שיטת הקצב היה פיתח, אופטימיזציה על ידי חברי הקבוצה דופרי (מנדרינית, בריטניה) שונים לאורך השנים, אנו מעריכים כל התרומות שלהם. עבודה זו מומן כחלק של DOE המכון BioEnergy משותף (http://www.jbei.org) נתמכת על ידי מחלקת האנרגיה של ארה ב, משרד המדע, משרד הביולוגיים המחקר הסביבתי, באמצעות חוזה דה-AC02-05CH11231 בין לורנס המעבדה הלאומית ברקלי, מחלקת האנרגיה של ארצות הברית. אנו מודים גם תיאה פיק ו- Vy Ngo לקבלת עזרה בהכנת הדגימות csla9 .

1. קציר של חומר צמחי <ol><li>הקציר חומר צמחי טריים (~ 20 מ ג), מיד לתוכה אתנול 96% (v/v), דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה מבטל כל דופן התא משפילים אנזימים הנוכחי. עבור חומר יבש, מתחילים בשלב 2- 
	התראה: אתנול הוא דליק. 
	הערה: עלה אחד גזע או רוזט יספק מספיק חומר לניתוח. עם זאת, פחות שגיאות לצוץ אם בכמות גדולה יותר של רקמה זו איחדו וניתח מכיוון שזה קל יותר שוקל ולטפל.</li>
	<li>רקמה סוג רשומה בקפידה, שלב התפתחותי, כמבנה רב-סוכר משתנה עם שניהם. לדוגמה, עם תודרנית לבנה (בשימוש כאן), שלב הרקמה לפי השיטות של בויס. et al. 15 הערה: ב פרוטוקול זה, השתמשנו החצי התחתון של הגזע ינפלוראסכאנך, איפה silique הראשון הינו מאורך מלא אבל לא הצהבה.</li></ol>
 2. הכנה של אלכוהול לא מסיסים שאריות (אוויר) <ol><li>הכן אוויר, בעקבות השיטה של מורטימר. et al. 9 או שיטה דומה אחרת, על מנת לייצר אבקה חסר סוכרים מסיסים, כגון סוכרוז, עמילן.</li>
</ol> 3. Aliquoting וטרום טיפול של אוויר הערה: הכמות המדויקת של אויר הדרוש עבור כל דגימה יהיה תלוי (א) של השפע את רב-סוכר עניין בחומר ו- (ב) בגודל ממוצעת של oligosaccharides שפורסמו על ידי GH. השיטה מוסיף מולקולה בודדת פלורסנט עד הסוף תוך צמצום של. פחמימה # מיון, כל הפחמימות-כך מספר oligosaccharides קובע את הרגישות של הניסוי. כקו מנחה, glucomannan בגזע תודרנית מתעכל עם GH5/GH26 (כמתואר), 500 µg מומלץ 11, ואילו xylan בגזע תודרנית מתעכל עם GH11, מומלץ 100 µg כמו מורטימר &#39; s המחקר 3. <ol><li>שוקל אוויר (10-15 מ ג) לתוך שפופרת צנטרפוגה 15-mL, ולהוסיף H 2 O ריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל. מערבולת כדי להשיג על ההשעיה אפילו. אם זה בעייתי, השתמש מהמגן זכוכית כדי לסייע תהליך זה-</li>
	<li>µG aliquot 500 לתוך microfuge צינורות. יבש aliquots באמצעות צנטריפוגה ואקום (ראה את הטבלה של חומרים) לילה ב- 30 ° C.</li>
	<li>האוויר לטיפול מראש עם 1 M NaOH (20 µL) לשעה בטמפרטורת החדר; זה מבטל את acetylates של סוכרים, מתנפח microfibrils תאית, לשבש את מבנה ביומסה ומאפשר גישה GH. 
	הערה: שלב זה ניתן לדלג על סוכרים מטוהרים. זהירות &#8211; חומצה/בסיס חזק.
	<ol><li>כוללים את aliquot עבור פקד אוויר לא-אנזים (אותו יחס כמו כל הדגימות, למעט שלב 4.1. אינו נכלל).</li>
	</ol></li> <li>µL להוסיף 200 של H 2 O ו 20 µL 1 מ' ב- HCl כדי לנטרל. מבחן ה-pH היא ~ 6-7 על ידי הסרת 1 µL ו לראות אותו על גבי נייר אינדיקטור חומציות.</li>
	מאגר אצטט <li>להוסיף 50 µL 1 מ' אמוניום, pH 6.0 (או איזה pH מתאים GHs השתמשו במחקר) ו- H 2 O לתת הנפח הכולל של 500 µL. 
	הערה: אמוניום אצטט משמש מאז זה sublimes על ייבוש, ולכן זה לא להוסיף מלח נוספים המדגם. עודף מלח יכול להוביל הלהקה המסכן-צורה והרזולוציה על הג'ל פייס.</li>
</ol> 4. הידרוליזה של האוויר עם Glycosyl Hydrolases (GHs) הערה: כאמור בדיון, טוהר GHs היא קריטית. רק להשתמש heterologously הביע, זיקה טהור אנזימים. לאחר קבלת כל חלקה של היצרן, hydrolyze aliquots מוגדרים של מצע (למשל, 500 µg אוויר) עם הגדלת כמויות של GH בן לילה (למשל, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 יחידות/µL). כאשר יש עודף של GH, טביעת האצבע בקצב ייראה זהה. עודף של אנזים נדרש לספק תוצאה לשחזור כי זה חייב להיות בטוח כי התגובה הידרוליזה מתקרב נקודת הקצה.
<ol><li>הוסף סכום שנקבע מראש (ראה לעיל) של mannanases (GH5, GH26 11) כדי aliquots האוויר במאגר מהשלב 3.5, כמו גם חיובי (30 µg של konjac glucomannan), ובקרה פקד שלילי. לא-אייר (אנזים מיקס ב שפופרת ריק). מערבולת, ומסתובב אז בקצרה כדי לאסוף את תערובת התגובה בתחתית השפופרת.</li>
	<li>דגירה בין לילה-37 מעלות צלזיוס (או את הטמפרטורה המתאימה עבור GH הבחירה) עם עצבנות עדין (~ 100 סל ד).</li>
	<li>לעצור את התגובה על ידי המקננת ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות 
	הערה: כובע סגרים יכול לשמש כדי לסגור את flip-העליון microfuge צינורות.
	<ol><li>צנטריפוגה באמצעות microfuge העליון של ספסל במהירות המרבית עבור 10 דקות ונשארים תגובת שיקוע.</li>
	</ol></li> <li>Resuspend צנפה 250 µL H 2 O, צנטריפוגה כאמור לעיל, ולשמר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לשלב שני supernatants, ויבש ומפרידה ואקום (ראה את הטבלה של חומרים) ב 30 ° C (~ 3 h או לילה ללא חימום).</li>
</ol> 5. הכנת תקנים פחמימה # מיון הפחמימות <ol><li>מניות 1 מ"מ הכן פתרונות H 2 O מנוז (אדם), mannobiose (האיש 2), mannotriose (האיש 3), mannotetraose (4 איש), mannopentaose (האיש 5), mannohexaose (איש 6), כל β, 1-4 מקושרים. Aliquot וחנות ב-20 ° C עד נדרש.</li>
	<li>להכין תערובת 1-6 3 ריכוזים שונים של אדם על ידי שילוב של µL 1 (תקן S1), µL 2 (S2) או 5 µL (S3) של כל ששת.</li>
	<li>יבש ומפרידה ואקום (ראה טבלה של חומרים) ב- 30 מעלות צלזיוס (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Derivitization של Oligosaccharides <ol><li>להכין פתרון מניות של נמלים 0.2 מ' (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic חומצה) H 2 O: חומצה אצטית 17:3. מניות חם עד 60 ° צלזיוס לחלוטין להתמוסס המוצק. חנות ב-20 ° C, מוגן מפני אור, 2-3 חודשים.</li>
	<li>להכין פתרון 0.2 מ' מניות של 2-picoline borane (2-PB) ב דימתיל סולפוקסיד. זה מאוד היגרוסקופי, אז מיד resuspend כל אבקה עם קבלת ב דימתיל סולפוקסיד. Aliquot, חנות ב-20 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שנים. הפשרת aliquots ככל הנדרש (החנות ב 4 ° C עבור 2 שבועות ולאחר מכן להשליך).</li>
	<li>להכין מאגר derivatization של H 2 O: אצטית חומצה: דימתיל סולפוקסיד בגיל 17:3:20-</li>
	<li>אחד לטעום, להוסיף 5 µL של נמלים, 5 µL של µL 2-PB ו- 10 מאגר derivatization. ספין בקצרה כדי לאסוף בתחתית של הרכבת התחתית, מערבולת ביסודיות, ואז ספין בקצרה שוב. ראה איור 1 לתיאור התגובה.</li>
	<li>Incubate דגימות לילה ב 37 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.</li>
	<li>יבש ומפרידה ואקום (ראה טבלה של חומרים) ב- 30 מעלות צלזיוס (~ 2 h).</li>
	תקן של אוריאה 100 של 3 מ' µL ודוגמאות <li>resuspend. חנות ב-20 ° C, מוגן מפני האור עד נדרש.</li>
</ol> 7. הכנה של קצב ג ' לים הערה: הרכבה של הציוד הליהוק ג'ל יהיה תלוי המותג. כאן, אנחנו use מערכת אלקטרופורזה אנכי (ראה טבלה של חומרים), מצוידים עם צלחות זכוכית 18 ס"מ 24 ס"מ ו- 1.5 מ מ מפרידי.
<ol><li>להרכיב ג'ל מכשור יציקה לכל היצרן &#39; הוראות s.</li>
	<li>לעשות 10 x קצב מאגר (1 מ' טריס-בוראט, pH 8.2) כלהלן: להוסיף 121.14 גר' טריס-בסיס ~ 400 מ של H 2 O ומיקס להתמוסס. להתאים את ה-pH ל 8.2 על-ידי תוספת של חומצה בורית מוצק (כ- 60 גרם), ולאחר מכן לבצע אחסון עד 1 ל'</li>
	<li>יעשו אמוניום 10% (w/v) persulfate (APS) מניות H 2 O. Aliquot ו לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס. ההפשרה aliquots פעם אחת, לאחסן ב 4 ° C ולמחוק לאחר 2 שבועות.</li>
	<li>להפוך ויוצקים את הג'ל פתרון. עבור הציוד הנ ל, ג'ל 1 להקביל בין 50 מ. בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, מערבבים H 2 O (20.2 מ"ל), מאגר בקצב של 10 x 5 מ ל, 24.6 מ ל 40% אקרילאמיד/Bis-אקרילאמיד (29:1 acrylamide:Bis). (זהירות: רעיל).
	<ol><li>להוסיף 200 µL של APS ו 20 µL של N, N, N, N´-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED). היפוך בעדינות לערבב (כדי למנוע היכרות עם בועות אוויר). יוצקים את הג'ל באמצעות סרולוגית או פיפטה באמצעי אחסון גדולים אחרים, ~ 4 ס מ מתחת לקצה העליון של הזכוכיות. שימו לב לאפשרות של בועות אוויר מלהילכד הג'ל. אם הם עושים להפסיק לשפוך, הטיה/ברז הג'ל לשחרר אותם.</li>
	</ol></li> <li>כיסוי את הג'ל עם אלכוהול איזופרופיל (זהירות : דליק) או, בזהירות, עם H 2 O. אפשר ג'ל פולימריזציה (20-30 דקות), ולאחר מכן יוצקים את השכבה העליונה. אם אלכוהול איזופרופיל שימש, ואז לשטוף 2 x עם H 2 יבש או כל נוזל עודף באמצעות נייר סופג.</li>
	<li>להפוך ויוצקים את הג'ל הערימה. לערבב 6.8 מ ל H 2 O, מאגר בקצב של 10 x 1 מ"ל, 2.8 מ"ל אקרילאמיד/Bis-אקרילאמיד (זהירות: רעילים), 80 µL APS, µL 8 של TEMED ב שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. ' היפוך ' כדי לערבב, כיסוי על גבי polymerized ג'ל פתרון. הכנס בעדינות מסרקים, הימנעות בועות אוויר השמנה תחת השיניים המסרק.</li>
	<li>אפשר ג'ל כדי פולימריזציה (20-30 דקות), עטוף ברקמה לחה ולאחר מכן גם בניילון נצמד, ולאחסן ב 4 ° C עד הנדרש. חנות עם המסרקים במקום. 
	הערה: קצב ג'לים ניתן לאחסן לתקופה מקסימלית של 2 שבועות (למרות פחות משבוע הוא אידיאלי), אם הם שמרו לחה.</li>
</ol> 8. ריצה קצב ג'ל <ol><li>להשתמש בסמן קבוע כדי לתייג את העמדות היטב על הזכוכית, אשר יסייע שמירה על מסלול של סדר טעינה, והם בזיהוי איפה הבארות המסרק הוא הוסר ברגע.</li>
	<li>להסיר את המסרק. למלא את הבארות מאגר בקצב 1 x-</li>
	<li>להשתמש microsyringe µL 10 כדי לטעון µL 2 של סטנדרטים ודוגמאות לתוך בארות. הימנע משימוש המסלולים החיצוני ביותר, אשר נוטים לרוץ דגימות גרוע.</li>
	<li>להרכיב התא העליון של המנגנון ג'ל-ריצה, ולמקם את הג'ל במיכל מקורר (~ 10 ° C) פועל (10 ° C) המכיל מאגר בקצב x 1. למלא את התא העליון עם מאגר בקצב 1 x-</li>
	<li>להפעיל כוח והפעל הג'ל ב- 200 וולט (קבוע V) במשך 30 דקות ולאחר מכן עלייה במתח עד 1000 V עבור 1 h 40 דקות. להגן על ג'לים מפני אור (למשל, על ידי ליפוף טנקים בשקיות אשפה שחור). 
	הערה: לבדוק ג'לים ~ 5 דקות לאחר הפעלת המתח ולאחר מכן עוד 5 דקות לאחר הגדלת המתח עד 1,000 V. אם ערכת צריכת חשמל אין אפשרות לשמור את המתח יש ככל הנראה דליפת המאגר. להסיר את הג'ל של הטנק. להרכיב מחדש את התא העליון, בודקים בזהירות השמה אטמים כל. שבב גדול בקצה העליון של לוח הזכוכית עלול למנוע את הצלחת יוצרים סגירה עם gasket. יכול בדרך כלל באופן זמני לפתור על-ידי הוספת ירידה של 5% (w/v) agarose מותכת לחלק סדוקים של הזכוכית, לפני הוספת התא העליון.</li>
</ol> 9. להמחיש ג'ל בקצב הערה: להשתמש ג'ל הדמיה למערך עם נורות UV ארוכת גל את transilluminator, ואת מסנן פליטה למצלמה אשר מתאים fluorophore, כאן 530 ננומטר. לחלופין, סורק לייזר עשוי לשמש גם, כפי שמתואר Goubet 2-
<ol><li>להבטיח הג'ל מערכת הדמיה היא בחינם אבק על-ידי. מוחקים את זה עם לחות נטולת מוך.</li>
	<li>להסיר את הג'ל ממיכל בקצב והצג בקצרה בזמן הג'ל עדיין נמצא הזכוכיות (&#60; 80 ms) כדי לקבוע אם החזית צבע היא עדיין על הג'ל.</li>
	<li>פתח את הג'ל בעזרת כלי טריז, בעוד ג'ל הוא עדיין בצלחת כוס אחת, להשתמש בחותך פיצה כדי להסיר את הג'ל בשני הערמה, ואם החזית צבע היא עדיין על הג'ל, החלק התחתון של הג'ל.</li>
	<li>את ~ 5 מ ל H 2 O אל פני השטח של transilluminator, ולאחר מכן להעביר את הג'ל ישירות על גבי transilluminator. להגדיר את המסנן UV 605 והפעל את transilluminator והאזינו UV (ראה טבלה של חומרים) באמצעות התוכנה- 
	הערה: fluorophore נמלים המשמש כאן יש עירור/פליטה של 353/520 nm.</li>
	<li>לקחת כמה תמונות בזמנים חשיפה שונים (למשל, 100 ms 10 s). ודא כי האור האולטרה סגול מבוטלת בין תמונות על-ידי לחיצה על לחצן אור UV (לבטל) כדי להימנע משפילים את קרינה פלואורסצנטית. להבטיח כי לפחות 2 תמונות יש להקות רוויים (הג'ל imaging התוכנה יציין זאת).</li>
	<li>שמור קבצים כתמונות גבוהה-resolution.tif. 
	הערה: תמונות ניתן לנתח באמצעות התוכנה המצורפת עם הג'ל מערכת הדמיה, או באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה בחופשיות, כגון ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). עיין בסעיף תוצאות הדיון כימות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+fingerprinting+of+Arabidopsis+pectic+polysaccharides+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+(PACE).">Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Planta. 224 (1), 163-174 (2006).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+A+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Mortimer, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+of+Cell+Wall+Polysaccharides+Using+PACE.">Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE.</a> Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).</li><li>Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+glycosyl+hydrolases+and+biofuels:+a+natural+marriage.">Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage.</a> Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).</li><li>Mortimer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+xylan+in+Arabidopsis+primary+cell+walls+is+synthesised+by+GUX3,+IRX9L,+IRX10L+and+IRX14.">An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14.</a> Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).</li><li>Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+relative+quantitation+using+isotope+tagging+and+normal-phase+liquid+chromatography/mass+spectrometry.">Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).</li><li>Busse-Wicher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Xylan+Substitution+Patterns+in+Gymnosperms+and+Angiosperms:+Implications+for+Xylan+Interaction+with+Cellulose.">Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose.</a> Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).</li><li>Mortimer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+branches+from+xylan+in+Arabidopsis+gux+mutants+reveals+potential+for+simplification+of+lignocellulosic+biomass.">Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).</li><li>Anders, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyl+transferases+in+family+61+mediate+arabinofuranosyl+transfer+onto+xylan+in+grasses.">Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).</li><li>Goubet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+glucomannan+in+Arabidopsis+is+synthesised+by+CSLA+glycosyltransferases,+and+influences+the+progression+of+embryogenesis.">Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis.</a> Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+That+GH115+alpha-Glucuronidase+Activity,+Which+Is+Required+to+Degrade+Plant+Biomass,+Is+Dependent+on+Conformational+Flexibility.">Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility.</a> J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+complexity+dictates+microbial+resource+allocation+in+the+large+intestine.">Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine.</a> Nat Commun. 6, 7481 (2015).</li><li>Handford, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localisation+and+characterisation+of+cell+wall+mannan+polysaccharides+in+Arabidopsis+thaliana.">Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana.</a> Planta. 218 (1), 27-36 (2003).</li><li>Boyes, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+stage-based+phenotypic+analysis+of+Arabidopsis:+a+model+for+high+throughput+functional+genomics+in+plants.">Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants.</a> Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Carbohydrate Active Enzyme Database. , (2017).</li><li>Hogg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modular+architecture+of+Cellvibrio+japonicus+mannanases+in+glycoside+hydrolase+families+5+and+26+points+to+differences+in+their+role+in+mannan+degradation.">The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation.</a> Biochem J. 371, 1027-1043 (2003).</li><li>Brennan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+microbial+xylanases+from+insect+guts.">Unusual microbial xylanases from insect guts.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+high+throughput+carbohydrate+profiling+technique+for+analyzing+plant+cell+wall+polysaccharides+and+carbohydrate+active+enzymes.">Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes.</a> Biotechnol Biofuels. 6, (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

קצב היא שיטה פשוטה עבור אפיון מבנה רב-סוכר. ניתן להחיל אותה על כל רב-סוכר אשר ידועים GHs עם פעילות מאופיין, לראות דוגמאות רבות הספרות1,6,9,11. Tt הוחלה גם על האפיון של הרומן GHs12,13,18 ו glycosyltransferases9, על ידי עשיית שימוש של סובסטרטים מוגדר רב-סוכר, acceptors.
לשחזור, interpretable תוצאות תלויים שלושה שלבים מרכזיים. קודם כל, GHs בשימוש צריכים להיות חופשיים ובלחות פעילויות. . זה הטוב ביותר מושגת רק באמצעות ביטוי heterologously, זיקה מטוהרים אנזימים. שנית, עבור רוב הניסויים, זה חשוב כי הידרוליזה אנזימטי של סובסטרטים הוא בעת סיום. פעולה זו תבטיח כי ביומסה באותו הידרוליזה עם GH זהה נותן מאפיינים דומים בבכל ניסוי. לבסוף, צריך להיות עודף של fluorophore ב התגובה derivatization. פעולה זו מבטיחה כי הקצוות תוך צמצום זמין לוחיות ההסבר ל 100 אחוז. התוצאה תהיה הפארמצבטית גבוהה של תוצאות, כמו גם נתונים כמותיים.
ג'ל ואיכות ריאגנט הם קריטיים להבטחת לשחזור נתונים. מאגרי באיכות ירודה, במיוחד של שגוי pH, אוויר בועות הג'ל, דגימות עם עודף מלח יכול כל משפיעים על רזולוציה ושמירה פקטור של oligosaccharides. עם זאת, הכללת הפקדים המומלצת המתוארות בסעיף הפרוטוקול ואת התוצאות יאפשר פתרון בעיות.
הקצב הוא מוגבל על ידי היכולת שלו לזהות oligosaccharides. עבור ניסויים, טביעת אצבע פשוטה הוא כל שנדרש. עם זאת, כדי באמת quantitate את כמות glucomannan במדגם של אוויר, לדוגמה, הזהות של כל oligosaccharides פרסמה נדרש, אשר הוא תהליך ממושך. . זה יותר פשוט פחות סוכרים מורכבים כגון xylan3. מאז יש כמה תקנים פחמימה # מיון הפחמימות זמין מסחרית, לא תמיד ייתכן אפשרי או רצוי לזהות את כל הלהקות. במקרה זה, קצב יכול לספק נתונים מחמיא ספקטרומטר מסה (קרי, MALDI-CID9 או ESI-MS7ו- NMR6). על שיטות אלה, לעתים קרובות מועיל לעשות הכנה בקנה מידה גדול, נפרדים על-ידי גודל-הדרה כרומטוגרפיה ולאחר מכן לנתח כל שבר על ידי שני פייס לפני MS או NMR. בעוד בעבר דווח כי להקות יכול להיות טוחנות, המזוהה על-ידי MALDI-CID, בפועל גילינו שאין לזה קצב נמוך של הצלחה (ככל הנראה כתוצאה אינטראקציות של oligosaccharides שכותרתו עם הג'ל אקרילאמיד בעת חשיפה לאור UV).
המגבלה העיקרית אחרים של קצב הוא התפוקה. יש איכות טובה, ג'לים interpretable עם הפקדים המתאימים, ג'ל כל יהיה רק דוגמאות ניסיוני ~ 10, חוקר יכול לצפות לבדוק ~ 4 משטחים הקצב לכל יום. לאחרונה, גרסה של קצב באמצעות נימי אלקטרופורזה (CE) כבר מפותחת19, אשר מאפשר הכנת דוגמאות ב 96-ובכן צלחות. זה שימש בהצלחה כדי לאפיין את פעילות האנזים glycosyltransferase,6,מבנים רב-סוכר19, למרות שזה דורש גישה למחשב לסה נ, יכול להיות יקר כדי לרכוש ולתחזק.

ניתוח רב-סוכר על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE) הוא שיטה של אפיון מפורט של פוליסכרידים-1,-2,-3. צמח דופן התא פוליסכרידים קשה לשמצה לנתח, לרוב השיטות דורשים ציוד יקר, אופרטורים מיומן ואת כמויות גדולות של חומר מטוהרים. כאן, אנו מתארים פשוט שיטה להשגת מידע מבני רב-סוכר, כולל רזולוציה של isomers מבנית מפורט.
מבנה רב-סוכר של דופן התא צמח ההבנה הוא הכרחי עבור אלה החוקרים חקר הצמח ביוסינטזה דופן התא או את התפקיד של החומה תא צמח-התפתחות הצמח. לאחרונה, עם זאת, הרכב קיר תא צמח הפך מעניין לקבוצה רחבה יותר של החוקרים בשל ההתמקדות באמצעות צמח ביומסה (למעשה קיר התא) כמו זינה כדי לייצר דלק ביולוגי, ביוכימיקלים4. לדוגמה, יעיל saccharification אנזימטי החומר הזה דורש הבנה מפורטת של המבנים רב-סוכר, קוקטיילים אנזימטי ממוטבת שניתן יהיה הנבחר5.
קצב יש כמה יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות אשר עושים את זה אידיאלי לניתוח מהיר של מבנים מורכבים glycan. ראשית, היא אינה דורשת טיהור של רב-סוכר המדובר, כפי נדרש פתרון המדינה תהודה מגנטית גרעינית (NMR)6. שנית, קצב ניתן לפתור isomers מבנית, בניגוד ספקטרומטר מסה (MS, למשל, מטריקס בסיוע לייזר desorption/יינון (MALDI) וספקטרומטריית electrospray יינון (ESI)), אשר גם עשויה להיות מאתגרת כדי לבצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית (LC) 7. שלישית, הקצב הוא מאוד רגיש, עם רזולוציה נמוכה-picomole, שלא כמו דק-שכבה כרומטוגרפיה (TLC) או נייר כרומטוגרפיה. בסופו של דבר, זה אינו דורש ידע ציוד או מומחה יקר, כמו במקרה של MS, NMR של LC.
שיטת הקצב מסתמך על ייחודה של אנזימי הידרולז (GH) glycosyl, אשר יעד מסוימים קישורים glycosidic בתערובת של סוכרים. כאשר האנזים GH פועל על השרשרת רב-סוכר, היא מגלה קצה תוך צמצום אשר יכול אז להיות מבחינה כימית derivatized, במקרה זה עם תווית פלורסנט. בחלק unhydrolyzed של המדגם ולכן מעובד לא לגילוי על ידי שיטה זו. Oligosaccharides עם תוויות ואז מפריד של ג'ל אקרילאמיד בפורמט גדול על ידי אלקטרופורזה. זה נותן פתרון מעולה של מולקולות דומות מאוד, לדוגמה, trisaccharides Glc-גבר-גבר, Glc-גבר-Glc יהיה שונה של Rf.
קצב שימש בהרחבה לאפיין מבנים שונים xylan על פני הצמח מינים8, לזהות מוטציות glycosyltransferase תודרנית6,9,10,11 לביצוע מבחני glycosyltransferase9, כדי לאפיין את הרומן GH פעילויות12,13. גם לאחרונה השתמשנו בו כדי לאפיין שמרים mannan דופן התא (Mahboubi, מורטימר, בהכנה). כאן נתאר שיטת אפיון מבנה הצמח דופן התא glucomannan, בהתבסס על דיווחים קודמים11,14.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Oligosaccaharide Standards&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Mannobiose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 14417-51-7</td><td></td></tr><tr><td>Mannotriose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 28173-52-6</td><td></td></tr><tr><td>Mannotetraose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannopentaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannhexaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td><td>Megazyme</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other specialty chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td><td>(Molecular probes) Thermo</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-picoline borane</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td><td>Bio-rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialty Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel casting kit</td><td>Hoefer</td><td>SE660 kit</td><td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td></tr><tr><td>Cooling recirculating water bath&amp;nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td><td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td></tr><tr><td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td></tr><tr><td>High Voltage Power Pack</td><td>Thermo</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td><td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel electrophoresis system</td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Glycosyl hydrolases&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lab supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel imaging software ( Genesys)</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

צמח דופן התא פוליסכרידים קשה לשמצה לנתח, לרוב השיטות דורשים ציוד יקר, אופרטורים מיומן ואת כמויות גדולות של חומר מטוהרים. כאן, אנו מתארים פשוט שיטה להשגת מידע מבני רב-סוכר, כולל רזולוציה של isomers מבנית מפורט. ניתוח רב-סוכר על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), חומר צמחי דופן התא hydrolyzed עם glycosyl hydrolases ספציפית רב-סוכר בעל עניין (למשל, mannanases עבור מנן). פורמט גדול לזיהוי ג'לים משמשות לאחר מכן להפריד את oligosaccharides המשוחררים, אשר סומנו כאנטי fluorescently. ג'לים, ניתן לאבחן עם ג'ל ששונה מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים). טביעת האצבע פחמימה # מיון הפחמימות וכתוצאה מכך ניתן גם להשוות איכותית או, עם שכפול, באופן כמותי. הצמדה ומידע מסעף ניתן להקים באמצעות hydrolases glycosyl נוספים (למשל, mannosidases ו- galactosidases). בעוד פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח מבנה glucomannan, ניתן להחיל אותה על כל רב-סוכר אשר מאופיין glycosyl hydrolases קיים. לחלופין, זה ניתן לאפיין את הרומן glycosyl hydrolases שימוש רב-סוכר מוגדר סובסטרטים.

כאן, אנו מראים על ג'ל קצב דוגמה לרוץ לכל הפרוטוקול, יחד עם תיאורי כדי לסייע עם פרשנות הנתונים ופתרון בעיות, זה מלווה מדריך כללי מוצלחת בקצב ג'ל פרשנות13,16. ג'ל נציג של קצב רגיל וזמינותו של דופן התא מנן תוכן מוצגת באיור2, מתואר ליין מאת ליין.
סטנדרטים מסלולים 1, 2 ו- 3 הצג סולם של מסחרית שנרכש oligosaccharides (גבר1- גבר6) ב 5 (S1), 10 (S2) ו- 50 ריכוז pmol (S3). בעת קבלת הרבה פחמימה # מיון הפחמימות מסחרי חדש, חשוב לבדוק את הטוהר על ג'ל. Oligosaccharides רבים, במיוחד tetrasacccharides יותר, יכול לקבל זיהום משמעותי, עם oligosaccharides של דרגות אחרות של פלמור (DPs), כמוצג כאן גבר6 (המסומנים *). בזמן quantitating ג'ל, זה חשוב שתהיה לפחות 3 ריכוזי הסטנדרטים, מאז זה הכרחי לחישוב עקומת סטנדרטי. חישוב של העקומה רגיל יכול להיות גם עוזר להבטיח כי התגובה derivatization הוא בעיקרו של דבר בעת סיום. סטנדרטים של ריכוזים ידועים לאפשר השוואות בין ג'לים, פקד שימושי עבור איכות ההפרדה ואיכות derivatization.
בקרה חיובית ליין 4 מראה של עיכול mannanase konjac glucomannan. Konjac glucomannan זמין מסחרית, בזמן זה לא קיים באותו מבנה כמו זה, לדוגמה, נמצאו תודרנית, זה משמשת לשתי מטרות. ראשית, זה פקד חשוב לעיכול אנזימטיות. החוקר צריך לקבוע איך נראה מצע מסחרי מתעכל עם שלהם GHs להתמקד כאשר מתעכל עד לסיומו (קרי, עודף עצום של GH מתווסף התגובה). אם בעתיד ניסויים התבנית משתנה, זה יכול להצביע או לאובדן של פעילות או זיהום של המניה GH. שנית, הוא משמש פקד עבור התגובה derivatization בנוכחות האנזים ומאגר המלחים. אם הפקד חיובי הוא עני, ולאחר מכן זה עשוי לציין כי רכיב של התגובה הידרוליזה היא המעכבת כדי derivatization הסטנדרטים להיראות טוב.
תודרנית פראי סוג (WT) נובעות אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26) ליין 5 מציג את קצב טביעות אצבע של גבעול תודרנית WT (השוואה עם הפניות11,14).
csla9 תודרנית גזע אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26) 6 ליין מציגה מראה טביעת האצבע בקצב של הגזע של תודרנית הצמח חסר העיקריות נובעות מנן סינתאז11. להשוות בין WT, שליטה שלילי טביעות אצבעות. בעוד רוב מנן נעדר במפעל הזה, נשארת כמות קטנה, כפי שמעידים עוצמות הלהקה מופחת עבור כל הנגזרות mannanase oligosaccharides זה הוא מסונתז על ידי מנן נוספים synthases (CSLA2, 3)11.
בקרה שלילית - אנזים בלבד ליין 8 מראה להקות על הג'ל שאינם ספציפיים שואבים מזהמים ב mannanase קוקטייל, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
בקרה שלילית - WT אוויר בלבד ליין 9 מציג את להקות הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
בקרה שלילית- csla9 אוויר בלבד ליין 10 מראה להקות על הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
אורן עץ אוויר + mannanase קוקטייל (GH5 + GH26) ליין 7 מראה טביעות אצבע בקצב של עץ אורן, אשר מכיל את galactoglucomannan. בבירור יש דפוס שונים של oligosaccharides שפורסמו כדי תודרנית, בשל מבנהו שונה.
בקרה שלילית - אורן אוויר בלבד 11 ליין מראה להקות על הג'ל אינם ספציפיים, לא להיות כלולים הניתוח (המסומנים *).
לפרש ג'ל הקצב פשוט למדי, אך דורשת מודעות לנקודות הבאות. עבור נתונים, מומלץ לבצע את הקצב לפחות 3 באופן עצמאי גדל ביולוגי משכפל, מומלץ לבצע משכפל טכנית לפחות 2 על כל שכפול ביולוגי. הפקדים המתוארים הם קריטיים לפרשנויות, להקות לא ספציפית צריכה להילקח. אנו גם ממליצים טעינת דגימות השונה על שכפל ג'לים, כדי לא לכלול תופעות אשר הם תוצאה של תאורה לא אחידה על ידי transilluminator. לפירוש מדויק דורש ניתוח של להקות אשר לא רוויים. מאז יש טביעות אצבעות פחמימה # מיון הפחמימות עשוי להכיל שני סוכרים שפע מאוד גבוהות ונמוכות, אנו ממליצים ניתוח חשיפות מרובות של הג'ל אותו. הסטנדרטים יכול לשמש כדי לנרמל בין תמונות שונות.
עבור סוגים מסוימים של ניסויים, זה עשוי להיות רצוי לכמת את כמות רב-סוכר בהכנת אוויר. בזמן זה אפשרי לכמת מן הקצב ג'ל, זה דורש ידע את זהותו מולקולרית המדויק של כל פחמימה # מיון הפחמימות שפרסם את GHs, היכן הוא ממוקם על הקצב ג'ל. זה כרגע לא לגמרי ידוע מנן, אך נקבע עבור אחרים סוכרים למשל xylan3. הסטנדרטים מספקים דרך של נורמליזציה בין ג'ל, גם כאשר לא מתבצע כימות, ולכן יסייע לכל ניתוח איכותי או כמותי למחצה.
זיהוי המבנה של הפרט oligosaccharides יכולה להיות מושגת באמצעות קוקטיילים של שקריאה GHs. תוספת של עוד GHs עלול לחשוף פרטים אודות קישורים ותחליפי של oligosaccharides המשוחררים (למשל, תוספת של β - 1, 4 - glucosidase שפועל על קצה שאינם בהפחתת תחשוף אילו oligosaccharides בתערובת מכילים תכונה זו). אנזימים זמינים כוללים galactosidases, glucuronidases, glucosidases (ראה את מסד הנתונים CAZy16 לפרטים נוספים); ראה הוג, ד. et al. 17 כדוגמה.
ניתן להשתמש בפרוטוקול לעיל כדי לאפיין את הפעילות של GHs לא ידוע. במקרה זה, ביומסה מוגדר, כגון תודרנית glucomannan גזע או konjac, אמור לשמש למסך GHs13לא ידוע.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
איור 1 : זה מראה את הערכה עבור derivatization הניאון של oligosaccharides עם נמלים. שונה מ- Goubet2.<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>המטרה e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"="_ blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
איור 2 : ג'ל בקצב נציג מציג טביעת האצבע מנן תודרנית, אורן, מוטציה של תודרנית (csla9) אשר יש ליקויי ביוסינטזה מנן. AlR היה הידרוליזה עם קוקטייל mannanase, oligosaccharides שפורסמו היו derivatized עם fluorophore. Oligosaccharides היו מופרדים על ידי אלקטרופורזה בג'ל על בסיס גודל, צורה של תשלום. סולם של manno-oligosaccharides (Man1-6) מוצג כדי לסייע בזיהוי mobilities היחסית של oligosaccharides פרסמה, הידרוליזה של מנן מטוהרים (נגזר konjac) מוצג פקד חיובי. * = להקות לא ספציפית. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE at JoVE.com

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

פרוטוקול לניתוח המבני של סוכרים על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), כדוגמא מנן, מתואר.

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

structural-characterization-mannan-cell-wall-polysaccharides-plants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Views.  Joint BioEnergy Institute. פרוטוקול לניתוח המבני של סוכרים על ידי אלקטרופורזה בג'ל (PACE), כדוגמא מנן, מתואר.

Video: Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Chemistry

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Biology

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

אימונולוקליזציה פלואורסצנטית של חלבונים ערבינוגלקטניים ופקטינים בחומת התא של רקמות הצמח

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Developmental Biology

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached to each other by &#945;-1,6 glucoside linkages, referred to as branch points. Among the different forms of carbon storage (i.e., starch, &#946;-glucan), glycogen is probably one of the oldest and most successful storage polysaccharides found across the living world. Glucan chains are organized so that a large amount of glucose can quickly be stored or fueled in a cell when needed. Numerous complementary techniques have been developed over the last decades to solve the fine structure of glycogen particles. This article describes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). This method quantifies the population of glucan chains that compose a glycogen particle. Also known as chain length distribution (CLD), this parameter mirrors the particle size and the percentage of branching. It is also an essential requirement for the mathematical modeling of glycogen biosynthesis.

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

In the present protocol, the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) technique is used to determine the chain length distribution (CLD) and the average chain length (ACL) of glycogen.

קביעת התפלגות אורך שרשרת גלוקאן של גליקוגן באמצעות שיטת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

הבהרת המבנה וההתרחשות של גליקן באמצעות פרופיל פולימרי Microarray

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

מחבר זרקור: פרוטוקול MAPP – קידום ניתוח גליקן 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...