PACE yöntem geliştirilmiş ve yıllar içinde çeşitli grubunun üyeleri, Dupree (Cambridge Üniversitesi, İngiltere) tarafından en iyi duruma getirilmiş ve onların katkıları için teşekkür ederiz. Bu eser Lawrence arasında sözleşme DE-AC02-05CH11231 aracılığıyla ABD Enerji Bakanlığı, bilim Office, Office biyolojik ve çevresel araştırma, tarafından desteklenen DOE ortak biyoenerji Enstitüsü (http://www.jbei.org) bir parçası olarak finanse edildi Berkeley Ulusal Laboratuvarı ve ABD Enerji Bakanlığı. Biz de Thea çekme ve Vy sivil toplum örgütü csla9 örnekleri hazırlama konusunda yardım için teşekkür ederiz.

1. hasat in bitki maddi <ol><li>hasat taze bitki materyali (~ 20 mg) ve % 96'sı (v/v) etanol daldırın ve hemen 30 dk 70 ° C'de kuluçkaya; Bu enzimler mevcut aşağılayıcı herhangi bir hücre duvarı devre dışı bırakır. Kuru malzeme için başlamak vasıl adım 2. 
	Dikkat: Etanol yanıcı. 
	Not: Tek bir kök veya rozet yaprak analiz için yeterli malzeme sağlar. Ancak, daha büyük bir miktar doku havuza alınmış ve bu tartmak ve işlemek daha kolay olduğu analiz daha az sayıda hataları ortaya.</li>
	<li>Dikkatle doku türünü kaydedin ve gelişimsel sahne, polisakkarit yapısı olarak her ikisi ile değişir. Örneğin, Arabidopsis thaliana ile (kullanılan burada), doku Boyes vd metotlarından göre sahne 15 Not: Bu protokol için biz nerede ilk silique tam olarak değil ama sararma elongated önümüzdeki kök alt yarısını kullandık.</li></ol>
 2. hazırlık, alkol çözünmez kalıntı (Hava) <ol><li>hazırla hava, tabi belgili tanımlık yöntem Mortimer vd. 9 veya çözünür şekerler, sukroz ve nişasta gibi eksik bir toz üretmek için başka bir benzer yöntem.</li>
</ol> 3. Aliquoting ve hava ön arıtma Not: tam olarak her örnek malzeme ilgi polisakkarit ve (b) tarafından yayımlanan oligosakkaritler ortalama boyutu (a) ve bereket üzerine bağlıdır için gerekli hava miktarı GH. Deneme duyarlılığını oligosakkaritler belirler yani yöntemi tek bir floresan molekül her oligosakkarit azalan bakiyeli sonuna ekler. GH11 ile sindirilmiş Arabidopsis kök içinde xylan için 100 µg Mortimer olduğu gibi tavsiye edilir, ancak bir kılavuz olarak, glucomannan Arabidopsis kök (açıklandığı gibi) GH5/GH26 ile sindirmek için 500 µg 11, tavsiye edilir &#39; s çalışma 3. <ol><li>15 mL santrifüj tüpüne hava (10-15 mg) tartmak ve H 2 O 2 mg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Hatta bir süspansiyon ulaşmak için girdap. Bu sorunlu ise, o zaman bu işlem yardımcı olmak için bir cam homogenizer kullanın.</li>
	<li>Aliquot 500 µg microfuge içine tüpler. Kuru vakum santrifüj kullanarak aliquots (Tablo reçetesi görmek) gecede 30 ° c</li>
	<li>Öncesi tedavi Hava 1 M NaOH ile (20 µL) oda sıcaklığında; 1 h için bu polisakkaritler de-acetylates ve biyokütle yapısını bozmakta ve GH erişim sağlayan selüloz microfibrils şişer. 
	Not: Bu adım-ebilmek var olmak Kaptan için saflaştırılmış polisakkaritler. DİKKAT &#8211; güçlü asit/baz.
	<ol><li>Bir aliquot için bir Hayır-enzim hava kontrol dahil (aynı adım 4.1 hariç tüm örnekleri işlenir. söz konusu değildir).</li>
	</ol></li> <li>200 eklemek µL H 2 O ve 20 µL 1 M HCl nötralize etmek için. PH 1 µL çıkarıp kağıt pH göstergesi şeritler lekelenme ~ 6-7 arasındadır testi.</li>
	<li>Ekle 50 µL 1 M amonyum asetat arabellek, pH 6.0 (veya hangisi pH çalışmada kullanılan GHs için uygundur) ve toplam hacmi 500 µL vermek H 2 O. 
	Not: Amonyum asetat kurutma üzerine sublimes bu yana ve bu örnek için ek tuz eklemek değil bu yüzden kullanılır. Aşırı tuz PACE jel üzerinde yoksul grubu-şekli ve çözünürlük yol açabilir.</li>
</ol> 4. Hidroliz ile glikosil Hidrolazlar (GHs) hava Not: tartışmaya belirtildiği gibi GHs Saflık önemlidir. Tek kullanım, heterologously ifade benzeşme enzimler saf. Üreticinin her yerinden aldıktan sonra bir gecede GH miktarda artan substrat (Örneğin, 500 µg hava) tanımlanmış aliquots hidrolize (Örneğin, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 adet/µL). GH aşırı zaman PACE parmak izi özdeş arayacaktır. Enzim aşırı hidroliz reaksiyonu bitiş noktası yaklaşıyor emin olmalıyız çünkü bir tekrarlanabilir sonuçlar elde gereklidir.
<ol><li>Ekle bir önceden belirlenmiş miktar (yukarı bakın) mannanases (GH5 ve GH26 11) hava aliquots arabelleği için adım 3.5, aynı zamanda olumlu bir denetim (konjac glucomannan 30 µg) ve bir no-hava negatif kontrol (enzim karışımı bir boş tüp). Girdap ve kısa bir süre tepki karışım tüp alt toplamak için sonra döndür.</li>
	<li>Kuluçkaya gecede 37 ° C (ya da seçim GH için uygun sıcaklık) nazik ajitasyon (~ 100 rpm).</li>
	<li>20 dakika süreyle 95 ° C'de kuluçka tarafından tepki durdurmak 
	Not: Cap kilitler kaldırılarak açılan microfuge tüpler mühürlemek için kullanılabilir.
	<ol><li>Bir tezgah üst microfuge maksimum hızda 10 dakikadır kullanarak santrifüj kapasitesi ve süpernatant korumak.</li>
	</ol></li> <li>Resuspend Pelet 250 µL H 2 O, yukarıdaki gibi santrifüj ve süpernatant korumak.</li>
	<li>Her iki supernatants birleştirmek ve bir vakum santrifüje kuru (Tablo reçetesi görmek) 30 ° c (~ 3 h ya da gece Isıtma olmadan).</li>
</ol> 5. Oligosakkarit standartların hazırlanması <ol><li>hazırla 1 mM hisse senedi çözümleri H 2 O mannoz (adam), mannobiose (Man 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (Man 4), mannopentaose (adam 5) ve mannohexaose (adam 6), tüm β, 1-4 bağlantılı. Aliquot ve mağaza-20 ° c kadar gerekli.</li>
	<li>Bir adam 3 farklı konsantrasyonlarda 1 µL (Standart S1), 2 µL (S2) birleştirerek 1-6 karışım hazırlamak veya tüm altı 5 µL (S3).</li>
	<li>Kuru vakum santrifüj (Tablo malzemeleri görmek) 30 ° C'de (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Oligosakkaritler Derivitization <ol><li>hazırla 0.2 M karıncalar (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic asit) H 2 O hisse senedi bir çözüm: Asetik asit 17:3. Katı tamamen erimesi için 60 ° c sıcak hisse senedi. Mağaza için 2-3 ay ışığı, korumalı-20 ° C'de.</li>
	<li>2-picoline borane (2-PB) DMSO 0.2 M stok çözeltisi hazırlamak. Bu son derece higroskopik, öyle hemen DMSO içinde aldıktan sonra tüm toz resuspend. Aliquot ve mağaza-20 ° c 1-2 yıldır. Gerekli (2 hafta ve o zaman silmek için 4 ° C'de deposu) olarak aliquots çözülme.</li>
	<li>H 2 O derivatization arabellek hazırlamak: Asetik asit: DMSO 17:3:20.</li>
	Karıncalar, 2-PB ve 10 µL derivatization arabelleği 5 µL 5 µL eklemek, her örnek için <li>. Kısaca tüp alt toplamak için Döndür girdap iyice ve sonra kısa bir süre tekrar döndürün. Reaksiyon açıklaması için bkz: şekil 1.</li>
	<li>Incubate örnekleri gecede ışıktan korunan 37 ° C'de.</li>
	<li>Kuru vakum santrifüj (Tablo malzemeleri görmek) 30 ° C'de (~ 2 h).</li>
	<li>Resuspend örnekleri ve standart 100 µL 3 M üre. Gerekli kadar ışıktan korunan-20 ° C'de mağaza.</li>
</ol> 7. PACE hazırlanması jelleri Not: jel döküm donanımları Meclisi marka bağlı olacaktır. Burada, biz use bir Dikey Elektroforez Sistemi (bakınız Tablo malzemeler), donanımlı 18 cm x 24 cm cam plakanın ve 1.5 mm boşluk ekleyiciler.
<ol><li>Jel döküm donanımları üretici başına bir araya &#39; s yönergeleri.</li>
	<li>Olun 10 x hızı arabellek (1 M Tris-Bor, pH 8.2) aşağıdaki gibi: 121.14 g Tris-baz ~ 400 mL H 2 O ve çözülmeye karışımı ekleyin. PH 8.2 için buna ek olarak katı Borik asit (yaklaşık 60 g) tarafından ayarlamak ve 1 birim görünmesini sağlamak L.</li>
	<li>% 10 (w/v) amonyum persülfat (APS) hisse senedi H 2 içinde O. Aliquot olun ve saklamak-20 ° c tezcan aliquots bir kez, mağaza 4 ° C'de ve 2 hafta sonra atın.</li>
	<li>Olun ve çözme jel dökmek. Yukarıdaki donatımı 1 jel 50 mL eşit. 50 mL santrifüj tüpü H 2 O (20.2 mL), 5 mL 10 x hızı arabellek, 24.6 mL % 40 Akrilamid/Bis-Akrilamid (29:1 acrylamide:Bis) karıştırın. (Uyarı: toksik).
	<ol><li>200 µL APS ve 20 µL N, N, N, N´-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) ekleyin. (Hava kabarcıkları tanıtımı önlemek için) karışımı yavaşça tersine çevirin. Dökmek bir serolojik kullanarak jel veya ~ 4 cm cam plakanın üst altındaki diğer büyük hacimli pipet. Hava kabarcıkları jel içinde kapana olasılığı dikkat edin. Onlar yapmak, dökme durdurmak ve tilt/onları serbest bırakmak için jel dokunun eğer.</li>
	</ol></li> <li>İsopropanol (dikkat : yanıcı) ile ya da dikkatle, H 2 (20-30 dakika) polimerize, sonra üst tabaka dökmek için O. izin ver jel ile jel kaplama. İsopropanol kullandıysanız, 2 x H 2 O. kuru ile Bloting kağıt kullanarak herhangi bir aşırı sıvı yıkayın.</li>
	<li>Yapmak ve yığın jel dökmek. Mix 6.8 mL H 2 O, 1 mL 10 x hızı arabellek, 2,8 mL Akrilamid/Bis-Akrilamid (dikkat: zehirli), 80 µL APS ve TEMED 8 µL 15 mL santrifüj tüpü içinde. Karıştırmak için ters çevir ve üstüne polimerli çözme jel yerleşimi. Yavaşça taraklar, bindirme hava kabarcıkları tarak dişleri altında kaçınarak takın.</li>
	<li>İzin ver jel (20-30 dk), polimerize şal nemli dokusu ve sonra plastik wrap ve gerekli kadar 4 ° C de saklayın. Tarak yerde mağaza. 
	Not: (daha az 1 hafta ideal olsa da) jeller en fazla 2 hafta için saklanabilir, nemli tutulursa.</li>
</ol> 8. Bir hızda çalışan jel <ol><li>Yükleme sipariş takip içinde yardımcı olacak, cam üzerinde iyi pozisyonlar etiketlemek için kalıcı bir kalem kullanın ve tarak kaldırılır bir kez nerede teşhis etmek için kuyu vardır.</li>
	<li>Tarak kaldırın. Kuyuları ile 1 x hızı tampon doldurun.</li>
	<li>10 µL microsyringe standartları ve örnekler 2 µL kuyu yüklemek için kullanın. Kötü örnekleri çalıştırmak eğilimindedir en dıştaki şerit kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>Jel çalışan cihaz üst TMMOB montaj ve 1 x hızı arabellek içeren jel bir su tankında soğutmalı (~ 10 ° C) çalışan (10 ° C) yerleştirin. Üst odası ile 1 x hızı tampon doldurun.</li>
	<li>Güç ve koşmak vasıl 200 V jel (Sabit V) için açın 30 ortaçağ halk ozanı ve artış voltaj 1000 V 1 saat 40 dakika için. Işık (tanklar siyah çöp torbaları sarma tarafından Örneğin,) jeller korumak. 
	Not: jelleri ~ 5 dk voltaj açma ve daha sonra başka bir 5 dakika sonra 1000 V gerilim artan sonra kontrol edin. O zaman büyük olasılıkla bir arabellek sızıntı gerilim korumak güç paketi eğer. Jel tankından kaldırın. Dikkatle tüm contalar yerleşimini kontrol üst odası yeniden monte. Büyük bir çip üst kenarına cam levha şekillendirme conta ile iyi bir mühür plaka engelleyebilir. Bu genellikle geçici olarak üst odası eklemeden önce bir damla % 5 (w/v) erimiş özel cam kırık parçası ekleyerek çözülebilir.</li>
</ol> 9. PACE jel görselleştirme Not: görüntüleme sistemi uzun dalga UV ampul transilluminator ve fluorophore için burada 530 nm uygun kamera için bir emisyon filtre ile donatılmış bir jel kullanımı. Alternatif olarak, bir lazer tarayıcı da, Goubet 2 ' de açıklandığı gibi kullanılabilir.
<ol><li>Görüntüleme sistemi jel nemli hav bırakmayan dokusu ile silerek toz ücretsiz olduğundan emin olun.</li>
	<li>Jel PACE tankından kaldırmak ve jel hala cam levhalar yaylıdır iken kısaca görüntüleyin (&#60; 80 ms) boya açık hala üzerinde jel olup olmadığını belirlemek için.</li>
	<li>Jel bir kama aracını kullanarak açın ve jel hala bir cam levha üzerinde iken, bir pizza kesici her iki yığın jel kaldırmak için kullanın ve boya açık hala jel, jel dibinde ise.</li>
	<li>~ 5 mL H 2 O transilluminator yüzeyine koymak ve sonra jel transilluminator doğrudan üzerine aktarın. UV 605 için filtre ayarlamak ve görevindeydiler UV transilluminator açın (bkz. Tablo reçetesi) yazılımını kullanarak. 
	Not: Burada kullanılan KARINCALAR fluorophore uyarma/salma, 353/520 vardır nm.</li>
	<li>Çeşitli pozlama zamanlarda birkaç görüntü almak (Örneğin, 100 ms 10 s). UV ışık Floresans düşürmesini önlemek için (devre dışı bırakmak) UV ışık düğmesini tıklatarak görüntü arasında kapalı olduğundan emin olun. En az 2 görüntüleri yok doymuş bantları (jel görüntüleme yazılımı bu belirtmek) olduğundan emin olun.</li>
	<li>Yüksek resolution.tif görüntü olarak dosyaları kaydet. 
	Not: Resim görüntüleme sistemi jel ile veya ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) gibi serbestçe kullanılabilir görüntü analiz yazılımı kullanarak sağlanan yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. Nefelometri tartışılması için sonuçlar bölümüne bakın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+fingerprinting+of+Arabidopsis+pectic+polysaccharides+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+(PACE).">Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Planta. 224 (1), 163-174 (2006).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+A+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Mortimer, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+of+Cell+Wall+Polysaccharides+Using+PACE.">Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE.</a> Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).</li><li>Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+glycosyl+hydrolases+and+biofuels:+a+natural+marriage.">Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage.</a> Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).</li><li>Mortimer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+xylan+in+Arabidopsis+primary+cell+walls+is+synthesised+by+GUX3,+IRX9L,+IRX10L+and+IRX14.">An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14.</a> Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).</li><li>Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+relative+quantitation+using+isotope+tagging+and+normal-phase+liquid+chromatography/mass+spectrometry.">Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).</li><li>Busse-Wicher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Xylan+Substitution+Patterns+in+Gymnosperms+and+Angiosperms:+Implications+for+Xylan+Interaction+with+Cellulose.">Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose.</a> Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).</li><li>Mortimer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+branches+from+xylan+in+Arabidopsis+gux+mutants+reveals+potential+for+simplification+of+lignocellulosic+biomass.">Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).</li><li>Anders, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyl+transferases+in+family+61+mediate+arabinofuranosyl+transfer+onto+xylan+in+grasses.">Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).</li><li>Goubet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+glucomannan+in+Arabidopsis+is+synthesised+by+CSLA+glycosyltransferases,+and+influences+the+progression+of+embryogenesis.">Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis.</a> Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+That+GH115+alpha-Glucuronidase+Activity,+Which+Is+Required+to+Degrade+Plant+Biomass,+Is+Dependent+on+Conformational+Flexibility.">Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility.</a> J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+complexity+dictates+microbial+resource+allocation+in+the+large+intestine.">Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine.</a> Nat Commun. 6, 7481 (2015).</li><li>Handford, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localisation+and+characterisation+of+cell+wall+mannan+polysaccharides+in+Arabidopsis+thaliana.">Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana.</a> Planta. 218 (1), 27-36 (2003).</li><li>Boyes, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+stage-based+phenotypic+analysis+of+Arabidopsis:+a+model+for+high+throughput+functional+genomics+in+plants.">Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants.</a> Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Carbohydrate Active Enzyme Database. , (2017).</li><li>Hogg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modular+architecture+of+Cellvibrio+japonicus+mannanases+in+glycoside+hydrolase+families+5+and+26+points+to+differences+in+their+role+in+mannan+degradation.">The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation.</a> Biochem J. 371, 1027-1043 (2003).</li><li>Brennan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+microbial+xylanases+from+insect+guts.">Unusual microbial xylanases from insect guts.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+high+throughput+carbohydrate+profiling+technique+for+analyzing+plant+cell+wall+polysaccharides+and+carbohydrate+active+enzymes.">Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes.</a> Biotechnol Biofuels. 6, (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

PACE polisakkarit yapısı karakterize için basit bir yöntemdir. Bu uygulanabilir kendisi için orada bilinen GHs karakterize aktivite ile herhangi bir polisakkarit için edebiyat1,6,9,11' deki çok sayıda örneklere bakın. TT de uygulanmış yeni GHs12,13,18 ve glycosyltransferases9, karakterizasyonu yararlanarak tanımlanmış polisakkarit yüzeylerde ve alıcısı.
Tekrarlanabilir, yorumlanabilir sonuçları üç önemli adımlar üzerinde bağlıdır. İlk olarak, kullanılan GHs faaliyetleri kirletici özgür olmalıdır. Bu en iyisi sadece heterologously ifade kullanılarak elde, benzeşim enzimler saf. İkincisi, çoğu deneyler için bu yüzeylerde enzimatik hidroliz işlemi tamamlandığında ne önemli 's. Bu aynı biyokütle ile aynı GH hidrolize her deneyde aynı parmak izi verir garanti eder. Son olarak, fluorophore derivatization tepki aşırı olmalıdır. Bu mevcut azalan bakiyeli biter, % 100 yakın etiketli ki sağlar. Bu sonuçlar, hem de nicel veriler yüksek tekrarlanabilirlik neden olur.
Jel ve reaktif kalite tekrarlanabilir veri sağlayarak için kritik. Kalitesiz arabellekleri, özellikle yanlış pH, jel kabarcıkları hava ve aşırı tuz örnekleriyle oligosakkaritler tüm etkiler çözünürlük ve saklama faktör olabilir. Ancak, iletişim kuralı ve sonuçları bölümünde açıklanan önerilen denetimleri dahil sorun giderme sağlar.
PACE oligosakkaritler tanımlama yeteneği onun tarafından sınırlıdır. Bazı deneyler için gerekli olan basit bir parmak izi var. Ancak, gerçekten glucomannan hava bir örnek miktarı quantitate için örneğin, serbest bırakılmış oligosakkaritler kimlik gereklidir hangi zaman alan bir süreçtir. Bu daha doğru sözlü için daha az xylan3gibi karmaşık polisakkaritler. Piyasada bulunan birkaç oligosakkarit standartları olduğundan, bu her zaman mümkün veya tüm gruplar tanımlamak için uygun olmayabilir. Bu durumda, PACE kütle spektrometresi (Yani, maldı-CID9 veya ESI-MS7ve NMR6) için pek iltifat veri sağlayabilir. Bu yöntemler için büyük ölçekli bir hazırlık yapmak, boyut-dışlama Kromatografi tarafından ayırın ve her kısmı MS veya NMR önce her iki PACE tarafından çözümlemek yararlıdır. Bu bantları çıkardım ve maldı-CID tarafından tanımlanan bildirilmiştir iken, pratikte bu (muhtemelen nedeniyle etiketli oligosakkaritler etkileşimlerin UV ışığına maruz kaldığında Akrilamid jel ile) başarı oranı düşük olan biz bulduk.
Diğer büyük hızı üretilen iş kısıtlamasıdır. İyi kalite, uygun denetimleri ile yorumlanabilir jeller için her jel sadece ~ 10 deneysel örnekleri olacak ve bir araştırmacı ~ 4 PACE jelleri günlük çalıştırmak bekleyebilirsiniz. Kapiler Elektroforez (CE) kullanarak hızı bir sürümünü 96-şey levha örnekleri hazırlanması sağlayan gelişmiş19, zamanlarda. Satın alma ve korumak için pahalı olabilir bir CE makineye erişimi gerektirir, ancak başarıyla glycosyltransferase enzim aktiviteleri ve polisakkarit yapıları6,19, karakterize etmek için kullanılmıştır.

Jel Elektroforez (AKPM) göre polisakkarit analiz polisakkaritler1,2,3detaylı karakterizasyonu için bir yöntemdir. Bitki hücre duvarı polisakkaritler analiz Rootkitler zordur ve çoğu yöntem pahalı donanımları, vasıflı operatörler ve arıtılmış malzeme büyük miktarda gerektirir. İşte, biz basit bir tarif yöntemi kazanıyor için ayrıntılı polisakkarit yapısal bilgi, yapısal İzomerler çözünürlüğü de dahil olmak üzere.
Anlayış bitki hücre duvarı polisakkarit yapısı bitki hücre duvarı sentezi veya bitki hücre duvarı bitki gelişiminde rolü keşfetmek bu araştırmacılar için gereklidir. Son zamanlarda, ancak, bitki hücre duvarı kompozisyon için daha geniş bir grup araştırmacı biyoyakıt ve biochemicals4üretmek için bir hammadde bitki biyokütle (aslında hücre duvarı) kullanarak odak nedeniyle ilginç olmuştur. Böylece en iyi duruma getirilmiş enzimatik kokteyller seçilen5örnek olarak, bu malzemenin verimli enzimatik saccharification polisakkarit yapılarının ayrıntılı bir anlayış gerektirir.
HIZI karmaşık glycan yapıları hızlı analiz için ideal hale alternatif yöntemler birçok avantajı vardır. İlk olarak, çözüm Devlet Nükleer manyetik rezonans (NMR)6için gerekli olduğu gibi söz konusu, polisakkarit arıtma gerektirmez. İkinci olarak, PACE kütle spektrometresi aksine yapısal İzomerler çözümlemek için (MS, matris yoluyla Örneğin, lazer desorpsiyon/iyonlaşma (maldı) ve electrospray iyonlaşma (ESI)), hangi de zor sıvı Kromatografi (LC) gerçekleştirmek için 7. üçüncü olarak, hızı çok hassas, ince katmanlı Kromatografi (TLC) veya kağıt Kromatografi aksine düşük-picomole çözünürlük ile. Son olarak, MS, NMR ve LC için olduğu gibi pahalı ekipman veya uzman bilgi gerektirmez.
Polisakkaritler karışımı glycosidic belirli bağlantıları hedef glikosil hidrolaz (GH) enzimler özgüllük hızı yöntemi kullanır. GH enzim polisakkarit zinciri davrandığında, sonra kimyasal olarak, bu durumda bir floresan etiket ile derivatized bir azalan bakiyeli sonunda ortaya koymaktadır. Örnek unhydrolyzed bölümünü bu nedenle saptanamayan bu yöntemi tarafından işlenir. Etiketli oligosakkaritler sonra bir geniş formatlı Akrilamid Jel Elektroforez tarafından ayrılır. Bu çok benzer moleküllerin mükemmel çözünürlük verir, örneğin, farklı bir RfGlc-Man-Man ve Glc-adam-Glc trisaccharides olacaktır.
PACE kapsamlı farklı xylan yapıları arasında bitki tür8, Arabidopsis6,9,10,11 glycosyltransferase mutantlar tanımlamak için karakterize etmek için kullanılmıştır , glycosyltransferase deneyleri9gerçekleştirmek için ve roman GH faaliyetleri12,13karakterize etmek için. Biz de Geçenlerde Maya hücre duvarı mannan (Mahboubi ve Mortimer, hazırlık) karakterize etmek için kullandık. Burada bitki hücre duvarı glucomannan yapısı, önceki raporlar11,14tarihinde dayalı karakterize bir yöntem açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Oligosaccaharide Standards&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Mannobiose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 14417-51-7</td><td></td></tr><tr><td>Mannotriose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 28173-52-6</td><td></td></tr><tr><td>Mannotetraose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannopentaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannhexaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td><td>Megazyme</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other specialty chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td><td>(Molecular probes) Thermo</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-picoline borane</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td><td>Bio-rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialty Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel casting kit</td><td>Hoefer</td><td>SE660 kit</td><td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td></tr><tr><td>Cooling recirculating water bath&amp;nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td><td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td></tr><tr><td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td></tr><tr><td>High Voltage Power Pack</td><td>Thermo</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td><td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel electrophoresis system</td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Glycosyl hydrolases&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lab supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel imaging software ( Genesys)</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

Bitki hücre duvarı polisakkaritler analiz Rootkitler zordur ve çoğu yöntem pahalı donanımları, vasıflı operatörler ve arıtılmış malzeme büyük miktarda gerektirir. İşte, biz basit bir tarif yöntemi kazanıyor için ayrıntılı polisakkarit yapısal bilgi, yapısal İzomerler çözünürlüğü de dahil olmak üzere. Jel Elektroforez (AKPM) tarafından polisakkarit analiz için bitki hücre duvarı malzeme ile glikosil Hidrolazlar faiz (Örneğin, mannanases için mannan) polisakkarit özgü hidrolize. Geniş format polyacrylamide jeller daha sonra fluorescently etiketli yayımlanan oligosakkaritler ayırmak için kullanılır. Jelleri görüntüleme sistemi değiştirilmiş bir jel ile görüntülenir (bkz. Tablo malzeme). Elde edilen oligosakkarit parmak izi de niteliksel veya, ile çoğaltma, kantitatif karşılaştırılabilir. Bağlantı ve dallanma bilgi ek glikosil Hidrolazlar (Örneğin, mannosidases ve galactosidases) kullanılarak oluşturulabilir. Bu iletişim kuralı glucomannan yapısı analiz etmek için bir yöntem açıklanır iken, hangi için karakterize glikosil Hidrolazlar var herhangi bir polisakkarit uygulanabilir. Alternatif olarak, tanımlanmış polisakkarit yüzeylerde kullanarak roman glikosil Hidrolazlar karakterize etmek için kullanılabilir.

Burada, her iletişim kuralı veri yorumu ve sorun giderme yardımcı olmak için açıklamaları ile birlikte çalıştırmak bir örnek hızı jel göstermek ve bu başarılı jel yorumu13,16hızı için genel bir kılavuz tarafından takip ediyor. Temsil edici bir jel standart bir hızda tahlil hücre duvarı mannan içerik Şekil 2' de gösterilen ve lane lane tarafından tanımlanır.
Standartları Şerit 1, 2 ve 3 ticari olarak satın alınan oligosakkaritler (adam1- adam6) 5 (S1), 10 (S2) ve 50 (S3) pmol konsantrasyon merdivenden göster. Bir ticari oligosakkarit yeni bir sürü alınırken, saflık bir jel üzerinde kontrol etmek önemlidir. Birçok oligosakkaritler, özellikle tetrasacccharides ve artık, oligosakkaritler polimerizasyon (DPs), diğer derece ile önemli kirlilik adam6 için aşağıda gösterildiği gibi olabilir (ile işaretlenmiş *). Bir jel quantitating süre, standart eğri hesaplamak için gerekli olduğundan standartları, en az 3 konsantrasyonları olması önemlidir. Standart eğri hesaplanması da derivatization reaksiyon aslında sonunda sağlamak için yardımcı olabilir. Bilinen konsantrasyonları standartlarının jelleri arasında karşılaştırmalar izin ve ayrılık kalite ve derivatization kalitesi için yararlı bir denetim vardır.
Pozitif kontrol Lane 4 konjac glucomannan bir mannanase hazım gösterir. Konjac glucomannan ticari olarak kullanılabilir ve bu aynı yapıya sahip değil iken, örneğin, Arabidopsis içinde bulunan bu iki amaca hizmet eder. İlk olarak, Enzimatik sindirim için önemli bir denetimdir. Araştırmacı seçim onların GHs ile sindirilmiş bir ticari substrat (GH geniş bir fazlalığı için tepki eklenirYani ) tamamlanması için sindirmek zaman nasıl göründüğünü oluşturmanız gerekir. Gelecekte deneyler desen değişirse, bu etkinlik kaybı ya da kirlenme GH stok göstergesi olabilir. İkinci olarak, bir denetim için enzim ve tampon tuzları huzurunda derivatization tepki olarak hizmet vermektedir. Standartlara bakmak iyi, ama olumlu denetim kötüdür, bu bir bileşeni olan hidroliz reaksiyonu derivatization için inhibitör olduğunu gösterebilir.
Vahşi türü (WT) Arabidopsis kök hava + mannanase kokteyl (GH5 + GH26) Lane 5 PACE parmak izi WT Arabidopsis kök (başvurular11,14ile karşılaştırın) gösterir.
csla9 Arabidopsis kök hava + mannanase kokteyl (GH5 + GH26) Lane 6 ayak parmak izi bir Arabidopsis kök bitki Binbaşı eksik gösterir mannan synthase11kök göstermektedir. WT ve negatif kontrol için parmak izlerini karşılaştır. Mannan çoğunluğu yok iken bu bitki, küçük bir miktar bu ek mannan synthases (CSLA2, 3) tarafından sentezlenen tüm mannanase elde edilen oligosakkaritler için azaltılmış bant yoğunluklarda kanıtladığı gibi kalır,11.
Negatif kontrol - sadece enzim Lane 8 gösterir bantları olmayan jel kirletici mannanase kokteyl olarak türetmek ve analizinden dışlanması gereken özel (ile işaretlenmiş *).
Negatif kontrol - WT hava sadece Lane 9 bantları belirli olmayan ve analizinden çıkarılmalıdır jel üzerinde gösterir (ile işaretlenmiş *).
Negatif kontrol- csla9 Yalnızca AIR Lane 10 belirli olmayan ve analizinden çıkarılmalıdır jel üzerinde bantları gösterir (ile işaretlenmiş *).
Çam ahşap hava + mannanase kokteyl (GH5 + GH26) Lane 7 galactoglucomannan içeren çam ahşap ayak parmak izi gösterir. Bu açıkça farklı yapısı nedeniyle yayımlanan oligosakkaritler Arabidopsis için farklı bir model vardır.
Negatif kontrol - çam AIR sadece Lane 11 bantları belirli olmayan ve analizinden çıkarılmalıdır jel üzerinde gösterir (ile işaretlenmiş *).
PACE jel yorumlama nispeten basit ama aşağıdaki noktaları bilinci gerektirir. Sağlam veri için yapmak en az 3 bağımsız olarak biyolojik yetiştirilen HIZINA çoğaltır ve en az 2 teknik çoğaltır biyolojik her çoğaltma gerçekleştirmek için önerilir tavsiye edilir. Dışlanacak belirsiz bantları ihtiyaç olarak açıklanan denetimleri yorumu için kritik öneme sahiptir. Ayrıca örnekleri transilluminator düzensiz aydınlatma sonucu etkileri dışlamak için farklı bir sırada Çoğalt jelleri üzerinde yükleme öneririz. Doğru yorumu değil doygun bantları analiz gerektirir. Bazı oligosakkarit parmak her iki çok yüksek ve düşük bereket polisakkaritler içeriyor olabilir beri aynı jel birden çok pozlamayı analiz öneririz. Standartları farklı görüntüler arasında normalleştirmek için kullanılabilir.
Deneyler bazı türleri için hava hazırlık polisakkarit miktarını ölçmek istenebilir. PACE jel ölçmek mümkündür GHs tarafından yayımlanan her oligosakkarit tam moleküler kimlik bilgisi gerektirir ve hızı jel nerede üzerinde yer almaktadır. Bu şu anda tam olarak mannan için bilinmemektedir, ancak diğer polisakkaritler xylan örneğin 3için belirlenmiştir. Standartları bile Nefelometri değil gerçekleştirilmekte ve herhangi bir nitel veya yarı kantitatif analiz yardımcı olacaktır bu yüzden jelleri arasında normalleştirme için bir yol sağlar.
Bireysel oligosakkaritler yapısını tanımlayan elde edilebilir kokteyller kullanarak GHs. ardıl bağlantılar ve serbest bırakılan oligosakkaritler (mesela Ayrıca β - 1,4 - oyuncu değişikliği hakkında ayrıntılı bilgi daha fazla GHs ilavesi ortaya çıkarabilir Bu özelliği hangi oligosakkaritler karışımı içeren eylemleri sigara azaltarak ucunda ortaya glucosidase). Kullanılabilir enzimler galactosidases, glucuronidases ve glucosidases (bkz. ek bilgi çıIgının veritabanı16 ) Hogg, D. ve ark. görmek 17 bir örnek olarak.
Yukarıdaki Protokolü bilinmeyen GHs etkinlik karakterize etmek için kullanılabilir. Bu durumda, Arabidopsis kök veya konjac glucomannan gibi tanımlanmış bir biyokütle bilinmeyen GHs13ekran için kullanılmalıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
Resim 1 : Bu oligosakkaritler KARINCALAR ile floresan derivatization için şeması gösterir. Goubet2' den değiştiren.<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"hedef ="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
Resim 2 : Temsilcisi PACE jel Arabidopsis, çam ve bir Arabidopsis mutant mannan parmak izi gösteren (csla9) hangi mannan biyosentezi bozukluğu olan. AlR bir mannanase kokteyl hidrolize ve yayımlanan oligosakkaritler bir fluorophore ile derivatized. Oligosakkaritler Jel Elektroforez boyutu, şekli ve ücret temelinde ayrı kaldık. Merdivenden manno-oligosakkaritler (Man1-6) yayımlanan oligosakkaritler göreli mobilities belirlenmesinde yardımcı olmak için gösterilir ve arıtılmış mannan (konjac türetilmiş) hidroliz olumlu bir denetim olarak gösterilir. * belirsiz bantları =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE at JoVE.com

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Bir iletişim kuralı tarafından mannan örnek olarak kullanarak Jel Elektroforez (AKPM), polisakkaritler yapısal analizi için tanımlanır.

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

structural-characterization-mannan-cell-wall-polysaccharides-plants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Görüntüleme.  Joint BioEnergy Institute. Bir iletişim kuralı tarafından mannan örnek olarak kullanarak Jel Elektroforez (AKPM), polisakkaritler yapısal analizi için tanımlanır.

Video: Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Biyokimya

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Kimya

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Biyoloji

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

Bitki Dokularının Hücre Duvarındaki Arabinogalactan Protein ve Pektinlerin Floresan İmmünolokalizasyonu

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Gelişim Biyolojisi

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached to each other by &#945;-1,6 glucoside linkages, referred to as branch points. Among the different forms of carbon storage (i.e., starch, &#946;-glucan), glycogen is probably one of the oldest and most successful storage polysaccharides found across the living world. Glucan chains are organized so that a large amount of glucose can quickly be stored or fueled in a cell when needed. Numerous complementary techniques have been developed over the last decades to solve the fine structure of glycogen particles. This article describes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). This method quantifies the population of glucan chains that compose a glycogen particle. Also known as chain length distribution (CLD), this parameter mirrors the particle size and the percentage of branching. It is also an essential requirement for the mathematical modeling of glycogen biosynthesis.

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

In the present protocol, the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) technique is used to determine the chain length distribution (CLD) and the average chain length (ACL) of glycogen.

Florofor Destekli Karbonhidrat Elektroforezi (FACE) Yöntemi Kullanılarak Glikojen Glukan Zincir Uzunluğu Dağılımının Belirlenmesi

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Mikroarray Polimer Profilleme Kullanılarak Glikan Yapısının ve Oluşumunun Açıklanması

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

Yazar Spotlight: MAPP Protokolü – Glikan Analizini Geliştirme 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler