 생화학에 대 한 알려져 있다 및 분자 과정 schistosome-달팽이 상호 작용 제어, 애벌레의 개발 및 재생산, 규제 또는 조절에 관여 하는 특히 분자 및 경로 호스트 면역 응답입니다. 준비에 대 한 액세스 조건 하에서 생체 외에서 문화 실험 조작을 허용 하는이 애벌레 단계의 많은 것 크게 용이 하 게 개발 통로의 발견 및 세포 성장, 감 별 법의 기본 메커니즘 그리고 재생산입니다. 중요 한 기생충 경로 또는 메커니즘, 생체 외에서 실험을 통해 확인 된 다음 사용할 수 애벌레 성장/달팽이 호스트에서 복제를 중단 하거나 달팽이 호스트 면역 메커니즘 인식과의 제거에 관련 된 식별 miracidial 또는 sporocyst 단계.
이 문서 및 비디오 프레 젠 테이 션, free-swimming S. mansoni 의 많은 수를 분리 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 후속 실험 대상이 될 수 있습니다 생체 외에서 문화에 대 한 소개에 대 한 miracidia 조작 (프로토콜 워크플로의 도식 개요 그림 1 참조). 비슷한 절차 설명 되어 있지만 이전7,,89, 우리 상세한 프로토콜 관련이 아직도 대답 없는 질문을 해결 하기 위해이 모델을 채용 하고자 하는 연구자에 유용할 느꼈다 intramolluscan 애벌레 발달, 세포질 확산, 그리고 schistosome-달팽이 면역 상호 작용. 또한,이 이렇게 쉽게 방광-아리 스토 S. haematobium, 간 마리가 또는 폐 마리가 같은 다른 의학적으로 중요 한 흡 충 류에서 계란의 격리에 대 한 적응 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chernin&#039;s balanced salt solution (CBSS+)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 1L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>2.8 g sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Dissolve salts, except calcium chloride, and&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.15 g of potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>sugars in 800 mL ddH2O</td></tr><tr><td>0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Dissolve calcium chloride separately in 200&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.45 g magnesium sulfate heptahydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>mL ddH2O</td></tr><tr><td>0.53 g calcium chloride dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Mallinckrodt</td><td>4160</td><td>Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.05 g sodium bicarbonate&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>with constant mixing</td></tr><tr><td>1 g glucose</td><td>MP Biomedicals</td><td>152527</td><td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 g trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td>0.22 &amp;micro;m disposable bottle-top filter</td></tr><tr><td>10 mL 100X penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add filtered penicillin and streptomycin soln&amp;nbsp;&lt;br/&gt; prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Incomplete Bge&amp;nbsp; medium (Ibge)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 900 mL solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>220 mL Schneider&amp;rsquo;s Drosophila medium modified</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td>Mix Schneider&#039;s medium with 680 mL ddH2O</td></tr><tr><td>4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9010</td><td>Add lactalbumin hydrolysate and galactose</td></tr><tr><td>1.3 g galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 &amp;micro;m&lt;br/&gt; pre-sterilized disposable bottle-top filter</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Complete Bge medium (cBge)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 100 mL of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>90 mL Incomplete Bge medium</td><td></td><td></td><td>To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>waterbath at 60&amp;deg;C for 1 hr while gently&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 mL 100X penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>swirling the bottle every 10 min&lt;br/&gt; Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes&amp;nbsp;&lt;br/&gt; and store at -20&amp;deg;C.&amp;nbsp; Mix medium + FBS and&lt;br/&gt; filter sterilize using a 0.22 &amp;micro;m pre-sterilized&amp;nbsp;&lt;br/&gt; disposable bottle-top filter&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Add penicillin and streptomycin prior to use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pond water (stock solution)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1L of stock solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>12.5 g calcium carbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Mix all salts in 1L of ddH2O</td></tr><tr><td>1.25 g magnesium carbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M27-500</td><td>Note that the salts will not have completely&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.25 g&amp;nbsp; sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>dissolved.&amp;nbsp; Shake vigorously to suspend&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.25 g&amp;nbsp; potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>salts prior to making the working soln&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pond water (working solution)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1.5L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix stock to ddH2O</td></tr><tr><td>1500 mL of ddH2O</td><td></td><td></td><td>Sterilize pond water by autoclaving (slow&amp;nbsp;cycle)</td></tr><tr><td>1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add penicillin and streptomycin prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Saline solution (1.2% NaCl)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1.5L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Autoclave saline solution to sterilize</td></tr><tr><td>1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add penicillin and streptomycin prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional equipment and material:&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-L mouse euthanizing chamber</td><td></td><td></td><td>Following approved IACUC protocol no. V001551</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Taconic Biosciences</td><td></td><td>Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; tank and regulator</td><td></td><td></td><td>pathogen-free</td></tr><tr><td>24-well tissue culture plate</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>1-L volumetric flasks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light source (150W)</td><td>Chiu Tech Corp</td><td>Model F0-150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, refrigerated, swinging bucket</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (250 mL)</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-mL centrifuge tubes, sterile</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Sterile disposable transfer pipets&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m pre-sterilized disposable bottle-top filter&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel blender</td><td>Waring Commercial</td><td>Model 51BL31</td><td></td></tr><tr><td>Blender cup, 100 mL capacity</td><td>Waring Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted compound microscope</td><td>Nikon Instruments&amp;nbsp;</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr></tbody></table>

mass isolation and in vitro cultivation of intramolluscan stages of the human blood fluke schistosoma mansoni

인간의 혈액 마리가, Schistosoma 종, 달팽이 중급 및 포유류 최종 호스트, 내 성적, 성적 발달 단계를 각각 포함 하는 복잡 한 수명 주기 있다. 격리 하 고 생체 외에서 문화 조건 하에서 다른 라이프 사이클 단계를 유지 하는 능력은 크게 기생충 성장, 개발 및 호스트 통제 세포, 생화학 및 분자 메커니즘의 조사를 촉진 상호 작용입니다. 전송 schistosomiasis의 성별이 없는 재생산 및 달팽이 호스트; 내에서 여러 개의 애벌레 단계 개발 필요 기본 및 보조 sporocysts 통해 infective miracidium에서 cercarial 막바지에 그것은 인 간에 게 감염입니다. 이 문서에서 우리는 대량 해칭 및 감염 된 마우스, 그리고 생체 외에서 문화에 그들의 연속적인 소개의 간은에서 얻은 달걀에서 Schistosoma mansoni miracidia의 격리에 대 한 단계별 프로토콜 제시. 자세한 프로토콜에 종사 schistosome 연구의이 중요 한 분야를 확대 하는 새로운 연구를 격려 할 것 이다 예상 됩니다.

Miracidia의 대부분은 일반적으로 것 이다 되었습니다 수집 처음 두 "추수"에. CBSS +에서 고립 된 miracidia의 부 화 (그림 4A-C) miracidium sporocyst 변환 프로세스를 트리거합니다. 첫 번째 시간 문화에 다음 전송 우물 CBSS +, miracidia 중지 수영 (그림 4A)의 대다수를 포함 하. 문화에 6 h, miracidia 적극적으로 그들의 ciliated 표 피 판 ...

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Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

이 문서에서는 대규모 axenic 분리와 인간의 혈액 요 행 Schistosoma mansoni 의 free-swimming miracidia의 컬렉션에 대 한 프로토콜 및 생체 외에서 문화에 대 한 소개에 대 한 그들의 후속 처리.

대량 절연 및 인간의 혈액 우연 Schistosoma Mansoni 의 Intramolluscan 단계의 생체 외에서 재배

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

9.1K 조회수.  University of Wisconsin, School of Veterinary Medicine. 이 문서에서는 대규모 axenic 분리와 인간의 혈액 요 행 Schistosoma mansoni 의 free-swimming miracidia의 컬렉션에 대 한 프로토콜 및 생체 외에서 문화에 대 한 소개에 대 한 그들의 후속 처리.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

연구

면역학 및 감염병학

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

Cercarial 변화와 체외에서</em의> 양성 Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

에서 계란을 사용하여<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; 등<em&gt; 생체내에서</em기생충 유도된 폐 염증의&gt; 모델

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

Echinococcus granulosus의 스트로빌화 된 형태의 일시적인 형질 도입

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

유전학

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

사용 환경 샘플에서 새로운 Faustoviruses의 분리에 대한 신속한 전략<em&gt; Vermamoeba의 vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

대량 절연 및 인간의 혈액 우연 Schistosoma Mansoni 의 Intramolluscan 단계의 생체 외에서 재배

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쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Cercarial 변화와 체외에서 양성 Schistosoma mansoni* Schistosomules*

에서 계란을 사용하여

Echinococcus granulosus의 스트로빌화 된 형태의 일시적인 형질 도입

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리

사용 환경 샘플에서 새로운 Faustoviruses의 분리에 대한 신속한 전략

절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

전체 산

대량 절연 및 인간의 혈액 우연 Schistosoma Mansoni 의 Intramolluscan 단계의 생체 외에서 재배

요약

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쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Cercarial 변화와 체외에서 양성 Schistosoma mansoni Schistosomules

에서 계란을 사용하여

Echinococcus granulosus의 스트로빌화 된 형태의 일시적인 형질 도입

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약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리

사용 환경 샘플에서 새로운 Faustoviruses의 분리에 대한 신속한 전략

절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

전체 산

Cercarial 변화와 체외에서 양성 Schistosoma mansoni* Schistosomules*