עבודה זו נוצרה באמצעות תמיכה כספית מ דויטשה פתוח (DFG) תחת גרנט לא. PO413/12-1 ו- LA 1028/7-1.

<ol>
	<li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip+developments:+a+translational+cutting-edge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man?.">Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man?.</a> ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+human+liver-intestine+and+liver-skin+co-cultures+-+A+first+step+toward+systemic+repeated+dose+substance+testing+in+vitro.">Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro.</a> Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).</li><li>Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface.">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).</li><li>Cannon, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+epidermal+model+for+dermal+irritancy+testing.">New epidermal model for dermal irritancy testing.</a> Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).</li><li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phenion+Full-Thickness+Skin+Model+for+Percutaneous+Absorption+Testing.">The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing.</a> Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).</li><li>Netzlaff, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+reconstructed+human+epidermis+model+Episkin+in+comparison+to+various+human+skin+preparations.">Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).</li><li>Bran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Discriminative+Criterion+for+the+Development+of+Franz+Diffusion+Tests+for+Transdermal+Pharmaceuticals.">A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals.</a> J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).</li><li>Pineau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+percutaneous+absorption+of+aluminum+from+antiperspirants+through+human+skin+in+the+Franz+diffusion+cell.">In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell.</a> J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).</li><li>Filon, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+percutaneous+absorption+of+cobalt.">In vitro percutaneous absorption of cobalt.</a> Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).</li><li>Ng, S. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Static+Franz+Diffusion+Cell+System+for+In+Vitro+Permeation+Studies.">Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies.</a> AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).</li><li>Bonferoni, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+Franz+Diffusion+Cell+for+Simultaneous+Assessment+of+Drug+Release+and+Washability+of+Mucoadhesive+Gels.">A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels.</a> Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).</li><li>Seiffer, S., Oppermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+FRAP+experiments+performed+in+a+confocal+laser+scanning+microscope.">Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope.</a> J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).</li><li>Pluen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Macromolecules+in+Agarose+Gels:+Comparison+of+Linear+and+Globular+Configurations.">Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations.</a> Biophys J. 77, 542-552 (1999).</li><li>Cornelissen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+measurements+in+epidermal+tissues+with+fluorescent+recovery+after+photobleaching.">Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching.</a> Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).</li><li>Pirot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+permeability+barrier+of+human+skin+in+vivo.">Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo.</a> PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).</li><li>Tetteh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+examination+of+skin+diffusion+using+FTIR+spectroscopic+imaging+and+multivariate+target+factor+analysis.">Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis.</a> Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).</li><li>Guldbrand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+fluorescence+correlation+spectroscopy+as+a+tool+for+measuring+molecular+diffusion+within+human+skin.">Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin.</a> Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).</li><li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line.">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).</li><li>Veronike, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Organization+and+Differentiation+of+HaCaT+Keratinocytes+in+Organotypic+Coculture+with+Human+Dermal+Fibroblasts.">Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).</li><li>Moraes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Three-Dimensional+Cell+Culture+to+Organs-on-Chips.">From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips.</a> Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture.">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-organ+chip+co-culture+of+neurospheres+and+liver+equivalents+for+long-term+substance+testing.">A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing.</a> J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).</li><li>Materne, E. -. M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+liver+equivalents+for+toxicity+testing+-+organotypicalness+versus+cost-efficient+high+throughput.">Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput.</a> Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).</li><li>Jayakrishna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+High+Molecular+Weight+Compounds+through+Sclera.">Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera.</a> IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).</li><li>Peck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+Diffusion+of+Polar+Molecules+Through+and+Effective+Pore+Radii+Estimate+of+Intact+and+Ethanol.">Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol.</a> Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).</li><li>Ogiso, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+Enhancement+Effect+of+n-Octyl-&#946;-D-thioglucoside+on+the+Transdermal+Penetration+of+Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Dextrans+and+the+Molecular+Weight+Dependence+of+Water-Soluble+Penetrants+through+Stripped+Skin.">Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-&#946;-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin.</a> J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).</li><li>Hadgraft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin,+the+final+frontier.">Skin, the final frontier.</a> Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).</li><li>Asselineau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Epidermis+Reconstructed+by+Culture:+Is+It+"Normal"?.">Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"?.</a> J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).</li><li>Casasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+differentiation+in+a+model+of+human+skin+equivalent.">Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent.</a> Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).</li><li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line.">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).</li><li>Laurent, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Dextran+in+Concentrated+Solutions.">Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions.</a> Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).</li><li>Metzler, R., Klafter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+random+walk's+guide+to+anomalous+diffusion:+A+fractional+dynamics+approach.">The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach.</a> Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).</li></ol>

Uwe מרקס הוא המנכ ל ובעל מניות והוא גרד לינדנר מניות של TissUse GmbH, חברת מסחור הטכנולוגיה MOC וייצור. מחברים אחרים מצהירים אין ניגוד אינטרסים בדבר הפרסום של המאמר.

מחקר זה מתעד שיטה שפותחה כדי לכמת הסתננות דרך מבנה רקמות מהונדסים על קרום. הסתננות של חומרים עם שינוי מולקולרי גדלים באמצעות ג'ל agarose נבדק קודם כדי לבדוק ולאמת את השיטה ואת ההדמיה המתאימות. זה ידוע כי מולקולות קטנות לחדור יותר מהר דרך רשת matrix (למעט האפקט בג'ל סינון על-ידי חדירות גזים). תצפיות דומות נעשו עם גודל-הדרה ניסויים של חומרים דרך בסקלרה26, ממברנה עוריות אנושי27, העור האנושי17, ועכברוש העור28. מתאם הפוך בין המקדמים של חדירות רדיוס סטוקס המתאים (הרדיוס של כדור קשה שזז עם דיפוזיה באותו קצב כמו שהמולקולות מתואר, בדרך כלל קטן יותר רדיוס אפקטיבי של המולקולה) הוכח 26 , 28, מערכת יחסים דומה נצפתה בניסויים עם חומרים מולקולריים בגדלים שונים. ידי מקדמי חדירות על רדיוס 1/סטוקס, נמצאה התאמה לינארית מעל מארבע הקבוצות עם גודל מולקולרי הקטן ביותר (R2 = 0.93) (איור 6). אפשרות זו מציינת כי הם מקדמים חדירות מדומה עם השיטה הציע במגוון מציאותי.
השגיאה % 46.15 בניסויים הוא מעט גדול יותר. מאשר דיווח לניסויים חדירות עם מערכת10תא דיפוזיה פרנץ. הסבר אפשרי אחד יכול להיות התפלגות גודל של fluorescein-isothiocyanate-לתוספי, אשר נדון מאוחר יותר.
השיטה המתוארת יש חשוב יתרונות לעומת שיטות באמצעות מערכת תא פרנץ דיפוזיה. ראשית, ההגדרה תהיה יותר קומפקטי; הניסויים מתבצעות ישירות במערכת ממברנה הוספה, שבו יש את קנה המידה של צלחת טוב מסחרי (∼ 13 ס מ x 8.5 ס מ). דבר זה מאפשר מספר דוגמאות שיש להפעיל בעת ובעונה אחת, ואילו תא נפרד של דיפוזיה פרנץ נדרש עבור כל דגימה. שנית, החדירות של מודל העור ניתן ישירות למדוד את תותב ממברנה, שם מתקיים הטיפוח. באמצעות תאים דיפוזיה פרנץ, הדגימות יש לחסל, רכוב על המערכת, אשר הוא מסורבל יותר עבור מדגמים קטנים והוא גם אורכת זמן רב.
הסתננות ניסויים עם קולגן תא מטריצות הראה כי בשיטה זו ניתן ליישם בהצלחה מערכות נזרע התא. המודל המוצג כאן אומתה לדגמי העור; עם זאת, ניתן להחיל את שיטת לסוגים אחרים של תרביות תאים אורגני, למשל, בכליות או בכבד.
במחקר זה, שימשה מודל קולגן תאים שבו התאים HaCaT מכוסה לחלוטין ממשטח הדגם (ראה איור 5). זה הוביל לירידה של מקדם פרמאביליות, הדגמת השיטה היא רגישה מספיק כדי להבדיל את מקדם חדירות בין מודל קולגן תאים עם ובלי שכבה של HaCaT. באופן אידיאלי, מודל העור צריך לבנות מחסום, אשר מתקרב של האפידרמיס של העור האמיתי29, לכן חשוב לוודא את איכות העור המודל לפני השימוש בפועל (למשל, הבניין של העור, האפידרמיס). הפיתוח של מודל העור יכול להיות דמיינו מכתים טכניקות, לכמת מן הגילוי של העור חלבון וקולגן30,31,32. המקדם חדירות עשוי גם להיות גורם חשוב להערכת התפתחות המודל העור, אך בהמשך הניסויים נדרשים לאשר זאת. כאמור, שיטה זו מאפשרת הפעלה דגימות מרובים במקביל. זה גם אפשר לקחת דגימות במהלך הטיפוח למדוד פרמאביליות, ולבחון ובכך הפיתוח של הפרמטר של המודל העור.
יצוין, כי חדירות. נמדד באמצעות ג'ל/קולגן-תא-דגם קרום בו זמנית. המקדם שזוהו חדירות הוא ספציפי למערכת, לפיה תוצאות מודלים עור שונים ניתן רק להשוות בעת שימוש את תותב קרום זהה. יתר על כן, המודל העור צריך לכסות את האזור כולו הטיפוח-תרגול על מנת להבטיח כי החומר במבחן לחדור רק דרך המודל, לא בצמוד לו, אשר זירוז שגיאות ב- החדירות נמדד. היבט נוסף שיש לשקול בעתיד הניסויים הוא הסביבה הטבעית המקיפים את העור. בדרך כלל, הטמפרטורה של פני העור הוא נמוך בהשוואה האזור הפנימי, אשר יכולים להשפיע על התנאים הסתננות.
כדי ליישר ניסויים במעבדה עם סימולציות מחשב, הוצגה שיטה המאפשרת אופטימיזציה פרמטר עבור יישומי סימולציה. סימולציות נמצאו יעלה בקנה אחד עם נתוני הניסוי חומרים עם גודל מולקולרי קטן. עם זאת, הסטיות בין סימולציה נתוני הניסוי נצפו חומרים בגודל מולקולרי גדול יותר. מולקולות גדולות רב-סוכר ניתן להגביר את החיכוך, להאט את תהליך דיפוזיה של ג'ל. אפקט זה גורם לא תקין דיפוזיה, המהווה סיבה אפשרית הסטייה בין ניסיוני ו סימולציה הערכים33,34. הסבר אחר יכול להיות הנוכחות של חלקיקים קטן או גדול יותר ב- fluorescein-isothiocyanate-לתוספי. היצרן מציין את המשקל המולקולרי של החומר כגודל מרושע עם מגוון נתון, אשר מאפשר חלקיקים קטנים יותר, גדול יותר להיות נוכח. לא ברור גם איך התפזרו חומרים אלו הם, כפי החלקיקים קטנים יותר מהר יותר לחדור דרך הג'ל וערוץ נוזלים. זה אפשרי להרחיב את הסימולציה לשקול אלה דיפוזיה ואפקטים חיכוך.
חדירות ניסוי של הדמיה פותחו לשימוש ב- 2-הציוד בעזרתו של הסימולציה, שיטה ניסויית זו ניתן להעביר ישירות כדי מתוחכמים יותר setups ניסיוני. לדוגמה, ניתן בקלות להעביר ממברנה הוספה מערכת סימולציה הגיאומטריה של 2-OC או למערכות אחרות עם set-ups דומה. אפשרות זו הכוח ויסות הסימולציה יכול לשמש כדי לתמוך את העיצוב של ניסויים עתידיים. בנוסף, ניתן לשלב תופעות לוואי כגון אידוי, פיזור נורמלי ואפקטים ממברנה כדי לשפר את ההדמיה, ובכך לשפר את דיוק. התוכנית סימולציה נותן את ההזדמנות כדי לשנות או לשפר את המשוואה סימולציה, כמו גם באשר לשלב מודולים פיזיים אחרים במטרה לחקור היבטים אחרים של התפתחות מודל העור. דוגמה אחת היא ההדמיה של צריכת גלוקוז וייצור לקטט במודל תא קולגן.
היבט מעניין במיוחד של חומרים רפואיים בדיקת הוא איך החומרים מופצים בכל מערכת איברים-על-שבב. הפרמטר חדירות וחידונים לעזרתי כדי לענות על שאלות כגון מה המהירות חומר מפעפע לתוך המערכת, כמו גם הריכוז אשר יהיו זמינים בשביל לרקמות אחרות במולטי-organ-צ'יפס. שיטה זו יכולה לתמוך ולשפר הפיתוח ובדיקות של מערכות איברים על שבב כאלה.

אורגניות טיפוסי תרבויות 3D הפכו כלים רבי-עוצמה עבור פיתוח תרופות, חומר בדיקה1. במובן זה, העור האנושי הדוגמניות עניין מיוחד עקב דרישות רגולטוריות, כגון אלה בתעשיית הקוסמטיקה. הם הובילו בהמשך פיתוח מודלים 3D עור רבים, לשימוש או על תרבויות יחיד-איבר משלהם כמו צלחות רב טוב, או מולטי-organ-צ'יפס בשילוב עם מודלים איברים נוספים, למשל, את הכבד2.
לגבי טיפוח של מקבילה העור, הממשק אוויר נוזלי (עלי) הוא מרכיב חיוני עבור נאות בידול באפידרמיס3. תא תרבות מוסיף המורכב כלי קיבול עם קרום חדיר נוזלים בתחתית משמשים בדרך כלל להקים של עלי. ALIs מנוצלים נרחב זמינים מסחרית העור דגמים כמו EpiDerm4, Phenion5ו – Episkin6, על התרבות של העור דגמים עם גדלים מ 96-ובכן (4.26 מ"מ קוטר) עד 12-טוב (12.2 מ"מ קוטר) צלחות. השיטה המתוארת כאן קובע את הסתננות של חומרים במערכת הוספה ממברנה.
המקדם חדירות הוא פרמטר משמעותי להערכת האיכות של כל עור-דגם בתרבית לעומת עור מקורי5, והוא משמש כדי להעריך כמה מהר חומרים פעילים להעביר דרך העור. במיוחד אם סמים או קוסמטיקה מוצרי צריך להיות מוחל על העור, פרמטר זה חיוני להבין מתי בדיוק סוכנים פעילים עוברים. הדמיה נוספות יכול לעזור לחזות את אופן הפעולה של המערכת, לאחר מכן להפחית את המאמץ הדרוש ניסיוני גוזלת זמן, במיוחד כאשר קבוצה גדולה של חומרים מעורב.
התא דיפוזיה פרנץ היא המדינה-of-the-art הסתננות ניסויים עם העור, העור מודלים5,6,7,8,9. מכשיר זה כולל שני תאים עם מדגם קבוע (מחסום דיפוזיה) בין לבין. החומר להיבדק מוחל ישירות לחלק העליון של המדגם (התורם תא), הריכוז של המתחם חודרני ניתן להבחין ב התא הנגדי (מקבל). בצד מקבל, טמפרטורה קבועה וריכוז חומר הומוגני מובטחים דרך תא טמפרטורה של פגים. ניתן לקחת דגימות של זרוע דגימה בצד מקבל התא פרנץ. עם מגוון גובה 19 ס"מ בין 179 ס מ, מערכת זו היא גדולה יחסית10,11. שיטה נוספת לקביעת מקדמי דיפוזיה של חומרים דמוי ג'ל ורקמות היא FRAP. שיטה זו משתמשת העיקרון של הלבנת fluorescently שכותרתו חלקיקי הג'ל, ואז לקבוע את זמן ההחלמה של האזור מולבן לחישוב13,1412,מקדם דיפוזיה.
יתר על כן, ספקטרוסקופיית פורייה-המרה-תת-אדום (FTIR) ניתן להשתמש כדי לזהות תנועה של חלקיקים עם ספיגת האור האינפרא-אדום על מנת לקבוע את תהליך הסתננות של חומרים לעור15,16. עם זאת, אלה או שיטות הדמיה אחרות (למשל, שני הפוטונים פלורסצנטיות המתאם ספקטרוסקופיה17) צריך לעלות מכשירים אינטנסיבית.
במאמר זה, שיטה מוצג ישירות מודדים את החדירות של מחסום בתוך מערכת הוספה ממברנה, איפה מודל העור יכול להיות מעובד. שיטה זו מאפשרת חדירות ניסויים כדי לפעול עם מספר רב של דוגמאות קטנות (טוב גודל למעלה מ"מ 4.26) עוד מערכת קומפקטית. זאת בניגוד פרנץ דיפוזיה התא, איפה מכשיר נפרד נדרש עבור כל בדיקה, אשר חייב להיות מותקן על המכשיר קשה להבין עבור מדגמים קטנים (גודל של 4.26 מ מ). יתר על כן, מאז השיטה אינה דורשת מכשור הגדולות (למשל, מיקרוסקופ קונפוקלי או multiphoton), צמצום זמן ועלות מושגת.
כל הניסויים בוצעו ב נקבובי ממברנה להוסיף מערכות עם דגימה (מכשול) המורכב agarose ג'ל או מודל תא קולגן נוסדה בהקרום. חומרים פלורסנט (תורם) עם משתנה גדלים מולקולרית יושמו לחלק העליון של המדגם, הריכוז של חומר חילחלו זוהה בתחתית (מקבל) שימוש בקורא צלחת קרינה פלואורסצנטית (ראה איור 1). על מנת לאמת את שיטת ולבדוק את הדיוק של סימולציה זה, ג'לים agarose היו המיוצר, משמש כמחסום. Hydrogels משמשים בדרך כלל עבור החקירה של תהליכי דיפוזיה, הסתננות במדיום נקבובי ביולוגיים.13. השיטה נבחנה אז נזרע תא מערכת המורכבת קולגן מטריצה של fibroblasts ראשי ו למבוגרים נמוך סידן גבוהה טמפרטורה keratinocytes (HaCaT) תאים אנושיים (מטריצה תא מודל), אשר עור מפושטת דגם18,19 .
בנוסף, תהליך הסתננות היה מדומה בעזרת סימולציות זרימה עם חישובית דינמיקה של נוזלים. נמצא כי, על-ידי הפרמטר אופטימיזציה, מקדם דיפוזיה יכול לחשב מתוך המידע מהניסוי. באופן כללי, סימולציה זה מציעה יישומים שונים; למשל, ניתן לחזות תהליך הסתננות המבוסס על ניסויים קצר, הסימולציה להפחית באופן משמעותי את מספר ניסויים.
השיטה הניסיונית וסימולציות תוכננו עבור היישום מערכת איברים-על-שבב1,20,21,1,22, פותחה במיוחד 2 האיברים-צ'יפס-(2-OC) 23,24,25. בעקרון, ניתן לתאר את תהליך הסתננות של כל דגם אורגן המבוסס על רפידה הוספה מערכות בדרך זו.

<table width="883">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:236px;height:20px;">Agarose</td>
			<td style="width:248px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:112px;">K297.2</td>
			<td style="width:287px;">High Resolution Powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagen&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen R solution 0.4 %</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td>
			<td>880010-12</td>
			<td>High Glucose with L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Biochrom GmbH</td>
			<td>S0615 0114F</td>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46960-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944-500MG</td>
			<td>4000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD10S-250MG</td>
			<td>10 000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD20S-250MG</td>
			<td>20 000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD40S-250MG</td>
			<td>40 000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170120</td>
			<td>no calcium, no magnesium , with phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06467.9010</td>
			<td>granulated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transwell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3391</td>
			<td>96 well, 0.4 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transwell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>734-1563</td>
			<td>12 well, 0.4 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Biochrom GmbH</td>
			<td>L2143</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for determination and simulation of permeability and diffusion in a 3d tissue model in a membrane insert system for multi-well plates

במבחנה מגידולי העור מודלים הפכו יותר ויותר רלוונטי עבור יישומים התרופות, הקוסמטיקה, משמשים גם פיתוח תרופות, כמו גם חומר בדיקה. מודלים אלה בעיקר המטופחים במערכות ממברנה-הוספה, חדירות שלהם כלפי חומרים שונים להיות גורם חיוני. בדרך כלל, השיטות יישומית לקביעת פרמטרים אלה דורשות לרוב גדלי מדגם גדולים (למשל, פרנץ דיפוזיה תא) או ציוד מפרך (למשל, קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP)). מחקר זה מציג שיטה לקביעת מקדמי חדירות ישירות במערכות ממברנה-הוספה עם קוטר בגדלים של 4.26 מ"מ ו 12.2 מ"מ (טיפוח אזור). השיטה אומתה עם agarose, ג'לים קולגן, כמו גם מודל תא קולגן המייצג העור מודלים. התהליכים הסתננות של חומרים בגדלים שונים מולקולרית, הסתננות דרך מודלים תאים שונים (המורכב של קולגן ג'ל, פיברובלסט HaCaT) תוארו במדויק.
יתר על כן, כדי לתמוך בשיטה ניסויית שלעיל, הוקמה סימולציה. הסימולציה מתאים המידע מהניסוי היטב עבור חומרים עם גודל מולקולרי קטן, עד כדי 14 x 10-10 מ' סטוקס רדיוס (4,000 מגה-וואט), ולכן הוא כלי מבטיח כדי לתאר את המערכת. יתר על כן, הסימולציה יכול להפחית במידה ניכרת המאמצים ניסיוני, יציבה מספיק כדי להיות מורחב או סוגל setups מורכבים יותר.

ניסויים חדירות קרום 96-ובכן להוסיף מערכת עם ג'ל agarose 2% כמו מחסום נערכו על מנת להעריך את הדיוק של סימולציה. Fluorescein נתרן מלח (NaFl) fluorescein isothiocyanate-dextranes (FD) שימשו כדי לאמת את ההשפעה של גודל מולקולרי של החומר באמצעי מ 5 10x-10 מ' למעלה כדי 45 x 10-10 מ' סטוקס רדיוס (376.27 40,000 mol wt). פרמטר יליד אופטימיזציה הסימולציה שימש כדי להתאים את הסימולציה נתונים ניסיוני.
לשם כך, מדרונות רק החלקים ליניארי של החדירות מדומה הושוו לתוצאות הניסוי. עבור גודל מולקולרי קטן, סימולציה נתוני הניסוי היו בהסכם טוב עם 99.2% עבור NaFl ו 80.2% עבור FD 4,000 (ראה איור 4a , 4b יבינו). גודל מולקולרי גדול שנוצר סטיות גבוהה מציג מתאמים של 50.5% עבור FD 10,000, 79.7% עבור FD 20,000 ו- 53.6% עבור FD 40,000. התקדמות עקומה הסימולציות הראו עיכוב בתחילתה ואת עלייה חזקה יותר בקורס נוסף של תרשימי (ראה איור 4 c–4e).
חדירות והקבוע המקדמים של דיפוזיה מדומה מוצגות באיור בטבלה 4. המקדם הסתננות יורד עם הגדלת גודל מולקולרי. סטיית תקן היה בין 0.08 x 10-8 m/s 0.47 x 10-8 m/s (N = 7), אשר תאמו היא טעות מוחלטת בין 4.18% ל 46.15%. ניסויים עם מולקולות גדולות יותר הראה שגיאת מוחלטים גדולים יותר. מקדמי דיפוזיה מדומה התנהגו באופן דומה מאוד ל מקדמים חדירות ניסיוני. חומרים עם רדיוס גדול יותר סטוקס הראו הפחתת המקדמים דיפוזיה, ושגיאה מוחלטת נע בין 9.09% ל- 18.46% (N = 3).
בניסויים נוספים הסתננות, ארבעה סוגי מודל של תאים קולגן שונים שימשו כמו מחסומים קרום 12-טוב להוסיף מערכת. מודלים אלה מהווים מודל ללא תאים דגם תא עם שילובים שונים של ראשי fibroblasts ג'ל קולגן, HaCaT על פני השטח. שימשו את השילובים הבאים: קולגן (קולונל) כמודל ללא תאים, קולגן + Fibroblasts (אל"מ + פ), קולגן + HaCaT (אל"מ + ה'), ואת קולגן + Fibroblasts + HaCaT (אל"מ + פ + ח.). Fluorescein מלח נתרן עם DMEM + 10% FCS שימש חומר התורם. התמונה שימש ניתוח של המודל תא קולגן, צביעת ועם hematoxylin אאוזין (הוא). זה מכתים נעשה באמצעות הפרוטוקול של היצרן. איור 5, כתם כזה עם דגם אל"מ + פ + ח נציג מוצג. הוא מעט כתמי מבנה רקמת קולגן המטריצה. Fibroblasts ממוקמים במטריצה, הגרעינים של פיברובלסט ותאים HaCaT מוכתמים בסגול כהה. על גבי מטריצת קולגן, יש שכבה הכוללת גרעינים רבים, אשר צריכה להיות הגרעינים של HaCaTs, בניית שכבת תוחם על המודל.
טבלה 5, מפורטים הסתננות ניסיוני והקבוע המקדמים של דיפוזיה מדומה. ניתן לראות מגמה עבור רוב הדגמים עם HaCaT, אשר מקדמים הסתננות/דיפוזיה נמוך לעומת הדגמים ללא HaCaT. השגיאה המוחלטת של מקדמי הסתננות היא 10.9-24.4%, עבור דיפוזיה המקדמים של 5.2% - 12.9%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> איור 1: מבט צד של הניסוי חדירות קרום הוספת מערכת. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> איור 2: גרף למופת של ניסוי חדירות. הריכוז של מקבל מותווים לאורך זמן. שני קווים מקווקווים סוגר את החלק כמעט ליניארית של הגרף. השיפוע של החלק הליניארי משמש לקביעת המקדם חדירות. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> איור 3: גיאומטריה ורשתות של הקרום להוסיף מערכת סימולציה. מערכת הוספה () גאומטריה של קרום 96-ובכן. מערכת הוספה (b) גאומטריה של קרום 12-. טוב. (ג) רשת של קרום 96-ובכן הוספה מערכת. מערכת הוספה (d) רשת של קרום 12-. טוב. (e) חתך ופרמטרים של הקרום להוסיף מערכת. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> איור 4: השוואה של נתונים ניסיוני של ניסוי הסתננות אל הסימולציה ממוטבת. מלח נתרן () fluorescein (b) fluorescein isothiocyanate-לתוספי 4,000 מול wt., (ג) 10,000 מול wt., wt. mol (d) 20,000, (e) 40,000 מול wt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> איור 5: נציג הוא מכתים של מודל תא קולגן (קולגן + Fibroblasts + HaCaT). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> איור 6: חדירות מקדם כפונקציה של רדיוס 1/סטוקס באמצעות מלח נתרן fluorescein ו- fluorescein isothiocyanate-לתוספי בקרום 96-ובכן להוסיף מערכת. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שם</td>
			<td>Experession עבור מערכת טוב 96 מ מ</td>
			<td>Experssion 12-ובכן מערכת במ מ</td>
			<td>תיאור</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [מ מ]</td>
			<td>14.7 [מ מ]</td>
			<td>קוטר של הבאר</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_a</td>
			<td>4.26 [מ מ]</td>
			<td>12.1 [מ מ]</td>
			<td>קוטר של קרום</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8.79 [מ מ]</td>
			<td>21.97 [מ מ]</td>
			<td>קוטר של מקבל</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [מ מ]</td>
			<td>2 [מ מ]</td>
			<td>הי של המכשול</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [מ מ]</td>
			<td>1 [מ מ]</td>
			<td>המרחק בין טוב והתחתונים</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_a</td>
			<td>4.73 [מ מ]</td>
			<td>5.24 [מ מ]</td>
			<td>גבוהה של מקבל</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>עומק טבילה</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>רדיוס הכדור טבילה+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>r_z</td>
			<td>r + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>z-מיקום של הכדור טבילה+
</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: גאומטריה פרמטרים עבור הסימולציה "תעבורה מינים כימי". + רק כדי לשמש עבור הסימולציה של agarose ג'ל בקרום טוב 96 להוסיף מערכת.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שם</td>
			<td>הביטוי</td>
			<td>ערך</td>
			<td>תיאור</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>מול 0.26576/m2
</td>
			<td>ריכוז של Fl.So.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 [מ"ג/מ"ל] / 4000 [g/mol]</td>
			<td>מול 0.5/m2</td>
			<td>ריכוז FD 4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [מ"ג/מ"ל] / 10000 [g/mol]</td>
			<td>מול 0.2/m2</td>
			<td>ריכוז FD 10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [מ"ג/מ"ל] / 20000 [g/mol]</td>
			<td>0.1 מול/m2</td>
			<td>ריכוז FD-20,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [מ"ג/מ"ל] / 40000 [g/mol]</td>
			<td>מול 0.05/m2</td>
			<td>ריכוז FD 40.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m ^ 2/s]</td>
			<td>/S21E - 9 מטר</td>
			<td>מקדם דיפוזיה של ערבוב מים</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: פרמטרים פיזיים להדמיה "תעבורה מינים כימי".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שם</td>
			<td>הביטוי</td>
			<td>תיאור</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>ההגדרה של ריכוז מקבל</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e-10</td>
			<td>שינוי פקטור D</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: פרמטרים עבור הסימולציה "אופטימיזציה".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>לחדור</td>
			<td>חדירות מקדם (m/s) x 10-8</td>
			<td>מקדם דיפוזיה (m/s2) x 10-10</td>
			<td>סטוקס הרדיוס של permeate (ז) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So.</td>
			<td>4.79 ± 0.20</td>
			<td>1.94 ± 0.34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4,000</td>
			<td>2.37 ± 0.31</td>
			<td>0.65 ± 0.12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1.67 ± 0.47</td>
			<td>0.22 ± 0.02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20,000</td>
			<td>0.65 ± 0.30</td>
			<td>0.29 ± 0.04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40,000</td>
			<td>0.27 ± 0.08</td>
			<td>0.14 ± 0.02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 4: מקדם פרמאביליות, דיפוזיה של חומרים עם רדיוס שונה סטוקס דרך 2% Agarose ג'ל + ממברנה ב 96-ובכן קרום להוסיף מערכת. (מלח נתרן fluorescein = פעל אז, לתוספי fitc = FD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מודל</td>
			<td>חדירות מקדם (m/s) x 10-8</td>
			<td>מקדם דיפוזיה (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>אל"מ</td>
			<td>2.18 ± 0.29</td>
			<td>1.22 ± 0.06</td>
		</tr>
<tr>
<td>אל"מ + F.</td>
			<td>1.77 ± 0.38</td>
			<td>0.93 ± 0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>אל"מ + H.</td>
			<td>1.64 ± 0.40</td>
			<td>0.96 ± 0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>אל"מ + פ + H.</td>
			<td>1.65 ± 0.18</td>
			<td>0.88 ± 0.11</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 5: מקדם חדירות ובהפצה של מלח נתרן fluorescein באמצעות מודל תא קולגן גם עם 12-ממברנה טוב להוסיף מערכת (אל"מ = קולגן, פ = פיברובלסט, ה = HaCaT).

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates at JoVE.com

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

שיטה לקביעת חדירות קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב, סיליקו פרמטר אופטימיזציה עבור החישוב של מקדמים דיפוזיה באמצעות סימולציה מוצגים.

שיטה של נחישות וסימולציות של חדירות ובהפצה במודל תלת-ממד רקמת קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

a-method-for-determination-simulation-permeability-diffusion-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.0K Views.  Hamburg University of Technology. שיטה לקביעת חדירות קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב, סיליקו פרמטר אופטימיזציה עבור החישוב של מקדמים דיפוזיה באמצעות סימולציה מוצגים.

Video: A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

ניתוח שיטתי של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...