Name: mass isolation and in vitro cultivation of intramolluscan stages of the human blood fluke schistosoma mansoni
Uploaded: 2018-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni at JoVE.com

Financé en partie par la subvention de NIH RO1AI015503. Souris infectées par les schistosomes ont été fournis par le NIAID schistosomiase Resource Center à l’Institut de recherche biomédicale (Rockville, MD) par le biais de NIH-NIAID contrat HHSN272201000005I pour distribution au moyen de ressources de la BEI.

Tous les soins des animaux et des procédures expérimentales ont été approuvées par la Commission Institutional Animal Care et utilisation de l’Université du Wisconsin-Madison en vertu du protocole aucune. V005717. Le protocole suivant consiste à travailler dans un établissement de niveau de biosécurité 2 (BSL2) pour les agents pathogènes humains, même si aucun des schistosomes étapes décrites dans le présent protocole sont infectieux pour les humains ou d’autres mammifères. Suivre des politiques institutionnelles pour la manipulation d’agents pathogènes humains groupe de risque 2 (RG2).
Remarque : Nous utilisons femelles souris Swiss-Webster (6 - semaine vieux) en raison de leur susceptibilité accrue d’infection10, réduisant ainsi à plus grandes charges d’oeuf. Tucker et coll. décrivent des protocoles d’infection souris et escargot utilisés dans ce système de modèle11. La Table des matières liste tous les équipements spécifiques, les matériaux, les réactifs et les sources animales nécessaires pour réaliser ce plan expérimental.
1. traitement des foies infectés
<ol><li>Euthanasier souris, infection après 6 à 7 semaines, par asphyxie de CO2 (taux de 10 à 30 % du volume de la chambre par minute). Contrôler la souris à l’arrêt de la respiration et le rythme cardiaque. Remarque : En règle générale, jusqu'à 20 souris peuvent être traitées à un moment donné.</li>
	<li>Après avoir transféré les souris euthanasiés une armoire de la biosécurité, placez la souris sur leur dos et leurs surfaces ventrales de pulvérisation avec l’éthanol à 70 %. Laisser tremper pendant 1 min.</li>
	<li>Pincer et tirer la peau du bas-ventre et recoupent le plus proche de l’abdomen avec des ciseaux chirurgicaux stériles à la base de la peau pincée. Tirez la peau coupée vers l’avant (c'est-à-dire, vers la tête) pour révéler le foie. Notez que le foie doit être élargi et moucheté en raison d’une réaction granulomateuse induite par l’oeuf (Figure 2 a).</li>
	<li>Retirer le foie et le placer dans un bécher de 200 mL de stérile 1,2 % NaCl solution contenant pen/infection streptococcique.</li>
	<li>Répétez les étapes 1.3 et 1.4 avec souris restants. NOTE : Vingt souris sont généralement transformées en une seule récolte.</li>
	<li>Placer les foies dans une boîte de Petri stérile et supprimer non-foie gras/conjonctif avec une pince stérile.</li>
	<li>Transférer garnis/nettoyer les foies dans une bouteille stérile centrifugeuse de 250 mL contenant environ 200 mL de solution de NaCl 1,2 % stérile avec stylo/strep.</li>
	<li>Vigoureusement secouer le flacon contenant le foie et, à l’aide d’une pipette stérile à usage unique, supprimer la surface excédentaire mousse/flotter des débris. Lentement, videz le reste de la solution saline dans un récipient ou évier contenant 1 % eau de Javel (désinfectant).</li>
	<li>~ 200 mL de sérum physiologique frais s’ajoute les foies et répétez l’étape 1.8 trois fois plus.</li>
</ol>2. foie extraction et miracidiale isolation
<ol><li>Placer les foies dans une tasse de petit mélangeur en acier inoxydable stérile et ajouter environ 2 mL de solution de NaCl à 1,2 % (Figure 2 b).</li>
	<li>Couvrir la coupe avec grille et une boîte de Pétri pour prévenir les déversements et mélanger pendant 1 min en alternant les haute et basse vitesse (20 s faible vitesse/10 s grande vitesse ; répétition) (Figure 2).</li>
	<li>Répartir la suspension du foie mélangée dans des bouteilles stériles centrifugeuse de 250 mL (pour 20 foies utilisent 4 bouteilles).</li>
	<li>Ajouter une solution saline stérile avec des antibiotiques à ~ 200 mL total volume/bouteille. Poids/équilibre bouteilles avant la centrifugation.</li>
	<li>Centrifuger les foies mélangés à 290 x g pendant 15 min à 4 oC. doucement décanter surnageants dans un récipient avec l’eau de Javel avant d’être jetés.</li>
	<li>Répétez les étapes 2,4-2,5 fois. Assurez-vous de complètement remettre en suspension des sédiments du foie avant la centrifugation.</li>
	<li>Après avoir jeté la dernière saline laver (étape 2.6), ajouter 200 mL d’eau stérile étang avec stylo/strep dans le tissu hépatique granulé, secouez pour remettre en suspension des sédiments et transférer la suspension dans une fiole jaugée de 1 L stérilisée qui a été entièrement recouvert d’aluminium fleuret, à l’exception de la partie supérieure de 3 cm de l’encolure (Figure 2D). Remarque : Utilisez deux bouteilles (= 10 foies) par flacon de 1 L. L’eau du bassin simule l’environnement d’eau douce naturel nécessaire pour stimuler la miracidiale l’éclosion des oeufs.</li>
	<li>À l’aide de l’eau stérile, remplir le ballon à environ 3 cm au-dessus de la grille qui couvre le cou. Alors, sans délai (comme miracidia bientôt commencer à éclore), enlever la mousse résiduelle et le tissu hépatique flottant à la surface en pipettant également rapidement jusqu'à environ 12 mL d’eau contenant des débris et jeter dans un séparé jeter le tube. Remplacer avec de l’eau fraîche étang stérile.</li>
	<li>Répétez le nettoyage étape 2.8, plus trois fois, en vérifiant la présence des miracidia dans le tube de rejet. Cesser de répétition de l’étape de nettoyage si miracidia apparaît dans la solution de lavage.</li>
	<li>Après le dernier lavage, ajouter lentement ~ 12 mL d’eau stérile chaud (préchauffé à 30 oC) pour créer un gradient de température avec l’eau chaude propre et stérile sur le dessus. Remarque : Il est préférable de faire décharger lentement l’eau le long du côté de l’encolure du flacon pour éviter le mélange.</li>
	<li>Placer une petite boîte de Pétri de la couverture sur l’ouverture de la fiole et briller d’une lumière vive dans le haut du ballon au-dessus du couvercle de papier d’aluminium pour éclairer la surface supérieure de l’eau. Remarque : En général, moins de 5-10 min, natation miracidia, attirés par la lumière, se concentrera en grand nombre dans les premiers 2-3 cm d’eau (Figure 3 a).</li>
</ol>3. miracidiale récolte et culture
<ol><li>Lorsque miracidia ont amassé à la surface après 10 min, à l’aide d’une pipette de transfert stérile, retirer environ 8 mL de l’eau du bassin et transférer dans un tube à centrifuger de 15 mL stérile. Placer le tube contenant des miracidia sur la glace.</li>
	<li>Ajouter arrière 8 mL d’eau stérile chaud à l’intérieur de la fiole jaugée et attendre encore 10 min.</li>
	<li>À l’aide de tubes neufs chaque fois, répétez les étapes 3.1 et 3.2 trois fois plus. Après la collection deth 4, maintenir le tube final sur la glace pendant 10 min permettre le miracidia à régler. Cet ensemble de tubes comprend la première récolte.</li>
	<li>Tubes à centrifuger contenant miracidia à 290 g pendant 1 min à 4 oC dans une centrifugeuse réfrigérée refroidie.</li>
	<li>Retirez immédiatement la majeure partie du liquide surnageant (~ 7 mL) en veillant à ne pas déranger le culot du parasite (Figure 3 b).</li>
	<li>Piscine tous le miracidia de cette première récolte en un seul tube, puis rincer tous les tubes originaux avec l’eau du bassin stérile ~ 1 mL et ajouter dans le tube « combiné ».</li>
	<li>Permettre aux parasites de s’installer sur la glace pendant environ 5 min et centrifuger à nouveau les parasites à 290 g pendant 1 min à 4 oC.</li>
	<li>Avec précaution, retirez le surnageant et ajouter que 6 à 8 mL stérile Chernin équilibré contenant pen/infection streptococcique de solution saline (CBSS + ; voir Table des matières).</li>
	<li>Suspendez doucement le miracidia et l’aliquote dans une plaque de culture de 24 puits (1 mL / puits), suivi par le tube de rinçage en 6 à 8 mL CEMB + et ajouter 1 mL de rinçage à chaque puits. Incuber les parasites à 26 oC dans des conditions normoxiques. Concentrations de miracidia isolé peut varier, mais habituellement en moyenne à environ 7 000/mL.</li>
	<li>Si les parasites sont concentrent encore la source lumineuse, répétez les étapes 3.1 à 3.9 pour poursuivre la récolte miracidia éclosion tardive mais augmenter l’intervalle de temps entre les collections à 15-20 min. Remarque : Ce nouveau jeu de tubes représente la deuxième récolte. Cependant, parce que les nombres de miracidiale sont généralement faibles, larves de tous les tubes habituellement sont regroupées dans une seule culture cupule contenant 2 mL CEMB +.</li>
	<li>À 24h après récolte et culture, doucement Resuspendre les sporocystes dans leurs puits de pipetage.</li>
	<li>Attendre quelques minutes afin de permettre des parasites se déposer au fond des puits. Une fois qu’ils sont sont installés, retirer délicatement le surnageant (~1.5 mL), qui contiendra la plupart des plaques épidermiques ciliées répandu par miracidia durant la transformation des larve. Cette « transformation » surnageante peut être mis au rebut ou incorporée dans des études de suivi des produits de sécrétion larvaires.</li>
	<li>Ajouter 1,5 mL de frais CEMB + à chaque puits et doucement la pipette pour remettre en suspension les sporocystes. Répétez l’étape 3.12 Si vous souhaitez encore laver ou changer pour un autre support.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+schistosomiasis.">Human schistosomiasis.</a> Lancet. 383, 2253-2264 (2014).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis:+number+of+people+treated+worldwide+in+2013.">Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013.</a> Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).</li><li>Yoshino, T. P., Gourbal, B., Th&#233;ron, A., Jamieson, B. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+sporocysts.">Schistosoma sporocysts.</a> Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).</li><li>Bayne, C. 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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Miracidia de S. mansoni, isolé et manipulé comme décrit ci-après, peut infecter seulement l’hôte intermédiaire d’escargot et par conséquent ne représentent pas un danger biologique humain au cours de cette phase du développement larvaire. Toutefois, pour éviter l’exposition/infection accidentelle d’escargots, il faut pour exécuter des isolations miracidiale dans un emplacement différent des zones où des espèces d’escargots Biomphalaria sensibles peuvent être présents ou entrete...

L’humain sang douves Schistosoma spp., sont les agents étiologiques de la schistosomiase, une maladie tropicale négligée qui afflige un estimé de 230 millions de personnes dans le monde1. L’espèce la plus répandue, Schistosoma mansoni, est géographiquement distribué en Amérique du Sud, l’archipel des Caraïbes, le Moyen-Orient et l’Afrique subsaharienne2. Le cycle de vie de S. mansoniet autres schistosomes, est complex, faisant intervenir un hôte définitif chez les mammifères et les escargots d’eau douce du genre Biomphalaria qui servent d’hôtes intermédiaires obligatoires.
S. mansoni mâles et femelles adultes ver couples vivant dans les veines mésentériques postérieures de reproduire le mammifère hôte, ce qui entraîne la libération de œufs embryonnés (ovules) qui se loge dans les petites veinules de la muqueuse intestinale. Œufs puis pauses à travers les parois des vaisseaux, migrent à travers le tissu muqueux et finit par entrer dans la lumière intestinale où ils seront annulées par les fèces. Lorsque les ovules entrez hachures de larves nageuses et d’eau douce (miracidies), ils doivent, dans l’ordre court, trouver un escargot Biomphalaria adapté pour infecter afin de poursuivre son cycle de vie. Ce processus d’infection implique miracidiale pièce jointe à surface de l’escargot extérieure suivie de pénétration active et l’entrée de la larve dans l’hôte. Peu de temps après l’entrée, le miracidia commence à jeter ses plaques épidermiques ciliées externes car elle forme un syncytium qui deviendra la nouvelle surface extérieure (tégument) de la prochaine étape larvaire, le sporocyste primaire ou mère. Par le biais de la reproduction asexuée, chaque sporocyste primaire produit et libère une deuxième génération de sporocystes, appelés secondaires ou des sporocystes de fille, qui à son tour, génèrent et libèrent un grand nombre de la dernière étape apporte, la cercaire3 . À échapper à l’hôte de l’escargot, cercaires libres sont capables d’attacher à et directement pénétrer dans la peau d’un hôte mammifère convenable humaine ou autre. Dès l’entrée dans leur nouvel hôte, les cercaires transforment le stade parasitaire schistosomula et envahissent le système vasculaire. Ils, à leur tour, migrent dans les poumons, puis à la veine hépatique où ils mûrissent de vers adultes, forment des couples masculins et féminins et rendre les veines mésentériques pour compléter leur cycle de vie.
Apporte le succès ou le développement de la « phase d’escargot » de schistosomes larvaires est essentiel à la poursuite du cycle de transmission à l’homme hôte-hôte. D’une importance cruciale est la période entrée suivante de la miracidia nageant librement dans l’hôte de l’escargot et sa transformation au début sur la scène du sporocyste primaire. Selon la compatibilité immunologique et physiologique entre l’hôte et le parasite, c’est au cours de cette phase du développement larvaire que succès initial ou l’échec pour établir les infections est déterminé4,5,6 . Développement ultérieur des sporocystes primaires capables de produire par voie asexuée des sporocystes secondaires, qui ensuite génèrent des cercaires homme infectieuse, nécessitent encore un environnement permissif hôte physiologiques qui offre pour l’ensemble de la croissance du parasite et la reproduction a besoin.
A ce jour, on connaît mal le sous-jacent, physiologiques, biochimiques et moléculaires processus régissant les interactions de schistosomes-escargot, surtout les molécules et les voies impliqués dans réglementant la reproduction et le développement larvaire ou modulant réactions immunitaires de l’hôte. Accès facile à un grand nombre de ces stades larvaires dans in vitro culture des conditions qui permettent la manipulation expérimentale faciliterait grandement la découverte de cheminement et les mécanismes sous-jacents de la croissance cellulaire, différenciation et la reproduction. Voies critiques parasite ou mécanismes, identifiés grâce à l’expérimentation in vitro pourraient alors servir de perturber la croissance ou la reproduction larvaire chez l’hôte de l’escargot, ou pour identifier les escargot hôte immunitaire mécanismes impliqués dans la reconnaissance et l’élimination des miracidiale ou sporocyste étapes.
Dans cet article et la vidéo de présentation, nous fournir une description détaillée d’une méthode pour isoler un grand nombre de nageuses S. mansoni miracidia pour être introduit dans la culture in vitro qui peut-être alors être soumise au suivi expérimental manipulation (voir Figure 1 pour une présentation schématique du flux de protocole). Des procédures similaires ont été décrits précédemment7,8,9, nous avons estimé qu’un protocole détaillé serait utile aux chercheurs qui souhaitent utiliser ce modèle pour répondre à des questions encore sans réponse associées à le développement larvaire apporte, prolifération cellulaire et interactions immunitaires schistosomes-escargot. En outre, cette approche pourrait facilement être adaptée pour l’isolement des oeufs des autres trématodes médicalement importants tels que la vessie vivant S. haematobium, douves du foie ou douves du poumon.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chernin&#039;s balanced salt solution (CBSS+)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 1L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>2.8 g sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Dissolve salts, except calcium chloride, and&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.15 g of potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>sugars in 800 mL ddH2O</td></tr><tr><td>0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Dissolve calcium chloride separately in 200&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.45 g magnesium sulfate heptahydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>mL ddH2O</td></tr><tr><td>0.53 g calcium chloride dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Mallinckrodt</td><td>4160</td><td>Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.05 g sodium bicarbonate&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>with constant mixing</td></tr><tr><td>1 g glucose</td><td>MP Biomedicals</td><td>152527</td><td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 g trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td>0.22 &amp;micro;m disposable bottle-top filter</td></tr><tr><td>10 mL 100X penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add filtered penicillin and streptomycin soln&amp;nbsp;&lt;br/&gt; prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Incomplete Bge&amp;nbsp; medium (Ibge)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 900 mL solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>220 mL Schneider&amp;rsquo;s Drosophila medium modified</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td>Mix Schneider&#039;s medium with 680 mL ddH2O</td></tr><tr><td>4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9010</td><td>Add lactalbumin hydrolysate and galactose</td></tr><tr><td>1.3 g galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 &amp;micro;m&lt;br/&gt; pre-sterilized disposable bottle-top filter</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Complete Bge medium (cBge)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 100 mL of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>90 mL Incomplete Bge medium</td><td></td><td></td><td>To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>waterbath at 60&amp;deg;C for 1 hr while gently&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 mL 100X penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>swirling the bottle every 10 min&lt;br/&gt; Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes&amp;nbsp;&lt;br/&gt; and store at -20&amp;deg;C.&amp;nbsp; Mix medium + FBS and&lt;br/&gt; filter sterilize using a 0.22 &amp;micro;m pre-sterilized&amp;nbsp;&lt;br/&gt; disposable bottle-top filter&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Add penicillin and streptomycin prior to use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pond water (stock solution)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1L of stock solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>12.5 g calcium carbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Mix all salts in 1L of ddH2O</td></tr><tr><td>1.25 g magnesium carbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M27-500</td><td>Note that the salts will not have completely&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.25 g&amp;nbsp; sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>dissolved.&amp;nbsp; Shake vigorously to suspend&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.25 g&amp;nbsp; potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>salts prior to making the working soln&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pond water (working solution)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1.5L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix stock to ddH2O</td></tr><tr><td>1500 mL of ddH2O</td><td></td><td></td><td>Sterilize pond water by autoclaving (slow&amp;nbsp;cycle)</td></tr><tr><td>1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add penicillin and streptomycin prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Saline solution (1.2% NaCl)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1.5L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Autoclave saline solution to sterilize</td></tr><tr><td>1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add penicillin and streptomycin prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional equipment and material:&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-L mouse euthanizing chamber</td><td></td><td></td><td>Following approved IACUC protocol no. V001551</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Taconic Biosciences</td><td></td><td>Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; tank and regulator</td><td></td><td></td><td>pathogen-free</td></tr><tr><td>24-well tissue culture plate</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>1-L volumetric flasks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light source (150W)</td><td>Chiu Tech Corp</td><td>Model F0-150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, refrigerated, swinging bucket</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (250 mL)</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-mL centrifuge tubes, sterile</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Sterile disposable transfer pipets&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m pre-sterilized disposable bottle-top filter&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel blender</td><td>Waring Commercial</td><td>Model 51BL31</td><td></td></tr><tr><td>Blender cup, 100 mL capacity</td><td>Waring Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted compound microscope</td><td>Nikon Instruments&amp;nbsp;</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr></tbody></table>

mass isolation and in vitro cultivation of intramolluscan stages of the human blood fluke schistosoma mansoni

Douves du sang humains, Schistosoma spp., ont un cycle de vie complexe qui implique des phases asexuées et sexuées de perfectionnement au sein d’un escargot intermédiaires et mammifère hôte final, respectivement. La capacité d’isoler et de maintenir les étapes du cycle de vie différent en vertu des conditions de culture in vitro a grandement facilité les enquêtes sur les mécanismes cellulaires, biochimiques et moléculaires régulant hôte, le développement et la croissance de parasite interactions. Transmission de la schistosomiase nécessite la reproduction asexuée et le développement de plusieurs stades larvaires chez l’hôte escargot ; le miracidia infectieux, par le biais de sporocystes primaires et secondaires, à la phase finale de cercaires c’est infectieux pour l’homme. Dans cet article, nous présentons un protocole étape par étape pour l’éclosion massive et l’isolement des miracidia Schistosoma mansoni des oeufs provenant de foie de souris infectées et leur introduction ultérieure dans la culture in vitro . Il est prévu que le protocole détaillé encouragera de nouveaux chercheurs de poursuivre et d’élargir cet important domaine de recherche de schistosomiase.

La grande majorité des miracidia sera en général ont été recueillie dans les deux premiers « récoltes ». L’incubation des miracidia isolé CEMB + déclenche le processus de transformation miracidia-à-sporocyste (Figure 4 a- C). Dans la première heure suivant transfert à culture puits contenant CEMB +, la majorité des miracidia cessent de natation (Figure 4 a). À 6 h dans la culture, miracidia son...

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Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Cet article décrit un protocole d’isolement axénique à grande échelle et de perception des miracidia nageant librement de la douve de sang humaine Schistosoma mansoni et leur traitement ultérieur pour être introduit dans la culture in vitro .

Masse d’Isolation et de la culture In Vitro des étapes apporte de la douve de sang humain Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

mass-isolation-vitro-cultivation-intramolluscan-stages-human-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

9.1K vues.  University of Wisconsin, School of Veterinary Medicine. Cet article décrit un protocole d’isolement axénique à grande échelle et de perception des miracidia nageant librement de la douve de sang humaine Schistosoma mansoni et leur traitement ultérieur pour être introduit dans la culture in vitro .

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocole pour la production d&#39;un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Recherche

Immunologie et infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

Transformation des cercaires et<em&gt; In vitro</em&gt; Culture de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

En utilisant des oeufs de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; En tant que<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de l&#39;inflammation pulmonaire induite par les helminthes

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

Transduction transitoire des formes strobilées d’Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Génétique

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Création et optimisation d&#39;une installation à haut débit pour l&#39;étude<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Myéloïde cellule d&#39;isolement de la peau de souris et Vidange ganglion Après intradermique immunisation avec Live Atténuée<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoïtes

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Une stratégie rapide pour l&#39;isolement des nouveaux Faustoviruses d&#39;échantillons environnementaux Utilisation<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

Isolement et absorption par des cellules dendritiques de petites vésicules extracellulaires d’Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Masse d’Isolation et de la culture In Vitro des étapes apporte de la douve de sang humain Schistosoma Mansoni

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Protocole pour la production d'un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

Transformation des cercaires et

En utilisant des oeufs de

Transduction transitoire des formes strobilées d’Echinococcus granulosus

Création et optimisation d'une installation à haut débit pour l'étude

Myéloïde cellule d'isolement de la peau de souris et Vidange ganglion Après intradermique immunisation avec Live Atténuée

Une stratégie rapide pour l'isolement des nouveaux Faustoviruses d'échantillons environnementaux Utilisation

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum

Isolement et absorption par des cellules dendritiques de petites vésicules extracellulaires d’Echinococcus granulosus

A Mont entier