שיטה זו מאפשרת לנתח את מחסום הדם - מוח האנושי על ידי מדידת חציית חיידקים על טיפולים שונים. זה עשוי לעזור לגלות את הפתוגנזה של דלקת קרום המוח חיידקי הזיות לאחר הניתוח. זוהי שיטה פשוטה ואת ההשפעות של הטיפול מיוצגים ישירות על ידי מספר החיידקים.
זה יכול להיות שונה כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של תרכובות על התאים אנדותל. התחל בהרכבת צלחת 12 בארות בארון בטיחות ביולוגי. לפרוק את הצלחת וכל הכנס, ולאחר מכן להשתמש מדפים מעוכלים לתפוס את המכניסים בבסיס שלהם ולשים אותם לתוך בארות.
מצפים את הממברנה הנקבובית של כל הכנס עם 90 מיקרוליטרים של 10 מיקרוגרם לכל קולגן מיקרוליטר IV ותערובת פיברונקטין ו דגירה את הצלחת באינקובטור תרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר הדגירה, לשטוף את מוסיף פעמיים על ידי צינור מיליליטר אחד של PBS לתוך כל הכנס ושואב אותו עם משאבת ואקום. לאחר מכן לצייד את הממברנות על ידי צינורות DMEM F12 מראש המלחמה בינוני בתאים העליונים והתחתונים להדגיר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
כדי לזרוע את תאי ה אנדותל מיקרווסקיים אנושיים, שאפו את המדיום מבקבוק תרבות התאים ושטפו את התאים עם 10 מיליליטר של PBS. מכסים את התאים לחלוטין עם חמישה מיליליטר של טריפסין EDTA ו דגירה הבקבוק במשך שלוש עד חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להעביר חמישה מיליליטר של התאים לתוך צינור 15 מיליליטר ולהוסיף חמישה מיליליטר של FCS המכיל בינוני כדי לעצור את התגובה אנזימטית.
צנטריפוגה ההשעיה במשך שלוש דקות ב 210 פעמים g, להסיר את supernatant ולתלות את גלולת התא בחמישה מיליליטר של מדיום. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מתלי התא ל-10 מיקרוליטרים של כתם כחול 0.4%, ולאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של התערובת לתא ספירה. שים את תא הספירה לתוך מונה התאים והתחל את התוכנית המתאימה כדי לוודא שהדלפק ממוקד.
לאחר הספירה, זרע 200, 000 תאים לתוך כל תא עליון על הצלחת 12 היטב דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 14 ימים שינוי התקשורת בתא העליון והתחתון כל יומיים עד שלושה ימים. לאחר 14 ימים, ודא כי קונפליונציית התא היא 100%על ידי דימות אותם עם מיקרוסקופ. יום אחד לפני מדידת חלילות, לשים מושבה אחת של זן E.coli GM2163 לתוך שלושה מיליליטר של מדיום LB.
תרבו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בשייקר דגירה. כדי לטפל בתאים עם תרכובת של ריבית, לדלל אותו לריכוז הסופי שלה בגודל DMEM F12 ולהוסיף תערובת זו לתאים העליונים והתחתונים בצלחת 12 היטב, ולאחר מכן לדגר את הצלחת באינקובטור תרבות התא. לאחר הדגירה, להחליף את המדיום המלא עם מדיום ללא אנטיביוטיקה.
לקבוע את הריכוז של תרבות החיידקים לילה על ידי מדידת הצפיפות האופטית שלה ב 600 ננומטר, ולאחר מכן לדלל אותו OD600 של 0.5 בצינור פלקון 50 מיליליטר. בארון בטיחות ביולוגי, מוסיפים 450 מיקרוליטרים של פתרון החיידקים לכל תא עליון של צלחת 12 בארות, ואז דגירה את הצלחת במשך שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, להסיר את הכנס עם מדפים מדגם 50 microliters של המדיום מכל תא תחתון דואג לא לשפוך את המדיום מן התאים העליונים לתוך התחתונים.
חשוב להפריד בקפדנות את התקשורת של התא העליון והתחתון כמו זליגה מחיידקים של התא העליון יוביל לתוצאות חיוביות שגויות. זרוק כל דגימה על צלחת אגר נפרדת פסים הפתרון עם מפזר תאים. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, ואז לספור את המושבות.
כדי לחקור את ההשפעה של glycation על חצייה מיקרוביאלית דרך מחסום הדם - מוח, תאים טופלו עם 0.5 ו 0.15 מילימולר גליוקסל פתרון במשך שעה אחת עם תאים מטופלים המשמשים פקד. לאחר מכן התגלה הגליקציה באמצעות אימונובלוט עם נוגדנים אנטי-AGE. המושבות החיידקיות שהושגו נספרו והוצגו כמספר המוחלט של מושבות או כמספר המושבות היחסי שנורמלו לשליטה.
דגימות שטופלו גליוקסל הציגו מספר גדל והולך של מושבות המציין כי הטיפול יש השפעה על צפיפות מחסום הסלולר. כדי לחקור את גליקציה חלבון הנגרמת על ידי גלוקוז, THBMECs היו מעובדים גלוקוז נורמלי בינוני גלוקוז גבוה. המספר המוחלט של המושבות והמספר היחסי של מושבות מנורמלות לשליטה הצביעו על כך שלגלוקוז לא הייתה השפעה משמעותית על שלמות מחסום הדם - מוח.
תאים אנדותל מטופלים ניתן לנתח עוד יותר על ידי גישות פרוטומיקה, למשל ספקטרומטריית מסה, כדי לנתח שינויים בפרוטאום. טכניקה זו מסייעת בהבנת מחסום הדם - מוח האנושי וחוצה חיידקים. זה עשוי לשמש כדי לגלות היבטים של הזדקנות ומחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר.
