이 작품 호 부여에서 재정 지원 도이치 가운데 (DFG)에서 만든 PO413/12-1과 라 1028/7-1.

<ol>
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Uwe 마르크스는 CEO와 주주 이며 식도 린드 너는 TissUse GmbH, MOC 기술 및 제조 회사의 주주. 다른 저자는이 종이의 간행물에 관한 관심사의 충돌을 선언합니다.

이 연구는 조직 구조는 멤브레인에 설계를 통해 투과 척도를 개발 하는 방법 문서. Agarose 젤을 통해 분자 크기 변화와 물질의 투과 먼저 테스트 하 고 유효성 검사 메서드와 해당 시뮬레이션 시험 되었다. 그것은 잘 알려진 작은 분자 (젤 침투 착 색 인쇄기에 의해 여과 효과)를 제외 하 고 매트릭스 메쉬를 통해 빠르게 침투. 유사한 관측 sclera26, 인간 표 피 막27, 인간의 피부17및 쥐 피부28을 통해 물질의 크기-배제 실험 되었다. 침투성 계수와 해당 스톡 반경 (설명, 일반적으로 효과적인 분자 반경 보다 작은 분자와 같은 확산 속도와 이동 하드 구의 반지름) 사이 역 상관 관계 표시 되었습니다 26 , 28와 유사한 관계는 다른 분자 크기의 물질 실험에서 관찰 되었다. 침투성 계수 1/스톡 반경에 그려서 작은 분자 크기와 4 개의 그룹에는 선형 상관 관계가 발견 (R2 = 0.93) (그림 6). 이 제안 하는 방법으로 시뮬레이션된 침투성 계수는 현실적인 범위에서 나타냅니다.
실험에서 46.15%의 오차 프란츠 보급 셀 시스템10침투성 실험에 대 한 보도 보다 약간 큽니다. 1 개의 가능한 설명은 나중에 설명 fluorescein-isothiocyanate-dextran의 크기 분포 될 수 있습니다.
설명 하는 방법을 중요 한 장점에 비해 프란츠 보급 셀 시스템을 사용 하 여 방법 있다. 첫째, 설치는 더 조밀한; 실험은 상업 잘 플레이트 (∼ 13 cm x 8.5 c m)의 규모를가지고 하는 막 삽입 시스템에서 직접 실행 됩니다. 반면 별도 프란츠 보급 셀은 각 샘플에 필요한 여러 샘플을을 동시에 실행 될 수 있습니다. 둘째, 피부 모델의 침투성 막 삽입, 재배 수행에 직접 측정할 수 있습니다. 프란츠 유포 세포를 사용 하 여 샘플 밖으로 이동 하 여 더 작은 샘플에 대 한 성가신 이며 또한 보다 시스템에 장착 된 있다.
콜라겐 세포 매트릭스 투과 실험이이 방법은 수 셀 시드 시스템에 성공적으로 적용 될 것을 보였다. 여기에 제시 된 모델 피부 모델;에 대 한 확인 그러나, 다른 종류의 유기 셀 문화, 예를 들면, 신장 또는 간 메서드를 적용할 수 있습니다.
이 연구에서 콜라겐 셀 모델 있는 HaCaT 세포는 완전히 모델 표면 덮여 사용 되었다 ( 그림 5참조). 이 방법은 충분히 HaCaT 레이어 없이 콜라겐 세포 모델 사이의 침투성 계수를 구별 하는 민감한 시연 침투성 계수 감소에 지도 했다. 이상적으로, 피부 모델 진짜 피부29의 표 피에 접근, 방 벽을 구축 해야 합니다 그리고 그것은 따라서 실제 사용 하기 전에 피부 모델의 품질 (예, 진 피, 표 피의 건물)를 확인 해야 합니다. 피부 모델의 개발 기술 얼룩과 시각화 하 고 피부 단백질과 콜라겐30,,3132의 탐지에서 측정할 수 있습니다. 침투성 계수 또한 피부 모델의 개발을 평가 하기 위한 중요 한 요소가 있을 수 있습니다 하지만 추가 실험 이것을 확인 하는 데 필요한. 앞에서 설명한 대로이 메서드는 동시에 여러 개의 샘플을 실행 수 있습니다. 그것은 또한 침투성, 측정 하 고이 매개 변수는 피부 모델의 개발을 관찰 함으로써 재배 기간 동안 샘플을 걸릴 수 있습니다.
침투성 막 젤/콜라겐-셀-모델을 동시에 측정은 주목 한다. 검색 된 침투성 계수는 시스템 관련, 그것에 의하여 다른 피부 모델의 결과 비교 될 수 있다 동일한 막 삽입을 사용 하는 경우. 또한, 피부 모델 테스트 물질 것입니다 모델을 통해 침투 하지 그것에 인접 한, 어떤 것이 유도 오류 침투성 측정 확인 하기 위해 전체 재배 면적을 커버 해야 합니다. 실험 앞으로 간주 되어야 하는 또 다른 측면은 피부 주변 자연 환경. 일반적으로, 피부 표면의 온도 투과 조건에 영향을 미칠 수 있는 내부 지역에 비해 낮습니다.
컴퓨터 시뮬레이션으로 실험실 실험을 정렬 하기 위해 적용 된 시뮬레이션에 대 한 매개 변수 최적화를 가능 하 게 하는 방법 제시 되었다. 시뮬레이션은 작은 분자 크기와 물질에 대 한 실험 데이터를 잘 맞춰을 발견 했다. 그러나, 시뮬레이션 및 실험 데이터 간의 편차는 더 큰 분자 크기와 물질에 대 한 관찰 되었다. 큰 다 당 류 분자는 마찰을 증가 하 고 젤에 확산 과정을 느리게 수 있습니다. 이 효과 사용 하면 비정상적인 확산 실험 간의 편차에 대 한 가능한 이유 및 시뮬레이션 값33,34. 또 다른 설명은 fluorescein isothiocyanate dextran 작은 또는 큰 입자의 존재를 수 있습니다. 제조 업체는 작고 큰 입자가 있을 수 있는 특정된 범위와 평균 크기로 물질의 분자량을 지정 합니다. 그것 아니다 또한 명확 어떻게 분산 된이 물질은, 작은 입자는 젤과 유체 채널 통해 빠르게 침투. 이러한 확산 및 마찰 효과 고려 하는 시뮬레이션을 확장할 수 있다.
침투성 실험 및 시뮬레이션 2 OC.에 사용 하기 위해 개발 되었다 시뮬레이션의 도움으로,이 실험 방법은 더 정교한 실험 설정에 직접 전송할 수 있습니다. 예를 들어 막 삽입 시스템 시뮬레이션 2 OC의 형상 또는 비슷한 설정으로 다른 시스템에 전송 쉽게 수 있습니다. 이 옵션은 변조 시뮬레이션의 미래 실험의 디자인을 지원 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 증발, 비정상적인 보급 및 막 효과 등 부작용 시뮬레이션, 정확도 향상을 향상 시키기 위해 통합할 수 있습니다. 시뮬레이션 프로그램을 변경 하거나 피부 모델 개발의 다른 측면을 조사 하기 위하여 다른 물리적 모듈을 통합으로 뿐만 아니라 시뮬레이션 방정식을 향상 기회를 제공 합니다. 한 예로 포도 당 소비와 젖 산 생산 콜라겐 세포 모델에서의 시뮬레이션입니다.
의료 물질의 테스트는 특히 흥미로운 점은 어떻게 물질 기관-칩 시스템에 배포 됩니다. 내 도움 답변을 질문에 얼마나 빨리 같은 물질 시스템에 침투 하는 시뮬레이션 및 침투성 매개 변수는 농도 멀티 organ 칩에 다른 조직에 사용할 수 있을 것입니다 뿐만 아니라. 이 메서드는 지원 하 고 개발과 같은 장기-온-칩 시스템의 테스트를 향상 시킬 수 있습니다.

유기 일반 3D 문화 약물 개발 및 물질1테스트를 위한 강력한 도구가 되고있다. 이런 점에서 인간의 피부 모델은 화장품 업계에서 그 같은 규제 요구 사항으로 인해 특별 한 관심의. 그들은 그 후로 자신의 단일 기관 문화 다 잘 접시, 또는 추가 기관 모델, 예를 들면, 간2와 함께에서 멀티 organ-칩에 사용 하기 위해 수많은 3D 피부 모델의 개발에 들어서있다.
피부 상응의 재배, 관련 공기 액체 인터페이스 (알리) 적절 한 표 피 분화3에 대 한 필수적인 요소입니다. 하단에 액체 침투성 막으로 혈관의 구성 세포 문화 삽입 일반적으로 알리를 설정 하는 데 사용 됩니다. ALIs (지름 12.2 m m) 12-잘 접시까지 EpiDerm4, Phenion5, Episkin6, 96-잘 (4.26 m m 직경에서)에서 크기와 피부 모델의 문화에 대 한 상업적으로 이용 가능한 피부 모델에서 널리 활용 됩니다. 여기 설명 하는 방법을 막 삽입 시스템에서 물질의 투과를 결정 합니다.
침투성 계수 네이티브 피부5에 비해 어떤 배양된 피부 모델의 품질을 평가 하기 위한 중요 한 매개 변수 이며 얼마나 빨리 평가 하는 데 사용 됩니다 활성 물질이 피부를 통해 마이그레이션. 특히 약 또는 화장품 제품 피부에 적용 될 필요가 있다,이 매개 변수는 활성 에이전트 정확 하 게 그것을 통과 하는 때 이해에 필수적. 시스템의 동작을 예측 하 고 이후 필요한 시간이 걸리는 실험적인 노력을 줄이기 위해 시뮬레이션 수 더, 특히 때 큰 집합이 물질 관련.
프란츠 보급 셀 피부 투과 실험 및 피부 모델5,6,7,,89-의 상태--예술입니다. 이 장치는 고정된 샘플 (확산 배리어) 가진 두 개의 구획이의 사이 구성 됩니다. 물질을 테스트 샘플 (기증자 구획)의 상단에 직접 적용 되 고 반대 (수락자) 구획에 스며드는 화합물의 농도 검출 될 수 있다. 수락자 측에 일정 한 온도 균질 물질 농도 온도 챔버와 자기 활동가 통해 보장 됩니다. 샘플은 프란츠 셀의 수락자에 샘플링 팔에서 취해질 수 있다. 19 센티미터 사이의 179 cm 높이 범위,이 시스템은 비교적 큰10,11. 젤 같은 물질과 조직에 확산 계수 결정에 대 한 또 다른 방법은 FRAP입니다. 이 기술을 사용 하 여 표백의 원리 붙일 젤 하 고 다음 표백된 지역의 복구 시간을 결정에서 입자를 표시 확산 계수12,,1314계산.
또한, 피부15,16에서 물질의 투과 과정을 결정 하기 위하여 푸리에 변환 적외선 (FTIR) 분광학 적외선 빛 흡 광도와 입자 움직임을 감지를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 또는 다른 이미징 방법 (예를 들어, 2-광자 형광 상관 분광학17) 집중적인 악기 비용 필요.
이 문서에서는 메서드 제공 됩니다 직접 측정 막 삽입 시스템 내에서 방 벽의 침투성 피부 모델 경작 하 게 될 수 있다. 이 메서드는 침투성 실험을 작은 샘플 (잘 크기 4.26 m m 최대)의 다 수 있는 소형 시스템에서 실행 될 수 있습니다. 이것은 별도 장치를 장치에 탑재 될 각 조사 필요 하며 작은 샘플 (4.26 m m의 크기)에 대 한 실현 하기 어려운 프란츠 확산 셀 달리 이다. 또한, 메서드 (예:, confocal 또는 multiphoton 현미경) 주요 계측을 필요 하지 않습니다, 때문에 시간 및 비용 감소가 이루어집니다.
실험은 미소 한 구멍이 있는 막에서 수행 된 모든 삽입 agarose 젤 또는 막에 콜라겐 세포 모델의 구성 된 샘플 (장벽) 시스템. 다양 한 분자 크기와 형광 물질 (기증자) 샘플의 상단에 적용 된 및 침투 물질의 농도 형광 플레이트 리더를 사용 하 여 하단 (수락자)에서 발견 되었습니다 ( 그림 1참조). 메서드를 사용 하면 유효성을 검사 하 고이 시뮬레이션의 정확도 테스트, agarose 젤 생산 되었고 장벽으로 사용. Hydrogels는 생물학13에 다공성 매체 확산와 투과 과정의 수사를 위해 일반적으로 사용 됩니다. 메서드는 단순화 된 피부 모델18,19 기본 섬유 아 세포 및 인간 성인 낮은 칼슘 높은 온도 keratinocytes (HaCaT) 세포 (세포-매트릭스 모델), 콜라겐 매트릭스의 구성 된 셀 시드 시스템에서 다음 테스트를 했다 .
또한, 투과 과정 흐름 시뮬레이션 전산 유체 역학을 통해 시뮬레이션 했다. 그것은 즉, 매개 변수 최적화에 의하여 확산 계수 수 계산 실험 데이터에서 발견 되었다. 일반적으로,이 시뮬레이션은 다른 응용 프로그램; 예를 들어, 그것은 짧은 실험에 따라 투과 과정을 예측 가능 하 고 시뮬레이션 실험의 수를 크게 줄일 수 있습니다.
실험 방법 및 시뮬레이션 응용 프로그램 기관-칩 시스템1,20,21을 위해 설계 되었습니다, 그리고 특히 2-기관-칩 (2-OC)1,22, 상업적으로 개발 23,,2425. 원칙적으로, 막 삽입 시스템에 따라 어떤 기관 모델의 투과 과정이 방법으로 설명할 수 있습니다.

<table width="883">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:236px;height:20px;">Agarose</td>
			<td style="width:248px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:112px;">K297.2</td>
			<td style="width:287px;">High Resolution Powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagen&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen R solution 0.4 %</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td>
			<td>880010-12</td>
			<td>High Glucose with L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Biochrom GmbH</td>
			<td>S0615 0114F</td>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46960-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944-500MG</td>
			<td>4000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD10S-250MG</td>
			<td>10 000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD20S-250MG</td>
			<td>20 000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD40S-250MG</td>
			<td>40 000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170120</td>
			<td>no calcium, no magnesium , with phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06467.9010</td>
			<td>granulated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transwell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3391</td>
			<td>96 well, 0.4 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transwell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>734-1563</td>
			<td>12 well, 0.4 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Biochrom GmbH</td>
			<td>L2143</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for determination and simulation of permeability and diffusion in a 3d tissue model in a membrane insert system for multi-well plates

체 외에서 배양 피부 모델 제약 및 화장품 응용 프로그램에 대 한 점점 관련 되 고 물질 테스트 뿐만 아니라 신약 개발에도 사용 됩니다. 이러한 모델은 대부분 막 삽입 시스템의 필수적인 요소가 되 고 다른 물질 쪽으로 그들의 침투성에 경작 된다. 일반적으로 이러한 매개 변수의 결정에 대 한 적용된 방법 일반적으로 큰 샘플 크기 (예를 들어, 프란츠 보급 세포) 또는 힘 드는 장비 (예를 들어, photobleaching (FRAP) 후 형광 복구) 필요합니다. 이 연구는 4.26 m m와 12.2 m m (재배 면적)의 직경 크기 막 삽입 시스템에서 직접 침투성 계수를 결정 하기 위한 메서드를 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 피부 모델을 나타내는 콜라겐 세포 모델 뿐만 아니라 agarose 및 콜라겐 젤 검증 했다. 다른 분자 크기와 다른 세포 모델 (콜라겐 젤, 섬유, 및 HaCaT 구성)를 통해 투과 물질의 투과 과정 정확 하 게 설명 했다.
또한, 위의 실험 방법을 지원 하기 위해 시뮬레이션은 설립 되었다. 14 x 10-10 m 스톡 반경 시뮬레이션 맞는 잘 작은 분자 크기, 물질에 대 한 실험 데이터까지 (4000 MW), 시스템을 설명 하기 위해 유망 도구 이므로. 또한, 시뮬레이션 상당히 실험적인 노력을 줄일 수 있습니다 하 고 확장 하 여 더 복잡 한 설정에 맞게 충분히 강력.

96-잘 막에 침투성 실험 삽입할 2 %agarose 젤 시스템 장벽을 시뮬레이션의 정확도 평가 하기 위해 실시 했다. 45 x 10-10 m 스톡 반경 (376.27-40000 mol wt) 최대 5 x 10-10 m에서 확산 물질의 분자 크기의 영향을 확인 하는 fluorescein 나트륨 소금 (NaFl)와 fluorescein isothiocyanate 항생물질 (FD) 사용 되었다. 시뮬레이션의 기본 매개 변수 최적화 시뮬레이션 실험 데이터에 맞게 사용 되었다.
이 위해, 시뮬레이션된 침투성의 선형 부분의 실험 결과에 비교 했다. 작은 분자 크기에 대 한 시뮬레이션 및 실험 데이터 ( 그림 4a 및 4b 그림참조) FD 4000 80.2%와 99.2 %NaFl 좋은 계약에 있었다. 더 큰 분자 크기 FD만 50.5%, FD 20000, 79.7%, FD 40000 53.6%의 상관 관계를 보여주는 높은 편차를 생성. 시뮬레이션에서 곡선 진행 지연 시작 및 그래프 (참조 그림 4 c-4e)의 더 과정에서 강한 상승에서 보였다.
침투성 계수 및 시뮬레이션된 확산 계수 표시 됩니다 표 4. 투과 계수는 분자 크기 증가 함께 감소 합니다. 표준 편차는 10-8 m/s x 0.08 사이 10-8 m/s x 0.47 (N = 7)는 4.18%와 46.15%의 절대 오차에 대응. 더 큰 분자와 실험 더 큰 절대 오차를 보였다. 시뮬레이션 된 유포 계수 실험 침투성 계수에 매우 유사 하 게 행동 했다. 더 큰 스톡 반지름와 물질 보여 감소 확산 계수, 9.09%와 18.46 %ranged 절대 오차 (N = 3).
추가 투과 실험에서 4 개의 다른 콜라겐 세포 모델 유형 12-잘 막 장벽 삽입 시스템으로 사용 되었다. 이러한 모델 셀 무료 모델 및 셀 모델 표면에 콜라겐 젤에 HaCaT 기본 fibroblasts의 다른 조합으로 구성 됩니다. 다음과 같이 사용 되었다: 셀-무료 모델로, 콜라겐 + 섬유 아 세포 (대령 + F.), 콜라겐 (대령) 콜라겐 + HaCaT (대령 + 헤), 그리고 콜라겐 + 섬유 아 세포, HaCaT (대령 + F. + H.). DMEM + 10% FCS fluorescein 나트륨 소금 기증자 물질으로 사용 되었다. 이미지에 대 한 되며와 (그가) 오신 얼룩 콜라겐 세포 모델의 분석은 사용 되었다. 이 얼룩 이루어졌다 제조업체의 프로토콜을 사용 하 여. 그림 5에서 대표 대령 + F. + H. 모델 같은 얼룩은 표시 됩니다. 그가 약간의 콜라겐 매트릭스 조직 구조 얼룩. 섬유 아 세포는 매트릭스에 있으며 섬유 및 HaCaT 세포의 핵은 어두운 바이올렛에 스테인드. 콜라겐 매트릭스 위에 모델 상단 바깥쪽 레이어를 구축 HaCaTs의 핵 해야 많은 핵을 포함 하는 계층입니다.
표 5, 실험적인 투과 계수 및 시뮬레이션된 유포 계수 나열 됩니다. 대부분 HaCaT 없이 모델에 비해 낮은 투과/확산 계수는 HaCaT와 모델의 추세를 볼 수 있습니다. 투과 계수의 절대 오차는 10.9-24.4%, 그리고에 대 한 확산 계수 5.2%-12.9%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> 그림 1: 시스템을 삽입 하는 막의 침투성 실험의 측면 보기. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> 그림 2: 침투성 실험의 모범적인 그래프. 수락자의 농도 시간이 지남에 따라 플롯 됩니다. 2 점선된 라인 그래프의 거의 선형 부분 대괄호. 선형 부분의 기울기는 침투성 계수를 결정 하는 데 사용 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> 그림 3: 형상 및 막의 메쉬 삽입 시스템 시뮬레이션에. (한) 96-잘 막의 형상 삽입 시스템. (b) 12-잘 막의 형상 삽입 시스템. (c) 96-잘 막의 메쉬 삽입 시스템. (d) 12-잘 막의 메쉬 삽입 시스템. (e) 횡단면 및 막의 매개 변수 삽입 시스템. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> 그림 4: 최적화 된 시뮬레이션을 투과 실험에서 실험 데이터의 비교. fluorescein 나트륨 소금 (a), (b) fluorescein isothiocyanate-dextran 4000 mol wt., (c) 10000 mol wt., (d) 20000 mol wt., 및 (e) 40000 몰 wt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> 그림 5: 대표 그 콜라겐 세포 모델 (콜라겐 + Fibroblasts HaCaT)의 얼룩. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> 그림 6: 96-잘 막에서 fluorescein 나트륨 소금, fluorescein isothiocyanate-dextran을 사용 하 여 1/스톡 반경의 기능으로 침투성 계수 시스템 삽입. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td>Experession mm에서 96 잘 시스템에 대 한</td>
			<td>12 잘 시스템 m m에 대 한 Experssion</td>
			<td>설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [mm]</td>
			<td>14.7 [mm]</td>
			<td>우물의 직경</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_a</td>
			<td>4.26 [mm]</td>
			<td>12.1 [mm]</td>
			<td>막의 직경</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8.79 [mm]</td>
			<td>21.97 [mm]</td>
			<td>수락자의 직경</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>방 벽의 Heigh</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>거리 사이 잘 및 아래쪽</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_a</td>
			<td>4.73 [mm]</td>
			<td>5.24 [mm]</td>
			<td>수락자의 높은</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>침수 깊이</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>침수 공+ 의 반경
</td>
		</tr>
<tr>
<td>r_z</td>
			<td>r + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>z-침수 공+ 의 위치
</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: "화학 종 전송" 시뮬레이션에 대 한 매개 변수 기하학. + Agarose의 시뮬레이션에 대 한 사용에 96 잘 막에서 젤 시스템을 삽입 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td>식</td>
			<td>값</td>
			<td>설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>0.26576 mol/m2
</td>
			<td>Fl.So의 농도입니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 [mg/ml] / 4000 [g/mol]</td>
			<td>0.5 mol/m2</td>
			<td>FD 4.000의 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [mg/ml] / 10000 [g/mol]</td>
			<td>0.2 mol/m2</td>
			<td>FD 10.000의 집중</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [mg/ml] / 20000 [g/mol]</td>
			<td>0.1 mol/m2</td>
			<td>FD 20.000의 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [mg/ml] / 40000 [g/mol]</td>
			<td>0.05 mol/m2</td>
			<td>FD 40.000의 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m ^2/s]</td>
			<td>1E-9 m2/s</td>
			<td>물 혼합의 확산 계수</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: "화학 종 전송" 시뮬레이션에 대 한 실제 매개 변수.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td>식</td>
			<td>설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>수락자 농도의 정의</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1 e-10</td>
			<td>D 계수 변화</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: "최적화" 시뮬레이션에 대 한 매개 변수입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>침투</td>
			<td>침투성 계수 (m/s) x 10-8</td>
			<td>확산 계수 (m/s2) x 10-10</td>
			<td>Permeate (m) x 10-10 의 스토크스 반경</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So입니다.</td>
			<td>4.79 ± 0.20</td>
			<td>1.94 ± 0.34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4000</td>
			<td>2.37 ± 0.31</td>
			<td>0.65 ± 0.12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1.67 ± 0.47</td>
			<td>0.22 ± 0.02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20000</td>
			<td>0.65 ± 0.30</td>
			<td>0.29 ± 0.04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40000</td>
			<td>0.27 ± 0.08</td>
			<td>0.14 ± 0.02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4: 2 %Agarose 젤 + 96 잘 막에서 막 통해 다른 스톡 radius와 물질의 침투성 및 확산 계수 시스템 삽입. (fluorescein 나트륨 소금 층 그래서, fitc dextran = FD =).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>모델</td>
			<td>침투성 계수 (m/s) x 10-8</td>
			<td>확산 계수 (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>대령</td>
			<td>2.18 ± 0.29</td>
			<td>1.22 ± 0.06</td>
		</tr>
<tr>
<td>대령 + F입니다.</td>
			<td>1.77 ± 0.38</td>
			<td>0.93 ± 0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>대령 + H입니다.</td>
			<td>1.64 ± 0.40</td>
			<td>0.96 ± 0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>대령 + F. + H입니다.</td>
			<td>1.65 ± 0.18</td>
			<td>0.88 ± 0.11</td>
		</tr>
</tbody></table>표 5: 12에서 콜라겐 세포 모델을 통해 fluorescein 나트륨 소금의 침투성 및 확산 계수-잘 막 삽입 시스템 (대령 = 콜라겐, F. = 섬유, H. HaCaT =).

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A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

침투성 막에의 결심을 위한 방법은 다 잘 번호판에 대 한 시스템 삽입 하 고 매개 변수 최적화 시뮬레이션을 사용 하 여 확산 계수 계산에 대 한 실리콘에서 제공 됩니다.

다 잘 판에 대 한 시스템을 삽입 하는 결단 력과 침투성 막에 3 차원 조직 모델에서 보급의 시뮬레이션 하는 방법

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.0K 조회수.  Hamburg University of Technology. 침투성 막에의 결심을 위한 방법은 다 잘 번호판에 대 한 시스템 삽입 하 고 매개 변수 최적화 시뮬레이션을 사용 하 여 확산 계수 계산에 대 한 실리콘에서 제공 됩니다.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

연구

생체공학

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

의 체계적인 분석<em&gt; 체외</em멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용하여&gt; 셀 롤링

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

3 차원 조직 공학 인간의 식도 점막 모델의 제조, 특성 및 사용 가능성

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링<em&gt; 체외</em&gt; /<em&gt; 인 실리코</em특정 돌연변이 배경에서 약물의 효과를 예측&gt; 폐 종양 모델

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...