이 작품 호 부여에서 재정 지원 도이치 가운데 (DFG)에서 만든 PO413/12-1과 라 1028/7-1.

<ol>
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Uwe 마르크스는 CEO와 주주 이며 식도 린드 너는 TissUse GmbH, MOC 기술 및 제조 회사의 주주. 다른 저자는이 종이의 간행물에 관한 관심사의 충돌을 선언합니다.

이 연구는 조직 구조는 멤브레인에 설계를 통해 투과 척도를 개발 하는 방법 문서. Agarose 젤을 통해 분자 크기 변화와 물질의 투과 먼저 테스트 하 고 유효성 검사 메서드와 해당 시뮬레이션 시험 되었다. 그것은 잘 알려진 작은 분자 (젤 침투 착 색 인쇄기에 의해 여과 효과)를 제외 하 고 매트릭스 메쉬를 통해 빠르게 침투. 유사한 관측 sclera26, 인간 표 피 막27, 인간의 피부17및 쥐 피부28을 통해 물질의 크기-배제 실험 되었다. 침투성 계수와 해당 스톡 반경 (설명, 일반적으로 효과적인 분자 반경 보다 작은 분자와 같은 확산 속도와 이동 하드 구의 반지름) 사이 역 상관 관계 표시 되었습니다 26 , 28와 유사한 관계는 다른 분자 크기의 물질 실험에서 관찰 되었다. 침투성 계수 1/스톡 반경에 그려서 작은 분자 크기와 4 개의 그룹에는 선형 상관 관계가 발견 (R2 = 0.93) (그림 6). 이 제안 하는 방법으로 시뮬레이션된 침투성 계수는 현실적인 범위에서 나타냅니다.
실험에서 46.15%의 오차 프란츠 보급 셀 시스템10침투성 실험에 대 한 보도 보다 약간 큽니다. 1 개의 가능한 설명은 나중에 설명 fluorescein-isothiocyanate-dextran의 크기 분포 될 수 있습니다.
설명 하는 방법을 중요 한 장점에 비해 프란츠 보급 셀 시스템을 사용 하 여 방법 있다. 첫째, 설치는 더 조밀한; 실험은 상업 잘 플레이트 (∼ 13 cm x 8.5 c m)의 규모를가지고 하는 막 삽입 시스템에서 직접 실행 됩니다. 반면 별도 프란츠 보급 셀은 각 샘플에 필요한 여러 샘플을을 동시에 실행 될 수 있습니다. 둘째, 피부 모델의 침투성 막 삽입, 재배 수행에 직접 측정할 수 있습니다. 프란츠 유포 세포를 사용 하 여 샘플 밖으로 이동 하 여 더 작은 샘플에 대 한 성가신 이며 또한 보다 시스템에 장착 된 있다.
콜라겐 세포 매트릭스 투과 실험이이 방법은 수 셀 시드 시스템에 성공적으로 적용 될 것을 보였다. 여기에 제시 된 모델 피부 모델;에 대 한 확인 그러나, 다른 종류의 유기 셀 문화, 예를 들면, 신장 또는 간 메서드를 적용할 수 있습니다.
이 연구에서 콜라겐 셀 모델 있는 HaCaT 세포는 완전히 모델 표면 덮여 사용 되었다 ( 그림 5참조). 이 방법은 충분히 HaCaT 레이어 없이 콜라겐 세포 모델 사이의 침투성 계수를 구별 하는 민감한 시연 침투성 계수 감소에 지도 했다. 이상적으로, 피부 모델 진짜 피부29의 표 피에 접근, 방 벽을 구축 해야 합니다 그리고 그것은 따라서 실제 사용 하기 전에 피부 모델의 품질 (예, 진 피, 표 피의 건물)를 확인 해야 합니다. 피부 모델의 개발 기술 얼룩과 시각화 하 고 피부 단백질과 콜라겐30,,3132의 탐지에서 측정할 수 있습니다. 침투성 계수 또한 피부 모델의 개발을 평가 하기 위한 중요 한 요소가 있을 수 있습니다 하지만 추가 실험 이것을 확인 하는 데 필요한. 앞에서 설명한 대로이 메서드는 동시에 여러 개의 샘플을 실행 수 있습니다. 그것은 또한 침투성, 측정 하 고이 매개 변수는 피부 모델의 개발을 관찰 함으로써 재배 기간 동안 샘플을 걸릴 수 있습니다.
침투성 막 젤/콜라겐-셀-모델을 동시에 측정은 주목 한다. 검색 된 침투성 계수는 시스템 관련, 그것에 의하여 다른 피부 모델의 결과 비교 될 수 있다 동일한 막 삽입을 사용 하는 경우. 또한, 피부 모델 테스트 물질 것입니다 모델을 통해 침투 하지 그것에 인접 한, 어떤 것이 유도 오류 침투성 측정 확인 하기 위해 전체 재배 면적을 커버 해야 합니다. 실험 앞으로 간주 되어야 하는 또 다른 측면은 피부 주변 자연 환경. 일반적으로, 피부 표면의 온도 투과 조건에 영향을 미칠 수 있는 내부 지역에 비해 낮습니다.
컴퓨터 시뮬레이션으로 실험실 실험을 정렬 하기 위해 적용 된 시뮬레이션에 대 한 매개 변수 최적화를 가능 하 게 하는 방법 제시 되었다. 시뮬레이션은 작은 분자 크기와 물질에 대 한 실험 데이터를 잘 맞춰을 발견 했다. 그러나, 시뮬레이션 및 실험 데이터 간의 편차는 더 큰 분자 크기와 물질에 대 한 관찰 되었다. 큰 다 당 류 분자는 마찰을 증가 하 고 젤에 확산 과정을 느리게 수 있습니다. 이 효과 사용 하면 비정상적인 확산 실험 간의 편차에 대 한 가능한 이유 및 시뮬레이션 값33,34. 또 다른 설명은 fluorescein isothiocyanate dextran 작은 또는 큰 입자의 존재를 수 있습니다. 제조 업체는 작고 큰 입자가 있을 수 있는 특정된 범위와 평균 크기로 물질의 분자량을 지정 합니다. 그것 아니다 또한 명확 어떻게 분산 된이 물질은, 작은 입자는 젤과 유체 채널 통해 빠르게 침투. 이러한 확산 및 마찰 효과 고려 하는 시뮬레이션을 확장할 수 있다.
침투성 실험 및 시뮬레이션 2 OC.에 사용 하기 위해 개발 되었다 시뮬레이션의 도움으로,이 실험 방법은 더 정교한 실험 설정에 직접 전송할 수 있습니다. 예를 들어 막 삽입 시스템 시뮬레이션 2 OC의 형상 또는 비슷한 설정으로 다른 시스템에 전송 쉽게 수 있습니다. 이 옵션은 변조 시뮬레이션의 미래 실험의 디자인을 지원 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 증발, 비정상적인 보급 및 막 효과 등 부작용 시뮬레이션, 정확도 향상을 향상 시키기 위해 통합할 수 있습니다. 시뮬레이션 프로그램을 변경 하거나 피부 모델 개발의 다른 측면을 조사 하기 위하여 다른 물리적 모듈을 통합으로 뿐만 아니라 시뮬레이션 방정식을 향상 기회를 제공 합니다. 한 예로 포도 당 소비와 젖 산 생산 콜라겐 세포 모델에서의 시뮬레이션입니다.
의료 물질의 테스트는 특히 흥미로운 점은 어떻게 물질 기관-칩 시스템에 배포 됩니다. 내 도움 답변을 질문에 얼마나 빨리 같은 물질 시스템에 침투 하는 시뮬레이션 및 침투성 매개 변수는 농도 멀티 organ 칩에 다른 조직에 사용할 수 있을 것입니다 뿐만 아니라. 이 메서드는 지원 하 고 개발과 같은 장기-온-칩 시스템의 테스트를 향상 시킬 수 있습니다.

유기 일반 3D 문화 약물 개발 및 물질1테스트를 위한 강력한 도구가 되고있다. 이런 점에서 인간의 피부 모델은 화장품 업계에서 그 같은 규제 요구 사항으로 인해 특별 한 관심의. 그들은 그 후로 자신의 단일 기관 문화 다 잘 접시, 또는 추가 기관 모델, 예를 들면, 간2와 함께에서 멀티 organ-칩에 사용 하기 위해 수많은 3D 피부 모델의 개발에 들어서있다.
피부 상응의 재배, 관련 공기 액체 인터페이스 (알리) 적절 한 표 피 분화3에 대 한 필수적인 요소입니다. 하단에 액체 침투성 막으로 혈관의 구성 세포 문화 삽입 일반적으로 알리를 설정 하는 데 사용 됩니다. ALIs (지름 12.2 m m) 12-잘 접시까지 EpiDerm4, Phenion5, Episkin6, 96-잘 (4.26 m m 직경에서)에서 크기와 피부 모델의 문화에 대 한 상업적으로 이용 가능한 피부 모델에서 널리 활용 됩니다. 여기 설명 하는 방법을 막 삽입 시스템에서 물질의 투과를 결정 합니다.
침투성 계수 네이티브 피부5에 비해 어떤 배양된 피부 모델의 품질을 평가 하기 위한 중요 한 매개 변수 이며 얼마나 빨리 평가 하는 데 사용 됩니다 활성 물질이 피부를 통해 마이그레이션. 특히 약 또는 화장품 제품 피부에 적용 될 필요가 있다,이 매개 변수는 활성 에이전트 정확 하 게 그것을 통과 하는 때 이해에 필수적. 시스템의 동작을 예측 하 고 이후 필요한 시간이 걸리는 실험적인 노력을 줄이기 위해 시뮬레이션 수 더, 특히 때 큰 집합이 물질 관련.
프란츠 보급 셀 피부 투과 실험 및 피부 모델5,6,7,,89-의 상태--예술입니다. 이 장치는 고정된 샘플 (확산 배리어) 가진 두 개의 구획이의 사이 구성 됩니다. 물질을 테스트 샘플 (기증자 구획)의 상단에 직접 적용 되 고 반대 (수락자) 구획에 스며드는 화합물의 농도 검출 될 수 있다. 수락자 측에 일정 한 온도 균질 물질 농도 온도 챔버와 자기 활동가 통해 보장 됩니다. 샘플은 프란츠 셀의 수락자에 샘플링 팔에서 취해질 수 있다. 19 센티미터 사이의 179 cm 높이 범위,이 시스템은 비교적 큰10,11. 젤 같은 물질과 조직에 확산 계수 결정에 대 한 또 다른 방법은 FRAP입니다. 이 기술을 사용 하 여 표백의 원리 붙일 젤 하 고 다음 표백된 지역의 복구 시간을 결정에서 입자를 표시 확산 계수12,,1314계산.
또한, 피부15,16에서 물질의 투과 과정을 결정 하기 위하여 푸리에 변환 적외선 (FTIR) 분광학 적외선 빛 흡 광도와 입자 움직임을 감지를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 또는 다른 이미징 방법 (예를 들어, 2-광자 형광 상관 분광학17) 집중적인 악기 비용 필요.
이 문서에서는 메서드 제공 됩니다 직접 측정 막 삽입 시스템 내에서 방 벽의 침투성 피부 모델 경작 하 게 될 수 있다. 이 메서드는 침투성 실험을 작은 샘플 (잘 크기 4.26 m m 최대)의 다 수 있는 소형 시스템에서 실행 될 수 있습니다. 이것은 별도 장치를 장치에 탑재 될 각 조사 필요 하며 작은 샘플 (4.26 m m의 크기)에 대 한 실현 하기 어려운 프란츠 확산 셀 달리 이다. 또한, 메서드 (예:, confocal 또는 multiphoton 현미경) 주요 계측을 필요 하지 않습니다, 때문에 시간 및 비용 감소가 이루어집니다.
실험은 미소 한 구멍이 있는 막에서 수행 된 모든 삽입 agarose 젤 또는 막에 콜라겐 세포 모델의 구성 된 샘플 (장벽) 시스템. 다양 한 분자 크기와 형광 물질 (기증자) 샘플의 상단에 적용 된 및 침투 물질의 농도 형광 플레이트 리더를 사용 하 여 하단 (수락자)에서 발견 되었습니다 ( 그림 1참조). 메서드를 사용 하면 유효성을 검사 하 고이 시뮬레이션의 정확도 테스트, agarose 젤 생산 되었고 장벽으로 사용. Hydrogels는 생물학13에 다공성 매체 확산와 투과 과정의 수사를 위해 일반적으로 사용 됩니다. 메서드는 단순화 된 피부 모델18,19 기본 섬유 아 세포 및 인간 성인 낮은 칼슘 높은 온도 keratinocytes (HaCaT) 세포 (세포-매트릭스 모델), 콜라겐 매트릭스의 구성 된 셀 시드 시스템에서 다음 테스트를 했다 .
또한, 투과 과정 흐름 시뮬레이션 전산 유체 역학을 통해 시뮬레이션 했다. 그것은 즉, 매개 변수 최적화에 의하여 확산 계수 수 계산 실험 데이터에서 발견 되었다. 일반적으로,이 시뮬레이션은 다른 응용 프로그램; 예를 들어, 그것은 짧은 실험에 따라 투과 과정을 예측 가능 하 고 시뮬레이션 실험의 수를 크게 줄일 수 있습니다.
실험 방법 및 시뮬레이션 응용 프로그램 기관-칩 시스템1,20,21을 위해 설계 되었습니다, 그리고 특히 2-기관-칩 (2-OC)1,22, 상업적으로 개발 23,,2425. 원칙적으로, 막 삽입 시스템에 따라 어떤 기관 모델의 투과 과정이 방법으로 설명할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>High Resolution Powder</td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Collagen R solution 0.4 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td><td>880010-12</td><td>High Glucose with L-Glutamine</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Fluorescein Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>no calcium, no magnesium , with phenol red</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>granulated</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>tablets</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning (VWR)</td><td>734-1563</td><td>12 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>with EDTA</td></tr></tbody></table>

a method for determination and simulation of permeability and diffusion in a 3d tissue model in a membrane insert system for multi-well plates

체 외에서 배양 피부 모델 제약 및 화장품 응용 프로그램에 대 한 점점 관련 되 고 물질 테스트 뿐만 아니라 신약 개발에도 사용 됩니다. 이러한 모델은 대부분 막 삽입 시스템의 필수적인 요소가 되 고 다른 물질 쪽으로 그들의 침투성에 경작 된다. 일반적으로 이러한 매개 변수의 결정에 대 한 적용된 방법 일반적으로 큰 샘플 크기 (예를 들어, 프란츠 보급 세포) 또는 힘 드는 장비 (예를 들어, photobleaching (FRAP) 후 형광 복구) 필요합니다. 이 연구는 4.26 m m와 12.2 m m (재배 면적)의 직경 크기 막 삽입 시스템에서 직접 침투성 계수를 결정 하기 위한 메서드를 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 피부 모델을 나타내는 콜라겐 세포 모델 뿐만 아니라 agarose 및 콜라겐 젤 검증 했다. 다른 분자 크기와 다른 세포 모델 (콜라겐 젤, 섬유, 및 HaCaT 구성)를 통해 투과 물질의 투과 과정 정확 하 게 설명 했다.
또한, 위의 실험 방법을 지원 하기 위해 시뮬레이션은 설립 되었다. 14 x 10-10 m 스톡 반경 시뮬레이션 맞는 잘 작은 분자 크기, 물질에 대 한 실험 데이터까지 (4000 MW), 시스템을 설명 하기 위해 유망 도구 이므로. 또한, 시뮬레이션 상당히 실험적인 노력을 줄일 수 있습니다 하 고 확장 하 여 더 복잡 한 설정에 맞게 충분히 강력.

96-잘 막에 침투성 실험 삽입할 2 %agarose 젤 시스템 장벽을 시뮬레이션의 정확도 평가 하기 위해 실시 했다. 45 x 10-10 m 스톡 반경 (376.27-40000 mol wt) 최대 5 x 10-10 m에서 확산 물질의 분자 크기의 영향을 확인 하는 fluorescein 나트륨 소금 (NaFl)와 fluorescein isothiocyanate 항생물질 (FD) 사용 되었다. 시뮬레이션의 기본 매개 변수 최적화 시뮬레이션 실험 데이터에 맞게 사용 되었다.
이 위해, 시뮬레이션된 침투성의 선형 부분의 실험 결과에 비교 했다. 작은 분자 크기에 대 한 시뮬레이션 및 실험 데이터 ( 그림 4a 및 4b 그림참조) FD 4000 80.2%와 99.2 %NaFl 좋은 계약에 있었다. 더 큰 분자 크기 FD만 50.5%, FD 20000, 79.7%, FD 40000 53.6%의 상관 관계를 보여주는 높은 편차를 생성. 시뮬레이션에서 곡선 진행 지연 시작 및 그래프 (참조 그림 4 c-4e)의 더 과정에서 강한 상승에서 보였다.
침투성 계수 및 시뮬레이션된 확산 계수 표시 됩니다 표 4. 투과 계수는 분자 크기 증가 함께 감소 합니다. 표준 편차는 10-8 m/s x 0.08 사이 10-8 m/s x 0.47 (N = 7)는 4.18%와 46.15%의 절대 오차에 대응. 더 큰 분자와 실험 더 큰 절대 오차를 보였다. 시뮬레이션 된 유포 계수 실험 침투성 계수에 매우 유사 하 게 행동 했다. 더 큰 스톡 반지름와 물질 보여 감소 확산 계수, 9.09%와 18.46 %ranged 절대 오차 (N = 3).
추가 투과 실험에서 4 개의 다른 콜라겐 세포 모델 유형 12-잘 막 장벽 삽입 시스템으로 사용 되었다. 이러한 모델 셀 무료 모델 및 셀 모델 표면에 콜라겐 젤에 HaCaT 기본 fibroblasts의 다른 조합으로 구성 됩니다. 다음과 같이 사용 되었다: 셀-무료 모델로, 콜라겐 + 섬유 아 세포 (대령 + F.), 콜라겐 (대령) 콜라겐 + HaCaT (대령 + 헤), 그리고 콜라겐 + 섬유 아 세포, HaCaT (대령 + F. + H.). DMEM + 10% FCS fluorescein 나트륨 소금 기증자 물질으로 사용 되었다. 이미지에 대 한 되며와 (그가) 오신 얼룩 콜라겐 세포 모델의 분석은 사용 되었다. 이 얼룩 이루어졌다 제조업체의 프로토콜을 사용 하 여. 그림 5에서 대표 대령 + F. + H. 모델 같은 얼룩은 표시 됩니다. 그가 약간의 콜라겐 매트릭스 조직 구조 얼룩. 섬유 아 세포는 매트릭스에 있으며 섬유 및 HaCaT 세포의 핵은 어두운 바이올렛에 스테인드. 콜라겐 매트릭스 위에 모델 상단 바깥쪽 레이어를 구축 HaCaTs의 핵 해야 많은 핵을 포함 하는 계층입니다.
표 5, 실험적인 투과 계수 및 시뮬레이션된 유포 계수 나열 됩니다. 대부분 HaCaT 없이 모델에 비해 낮은 투과/확산 계수는 HaCaT와 모델의 추세를 볼 수 있습니다. 투과 계수의 절대 오차는 10.9-24.4%, 그리고에 대 한 확산 계수 5.2%-12.9%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> 그림 1: 시스템을 삽입 하는 막의 침투성 실험의 측면 보기. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> 그림 2: 침투성 실험의 모범적인 그래프. 수락자의 농도 시간이 지남에 따라 플롯 됩니다. 2 점선된 라인 그래프의 거의 선형 부분 대괄호. 선형 부분의 기울기는 침투성 계수를 결정 하는 데 사용 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> 그림 3: 형상 및 막의 메쉬 삽입 시스템 시뮬레이션에. (한) 96-잘 막의 형상 삽입 시스템. (b) 12-잘 막의 형상 삽입 시스템. (c) 96-잘 막의 메쉬 삽입 시스템. (d) 12-잘 막의 메쉬 삽입 시스템. (e) 횡단면 및 막의 매개 변수 삽입 시스템. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> 그림 4: 최적화 된 시뮬레이션을 투과 실험에서 실험 데이터의 비교. fluorescein 나트륨 소금 (a), (b) fluorescein isothiocyanate-dextran 4000 mol wt., (c) 10000 mol wt., (d) 20000 mol wt., 및 (e) 40000 몰 wt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> 그림 5: 대표 그 콜라겐 세포 모델 (콜라겐 + Fibroblasts HaCaT)의 얼룩. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> 그림 6: 96-잘 막에서 fluorescein 나트륨 소금, fluorescein isothiocyanate-dextran을 사용 하 여 1/스톡 반경의 기능으로 침투성 계수 시스템 삽입. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td>Experession mm에서 96 잘 시스템에 대 한</td>
			<td>12 잘 시스템 m m에 대 한 Experssion</td>
			<td>설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [mm]</td>
			<td>14.7 [mm]</td>
			<td>우물의 직경</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_a</td>
			<td>4.26 [mm]</td>
			<td>12.1 [mm]</td>
			<td>막의 직경</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8.79 [mm]</td>
			<td>21.97 [mm]</td>
			<td>수락자의 직경</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>방 벽의 Heigh</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>거리 사이 잘 및 아래쪽</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_a</td>
			<td>4.73 [mm]</td>
			<td>5.24 [mm]</td>
			<td>수락자의 높은</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>침수 깊이</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>침수 공+ 의 반경
</td>
		</tr>
<tr>
<td>r_z</td>
			<td>r + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>z-침수 공+ 의 위치
</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: "화학 종 전송" 시뮬레이션에 대 한 매개 변수 기하학. + Agarose의 시뮬레이션에 대 한 사용에 96 잘 막에서 젤 시스템을 삽입 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td>식</td>
			<td>값</td>
			<td>설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>0.26576 mol/m2
</td>
			<td>Fl.So의 농도입니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 [mg/ml] / 4000 [g/mol]</td>
			<td>0.5 mol/m2</td>
			<td>FD 4.000의 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [mg/ml] / 10000 [g/mol]</td>
			<td>0.2 mol/m2</td>
			<td>FD 10.000의 집중</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [mg/ml] / 20000 [g/mol]</td>
			<td>0.1 mol/m2</td>
			<td>FD 20.000의 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [mg/ml] / 40000 [g/mol]</td>
			<td>0.05 mol/m2</td>
			<td>FD 40.000의 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m ^2/s]</td>
			<td>1E-9 m2/s</td>
			<td>물 혼합의 확산 계수</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: "화학 종 전송" 시뮬레이션에 대 한 실제 매개 변수.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td>식</td>
			<td>설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>수락자 농도의 정의</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1 e-10</td>
			<td>D 계수 변화</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: "최적화" 시뮬레이션에 대 한 매개 변수입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>침투</td>
			<td>침투성 계수 (m/s) x 10-8</td>
			<td>확산 계수 (m/s2) x 10-10</td>
			<td>Permeate (m) x 10-10 의 스토크스 반경</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So입니다.</td>
			<td>4.79 ± 0.20</td>
			<td>1.94 ± 0.34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4000</td>
			<td>2.37 ± 0.31</td>
			<td>0.65 ± 0.12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1.67 ± 0.47</td>
			<td>0.22 ± 0.02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20000</td>
			<td>0.65 ± 0.30</td>
			<td>0.29 ± 0.04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40000</td>
			<td>0.27 ± 0.08</td>
			<td>0.14 ± 0.02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4: 2 %Agarose 젤 + 96 잘 막에서 막 통해 다른 스톡 radius와 물질의 침투성 및 확산 계수 시스템 삽입. (fluorescein 나트륨 소금 층 그래서, fitc dextran = FD =).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>모델</td>
			<td>침투성 계수 (m/s) x 10-8</td>
			<td>확산 계수 (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>대령</td>
			<td>2.18 ± 0.29</td>
			<td>1.22 ± 0.06</td>
		</tr>
<tr>
<td>대령 + F입니다.</td>
			<td>1.77 ± 0.38</td>
			<td>0.93 ± 0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>대령 + H입니다.</td>
			<td>1.64 ± 0.40</td>
			<td>0.96 ± 0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>대령 + F. + H입니다.</td>
			<td>1.65 ± 0.18</td>
			<td>0.88 ± 0.11</td>
		</tr>
</tbody></table>표 5: 12에서 콜라겐 세포 모델을 통해 fluorescein 나트륨 소금의 침투성 및 확산 계수-잘 막 삽입 시스템 (대령 = 콜라겐, F. = 섬유, H. HaCaT =).

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A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

침투성 막에의 결심을 위한 방법은 다 잘 번호판에 대 한 시스템 삽입 하 고 매개 변수 최적화 시뮬레이션을 사용 하 여 확산 계수 계산에 대 한 실리콘에서 제공 됩니다.

다 잘 판에 대 한 시스템을 삽입 하는 결단 력과 침투성 막에 3 차원 조직 모델에서 보급의 시뮬레이션 하는 방법

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K 조회수.  Hamburg University of Technology. 침투성 막에의 결심을 위한 방법은 다 잘 번호판에 대 한 시스템 삽입 하 고 매개 변수 최적화 시뮬레이션을 사용 하 여 확산 계수 계산에 대 한 실리콘에서 제공 됩니다.

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A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

연구

암 연구학

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

생체공학

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현은 포유 동물 숙주 세포에서 분비 세균 독소의 효과를 연구하기

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

면역학 및 감염병학

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

미세 혈관 내피 세포를 통해 미생물 통과에 의해 혈액 - 뇌 장벽의 투과성 분석

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

면역형광 염색을 통한 혈액-뇌장벽 모델 분석

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

저자 스포트라이트: 인체 조직 연구를 위한 조직 칩 기술의 사용 발전 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Open-Well 및 Microfluidic 모드가 있는 재구성 가능한 Barrier Tissue Platform

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. However, these platforms have not gained widespread adoption in bioscience laboratories where open-well, membrane-based approaches serve as the gold standard for mimicking tissue barriers, despite lacking fluid flow capabilities. This issue can be primarily attributed to the incompatibility of existing microphysiological systems with standard protocols and tools developed for open-well systems.
Here, we present a protocol for creating a reconfigurable membrane-based platform with an open-well structure, flow enhancement capability, and compatibility with conventional protocols. This system utilizes a magnetic assembly approach that enables reversible switching between open-well and microfluidic modes. With this approach, users have the flexibility to begin an experiment in the open-well format using standard protocols and add or remove flow capabilities as needed. To demonstrate the practical usage of this system and its compatibility with standard techniques, an endothelial cell monolayer was established in an open-well format. The system was reconfigured to introduce fluid flow and then switched to the open-well format to conduct immunostaining and RNA extraction. Due to its compatibility with conventional open-well protocols and flow enhancement capability, this reconfigurable design is expected to be adopted by both engineering and bioscience laboratories.

저자 스포트라이트: 인간 장벽 조직을 모방하기 위한 고유한 모듈식 미세생리학적 시스템 개발

This protocol describes a reconfigurable membrane-based cell culture platform that integrates the open-well format with fluid flow capabilities. This platform is compatible with standard protocols and allows for reversible transitions between open-well and microfluidic culture modes, accommodating the needs of both engineering and bioscience laboratories.

정적 장벽 조직 모델을 동적 미세생리학 시스템으로 변환

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. ...

다 잘 판에 대 한 시스템을 삽입 하는 결단 력과 침투성 막에 3 차원 조직 모델에서 보급의 시뮬레이션 하는 방법

요약

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종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

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방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현은 포유 동물 숙주 세포에서 분비 세균 독소의 효과를 연구하기

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혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

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