속도 방법 개발 및 년간, 듀 프리 그룹 (캠브리지 대학, 영국)의 다양 한 멤버에 의해 최적화 그리고 그들의 모든 기여 부탁 드립니다. 이 작품 드-AC02-05CH11231 로렌스 사이 계약을 통해 미국 에너지 부, 과학, 생물의 사무실 및 환경 연구, 지원 DOE 공동 BioEnergy 연구소 (http://www.jbei.org)의 일환으로 투자 되었다 버클리 국립 연구소와 미국 에너지 부 우리는 또한 감사 Thea 선택 및 비 Ngo csla9 샘플을 준비 하 고는 방법에 대 한.

1. 식물 재료의 수확 <ol><li>신선한 식물 소재 (~ 20 밀리 그램)을 수확 즉시 96% (v/v) 에탄올에 잠수함 및 30 분 동안 70 ° C에서 품 어;이 비활성화 모든 세포 벽 타락 효소 존재. 건조 소재, 2 단계부터 시작. 
	주의: 에탄올은 인화성. 
	참고: 단일 줄기 또는 근 엽 잎 분석에 대 한 충분 한 자료를 제공할 것입니다. 그러나, 적은 오류 조직의 큰 금액 풀링된 이며 이것은 쉽게 밖으로 무게를 처리 분석 하는 경우 발생할.</li>
	<li>신중 하 게 조직의 종류를 기록 하 고 발달 단계, 다 당 류 구조 변화 한다 둘 다. 예를 들어 애기 thaliana (사용된 여기)와 함께 Boyes 외에서 방법 조직 단계 15 참고:이 프로토콜에서 우리가 사용한 화 서 줄기의 아래쪽 첫 번째 silique 하지 yellowing 하지만 길쭉한 완전히.</li></ol>
 2. 준비의 알코올 불용 성 잔류물 (공기) <ol><li>준비 공기, 모 티 머 외의 방법을 9 또는 녹는 설탕, 자당, 전 분 등 부족 한 분말을 생성 하기 위해 다른 유사한 방법.</li>
</ol> 3. Aliquoting 및 전처리의 공기 참고: 각 샘플 자료에 대 한 관심의 다 당 류 및 oligosaccharides 발표의 평균 크기 (b)의 (a)는 풍부에 따라 달라 집니다에 필요한 공기의 정확한 양을 Gh입니다. 메서드는 oligosaccharides 수 실험의 감도 결정 하는 그래서 각 처리한후 줄이는 끝에 단 하나 형광 성 분자를 추가 합니다. 으로 GH5/GH26 (설명) 하는 대로로 소화 하는 애기 줄기에 만점 500 µ g는 것이 좋습니다 11, 반면 xylan GH11로 소화 하는 애기 줄기에, 100 µ g는 것이 좋습니다 모 티 머와 같이 &#39; s 연구 3. <ol><li>15 mL 원심 분리기 튜브에 공기 (10-15 mg)를 무게 및 H 2 O 2 mg/mL의 최종 농도에 추가. 소용돌이 현 탁 액을 달성 하기 위해입니다. 이 문제가 있는 경우, 다음이 프로세스를 지원 하기 위해 유리 균질 화기를 사용.</li>
	<li>Aliquot 500 µ g microfuge에 튜브입니다. Aliquots 진공 원심 분리기를 사용 하 여 건조 (재료의 표 참조) 하룻밤에 30 ° c.</li>
	<li>사전 치료 공기 1 M NaOH (20 µ L); 실 온에서 1 h이 드 acetylates는 다 당 류와 셀 룰 로스 microfibrils, 바이오 매스 구조 방해와 GH 접근 부. 
	참고:이 단계 정제 류 위해 생략 수 있습니다. 주의 &#8211; 강한 산 또는 기초.
	<ol><li>아니 효소 공기 제어에 대 한 약 수 포함 (단계 4.1 제외 하 고 모든 샘플 취급. 제외).</li>
	</ol></li> <li>추가 200 µ L H 2 O 및 20의 µ L 1 M HCl를 중화. 테스트는 pH는 1 µ L을 제거 하 고 종이 pH 지시자 지구에 안보 여 ~ 6-7.</li>
	<li>추가 50 µ L 1m 암모늄 아세테이트 버퍼, pH 6.0 (또는 중 pH는 연구에 사용 된 GHs에 적합) 및 H 2 O 500 µ L의 총 볼륨 주고. 
	참고: 암모늄 아세테이트 그리고 추가 소금 샘플을 추가 하지 않습니다 그것은 건조, 따라 sublimes 이후 사용 됩니다. 소금의 과잉 속도 젤에 가난한 밴드 모양 및 해상도를 발생할 수 있습니다.</li>
</ol> 4. Glycosyl Hydrolases (GHs)와 공기의 가수분해 참고:는 GHs의 순수성은 중요 한 토론에 설명 했 듯이. Heterologously 표현 사용, 선호도 효소 정화. 제조 업체에서 많은 각을 접수 한 후, 하룻밤 GH의 수량 증가 함께 기판 (예를 들어, 500 µ g 공기)의 정의 된 aliquots은 (예를 들어, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ L) (3 단위 / µ L). GH의 과잉이 있을 때, 속도 지문 동일 보일 것 이다. 효소의 과잉은 해야 하기 때문에 그것 특정 가수분해 반응 끝점 다가오고 재현 가능한 결과 제공 하는 데 필요한.
<ol><li>추가 단계 3.5에서에서 버퍼에 공기 aliquots mannanases (GH5 및 GH26 11) 긍정의 미리 정해진된 금액 (위 참조) 컨트롤 (곤 약 만점의 30 µ g), 그리고 아니오 공기 부정적인 컨트롤 (효소 혼합에는 빈 관)입니다. 소용돌이, 그리고 튜브의 하단에 반응 혼합물을 수집 하는 짧게 다음 스핀.</li>
	<li>부드러운 동요 (~ 100 rpm)와 함께 37 ° C (또는 선택의 GH에 대 한 적절 한 온도)에서 밤새 품 어.</li>
	<li>20 분 동안 95 ° C에서 배양 하 여 반응을 중지 
	참고: 모자 폐쇄 플립-가기 microfuge 관을 밀봉 하기 위하여 사용할 수 있습니다.
	<ol><li>10 분, 최대 속도 벤치 가기 microfuge를 사용 하 여 원심과 상쾌한 유지.</li>
	</ol></li> <li>250 µ L H 2 O, 원심 분리기, 위와 같이 펠 릿을 resuspend 하 고 상쾌한을 유지.</li>
	<li>두 supernatants 결합 하 고 진공 원심 분리기에서 건조 (재료의 표 참조) 30 ° c (~ 3 h 또는 난방 없이 하룻밤).</li>
</ol> 5. 올리고 당 표준의 준비 H 2 O만 노 오 스 (남자), mannobiose (남자 2), mannotriose (맨 3), mannotetraose (남자 4), mannopentaose (남자 5)의 <ol><li>준비 1 m m 재고 솔루션 및 mannohexaose (남자 6), 모든 β, 1-4 연결. 약 수와-20 ° c까지 필요한 저장소.</li>
	<li>1 µ L s (표준 1) 2 µ L (S2)를 결합 하 여 남자의 3 다른 농도 1-6 혼합 준비 또는 5 µ L (S3)의 모든 6.</li>
	<li>진공 원심 분리기에서 건조 (재료의 표 참조) 30 ° c (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Derivitization의 Oligosaccharides <ol><li>준비 H 2 O에서에서 0.2 M 개미 (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic 산)의 재고 솔루션: 초 산 17:3. 고체를 완전히 분해를 60 ° C에 따뜻한 주식. 2-3 개월에 대 한 빛에서 보호 하는-20 ° C에서 저장소.</li>
	<li>는 DMSO에 2 삐 borane (2-PB)의 0.2 M 재고 솔루션을 준비합니다. 이것은 매우 검 습기 이다, 그래서 즉시 DMSO에 접수 한 후 모든 분말을 resuspend. 약 수, 그리고 1-2 년 동안-20 ° C에서 저장소. 필수 (2 주, 및 다음 삭제를 위한 4 ° C에서 저장소)로 aliquots를 녹여.</li>
	<li>H 2 O의 derivatization 버퍼 준비: DMSO 산: 아세트산 17: 3시 20분.</li>
	<li>각 샘플, 개미, derivatization 버퍼의 2 PB 및 10 µ L의 5 µ L의 5 µ L을 추가. 짧게는 튜브의 하단에 수집 하는 회전 소용돌이 철저 하 게, 다음 짧게 다시 스핀. 그림 1 반응 설명을 참조 하십시오.</li>
	<li>품 샘플 빛 으로부터 보호 37 ° C에서 하룻밤.</li>
	<li>진공 원심 분리기에서 건조 (재료의 표 참조) 30 ° c (~ 2 h).</li>
	<li>Resuspend 샘플 및 100 µ L 3 M 요소에 표준. 필요할 때까지 빛에서 보호 하는-20 ° C에서 저장소.</li>
</ol> 7. 속도의 준비 젤 참고: 젤 주조 장비의 조립 브랜드에 따라 달라 집니다. 여기, 우리 use 수직 전기 시스템 (재료의 표 참조)를 갖춘 18 cm x 24 cm 유리 접시와 1.5 m m 스페이서.
<ol><li>조립 제조 업체 당 젤 주조 장비 &#39; s 지침.</li>
	<li>확인 10 배 속도 버퍼 (1 M Tris-붕 산 염, pH 8.2) 다음과 같이: 트리 스 베이스의 121.14 g H 2 O, 그리고 해산 믹스의 ~ 400 mL에 추가. 단단한 붕 (약 60 g)의 추가 의해 8.2에 pH를 조정 하 고 다음 1 볼륨 L.</li>
	<li>10% (w/v) 염화 persulfate (AP) 주식 H 2 o. 약 수와 한 번-20 ° c. 해 동 aliquots에서 저장, 4 ° C에서 저장 만들고 2 주 후 삭제.</li>
	<li>만들고 해결 젤을 붓는 다. 위의 장비에 대 한 1 젤 50 mL에 동일시 한다. 50 mL 원심 분리기 튜브, H 2 O (20.2 mL), 5ml 10 배 속도 버퍼, 24.6 mL 40% 아크릴 아 미드/비스-아크릴 (29: 1 acrylamide:Bis) 혼합. (주의: 독성).
	<ol><li>APS의 200 µ L과 N, N, N, N´-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) 20 µ L 추가. (소개 하는 기포 방지)을 섞어 부드럽게 반전. 사용 하는 혈 청 학적인 젤 또는 다른 대용량 피 펫, ~ 4 cm 유리 접시의 맨 아래에 부 어. 공기 방울 젤에 갇혀 지 고의 가능성에 주목. 만약 그들이 할 따르고, 멈추고 틸트/탭 해제 하 젤.</li>
	</ol></li> <li>소 프로 파 놀 (주의: : 가연성) 또는, 신중 하 게, H 2 유해 (20-30 분), 다음 상위 레이어 부 O. 허용 젤 젤 오버레이. 소 프로 파 놀, 사용 하는 경우 다음 씻어 H 2 o. 드라이 2 배 압 지를 사용 하 여 모든 초과 액체.</li>
	<li>만들고 겹쳐 쌓이는 젤을 붓는 다. 6.8 mL H 2 O, 1 mL 10 배 속도 버퍼, 2.8 mL 아크릴 아 미드/비스-아크릴 믹스 (주의: 독성), 80 µ L APS와 15ml 원심 관에 TEMED의 8 µ L. 생산 해결 젤 위에 오버레이 및 혼합, 반전. 부드럽게 빗, 빗 이빨에서 트랩 공기 방울을 피하 삽입.</li>
	<li>허용 젤 (20-30 분), 유해 촉촉한 조직 그리고, 플라스틱 포장에서 포장 하 고 필요할 때까지 4 ° C에서 저장 합니다. 매장 장소에 빗. 
	참고: 젤 속도 저장 될 수 있다 최대 2 주 동안 (비록 1 주 미만 이상적 이다), 그들은 습 한 유지 하는 경우.</li>
</ol> 8. 실행 속도 젤 <ol><li>영구 마커를 사용 하 여 로드 순서를의 추적을 유지에 도움이 될 것입니다, 유리에 잘 위치를 그리고 어디 식별 우물 빗 제거 되 면.</li>
	<li>빗을 제거합니다. 1 x 속도 버퍼에 채울 우물.</li>
	<li>10 µ L microsyringe를 사용 하 여 우물에 표준 및 샘플 2 µ L을 로드. 샘플을 제대로 실행 하는 경향이 가장 바깥쪽 차선을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>젤 실행 기구의 상단 챔버를 조립 하 고 1 x 속도로 버퍼를 포함 하는 냉각된 (~ 10 ° C) 실행 탱크 (10 ° C)에서 젤 장소. 1 x 속도 버퍼에 채워 상단 챔버.</li>
	<li>설정 능력과 실행 200 V 젤 (상수 V) 30 분, 그리고 1000 V 증가 전압에 대 한 1 시간 40 분. 빛 (예를 들어, 검은 쓰레기 봉투에 탱크를 배치 하 여)에서 젤을 보호. 
	참고: 1000 V 전압을 증가 후 전압, 설정 하 고 다른 5 분 후 젤 ~ 5 분에 확인 하십시오. 파워 팩 버퍼 누출 가능성이 다음 전압을 유지할 수 없는 경우에. 탱크에서 젤을 제거 합니다. 상부 챔버, 모든 가스 켓의 배치를 신중 하 게 검사를 재조 립. 유리 접시의 위쪽 가장자리에 큰 칩 개 스와 함께 좋은 물개를 형성 하는 접시를 방지할 수 있습니다. 이 일반적으로 일시적으로 해결 될 상단 챔버를 추가 하기 전에 유리의 부서진된 부분에 5% (w/v) 녹은 agarose의 한 방울을 추가 하 여.</li>
</ol> 9. 페이스 젤 시각화 참고: 이미징 시스템 긴 웨이브 UV 전구는 transilluminator에 fluorophore, 여기 530 nm에 대 한 적합 한 카메라에 대 한 배출 필터를 장착 하는 젤을 사용 하 여. 또한, 레이저 스캐너도 사용할 수 있습니다, Goubet 2에서 설명한 대로.
<ol><li>이미징 시스템 젤 촉촉한 보풀 티슈로 닦아 먼지 무료입니다 보장.</li>
	<li>속도 탱크에서 젤을 제거 하 고 젤은 유리 접시에 아직도 하는 동안 간단히 볼 (&#60; 80 ms) 젤에 아직도 염료 앞 인지 확인 하려면.</li>
	<li>젤 쐐기 도구를 사용 하 여 열고 젤 한 유리 접시에 아직도 하는 동안 피자 커터를 사용 하 여 모두 겹쳐 쌓이는 젤을 제거 하 고 염료 전면 젤, 젤의 하단에 남아 있으면.</li>
	<li>는 Transilluminator의 표면에 ~ 5 mL H 2 O 넣은 다음은 transilluminator에 직접 젤을 전송 합니다. UV 605에 필터를 설정 하 고 장파 UV transilluminator 설정 (재료의 표 참조) 소프트웨어를 사용 하 여. 
	참고: 여기에 사용 되는 개미 fluorophore는 흥분/353/520의 방출 nm.</li>
	<li>다양 한 노출 시간에 여러 이미지를 (예를 들어, 10 100 ms s). UV 빛 형광 저하를 피하기 위해 UV 빛 단추 (해제)를 클릭 하 여 이미지 사이 해제 되어 있는지 확인 합니다. 이미지의 적어도 2는 없는 포화 밴드 (이미징 소프트웨어 젤이 표시 됩니다) 확인 하십시오.</li>
	높은 resolution.tif 이미지 파일을 저장 하는 <li>. 
	참고: 이미지를 분석할 수 있습니다 이미징 시스템, 젤 또는 ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) 등 자유롭게 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 제공 하는 소프트웨어를 사용 하 여. 정량에 대 한 논의 결과 섹션을 참조 하십시오.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

속도 다 당 류 구조를 특성화에 대 한 간단한 방법입니다. 그것은 적용 될 수 있는 어떤의 다 당 류는 알려진 GHs 특징이 활동,에 문학1,6,,911에서 수많은 예제를 참조 하십시오. Tt 또한 소설 GHs12,,1318 및 glycosyltransferases9의 특성에 적용 된 정의 된 다 당 류 기판 및 수락자의 사용 하 여.
재현성, 해석할 결과 세 가지 주요 단계에 따라 다릅니다. 첫째, 사용 하는 GHs 활동을 오염에서 무료로 해야 합니다. 이것은 가장 선호도 효소 정화만 heterologously 표현 사용 하 여 달성. 둘째, 대부분의 실험에 대 한 완료 된 기판의 효소 가수분해는 중요 하다. 이렇게 하면 동일한 GH와 분해 같은 바이오 매스 모든 실험에서 동일한 지문 제공. 마지막으로, derivatization 반응에 fluorophore의 초과 해야 합니다. 이렇게 하면 100% 사용 가능한 줄이는 끝에 표시 됩니다. 이 높은 재현성 결과 양적 데이터의 발생 합니다.
젤과 시 약 품질 데이터를 재현할 수 있도록 중요 하다. 특히 잘못 된 pH의 품질이 버퍼, 젤, 거품 공기와 소금의 초과 샘플 수는 oligosaccharides의 모든 영향을 해상도 고정 요소. 그러나, 프로토콜 및 결과 섹션에 설명 된 권장된 컨트롤의 포함 문제 해결 수 있게 된다.
속도는 oligosaccharides 식별 하는 능력에 의해 제한 됩니다. 몇 가지 실험에 대 한 간단한 지문이 다 필요한 것입니다. 그러나, 진정으로 quantitate 만점 공기 샘플에서의 양을, 예를 들어 모든 릴리스된 oligosaccharides id를 필요 시간이 걸리는 과정입니다. 이것은 더 복잡 한 류 xylan3등 덜 간단입니다. 때문에 상업적으로 사용할 수 있는 몇 가지 올리고 당 기준이 있다, 그것은 않을 수 있습니다 항상 가능한 또는 모든 밴드를 식별 하는 것이 좋습니다. 이 경우에, 속도 질량 분석 (즉, MALDI CID9 또는 ESI 석사7및 NMR6)를 매우 무료 데이터를 제공할 수 있습니다. 이러한 방법에 대 한 그것은 종종 대규모 준비, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리 고 다음 MS 나 NMR 이전 두 걸음에 의해 각 분수를 분석 하는 데 도움이. 그것은 알려졌다 밴드 excised 되 고 MALDI CID로 식별 될 수 있다, 하는 동안 실제로 우리가 나타났습니다 이것은 (아마도 때문에 아크릴 아 미드 젤 UV 빛에 드러낼 때 레이블이 oligosaccharides의 상호 작용) 성공의 낮은 비율.
속도의 다른 주요 한계 처리량입니다. 좋은 품질, 적절 한 컨트롤과 해석할 젤을가지고 각 젤 것입니다만 ~ 10 실험 샘플, 있고 연구원 하루 ~ 4 속도 젤 실행을 기대할 수 있습니다. 최근, 모 세관 전기 이동 법 (세 륨)를 사용 하 여 속도 버전 개발된19, 96 잘 접시에 샘플의 준비를 허용 되었습니다. 그것은 사용 되었습니다 성공적으로 glycosyltransferase 효소 활동 및 다 당 류 구조6,19, 성격 그것 구입 하 고 유지 하는 비용이 될 수 있는 CE 컴퓨터에 액세스 해야 하지만.

젤 전기 이동 법 (속도)에 의해 다 당 류 분석 류1,2,3의 상세한 특성에 대 한 방법입니다. 식물 세포 벽 다 당 류는 악명 높게 분석 어렵다 고 대부분 방법을 사용 하려면 고가의 장비, 숙련 된 운영자 및 순화 된 물자의 다량. 여기, 우리가 설명 하는 간단한 방법을 확보에 대 한 상세한 구조상이 성체의 해상도 포함 하 여 다 당 류 구조 정보.
이해 식물 세포 벽 다 당 류 구조는 식물 세포 벽 생 합성 또는 식물 개발에서 식물 세포 벽의 역할을 탐구 하는 그 연구원은 필요 합니다. 그러나 최근에,, 식물 세포 벽 구성이 되었다 바이오 연료와 바이오4를 생산 하는 원료로 식물 바이오 매스 (기본적으로 세포 벽)를 사용 하 여 포커스로 인해 연구자의 넓은 그룹에 흥미로운. 예를 들어,이 자료의 효율적인 효소 젖 필요 다 당 류 구조의 상세한 이해 최적화 된 효소 칵테일 선택된5될 수 있도록 합니다.
속도 빠른 복잡 한 glycan 구조 분석에 적합 하 게 하는 다른 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 그것은 다 당 류 문제의 솔루션 상태 핵 자기 공명 (NMR)6에 대 한 필요의 정화를 요구 하지 않습니다. 둘째, 속도 질량 분석 달리 구조이 성체를 해결할 수 있습니다 (MS, 예를 들어, 매트릭스 보조 레이저 탈 착 또는 이온화 (MALDI) 및 분무 이온화 (ESI)),이 또한도 전하실 수 있습니다 액체 크로마토그래피 (LC) 에 의해 수행 하 7. 셋째, 속도 낮은 picomole 해상도, 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 또는 종이 크로마토그래피와 달리 매우 민감한. 마지막으로, 그것은 필요 하지 않습니다 비싼 장비 또는 전문 지식, MS, NMR, 및 LC에 대 한 경우입니다.
속도 방법의 다 당 류 혼합물에서 특정 glycosidic 연계 대상 glycosyl 가수분해 효소 (GH) 효소의 특이성에 의존 합니다. GH 효소 다 당 류 사슬에 행위 때 수 다음 수 화학적으로 derivatized,이 경우에 형광 성 상표로 줄이는 끝을 보여준다. 따라서이 샘플의 unhydrolyzed 부분이이 방법으로 탐지 렌더링 됩니다. 레이블이 oligosaccharides 다음 전기 이동 법으로 대형 아크릴 아 미드 젤에서 분리 된다. 이 매우 유사한 분자의 뛰어난 해상도 제공, 예를 들어 Glc-남자-남자와 Glc-남자-Glc trisaccharides 다른 Rf해야한다.
페이스 애기6,,910,11 glycosyltransferase 돌연변이 식별 하기 위해 식물 종8년에 걸쳐 다른 xylan 구조 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. , glycosyltransferase 분석 실험9, 수행 하 고 소설 GH 활동12,13하. 우리는 또한 최근 효 모 세포 벽 mannan (Mahboubi와 모 티 머, 준비에서) 하 그것을 이용 했다. 여기 우리는 식물 세포 벽 만점 구조, 이전 보고서11,14에 따라 특성화 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Oligosaccaharide Standards&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Mannobiose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 14417-51-7</td><td></td></tr><tr><td>Mannotriose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 28173-52-6</td><td></td></tr><tr><td>Mannotetraose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannopentaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannhexaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td><td>Megazyme</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other specialty chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td><td>(Molecular probes) Thermo</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-picoline borane</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td><td>Bio-rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialty Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel casting kit</td><td>Hoefer</td><td>SE660 kit</td><td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td></tr><tr><td>Cooling recirculating water bath&amp;nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td><td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td></tr><tr><td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td></tr><tr><td>High Voltage Power Pack</td><td>Thermo</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td><td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel electrophoresis system</td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Glycosyl hydrolases&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lab supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel imaging software ( Genesys)</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

식물 세포 벽 다 당 류는 악명 높게 분석 어렵다 고 대부분 방법을 사용 하려면 고가의 장비, 숙련 된 운영자 및 순화 된 물자의 다량. 여기, 우리가 설명 하는 간단한 방법을 확보에 대 한 상세한 구조상이 성체의 해상도 포함 하 여 다 당 류 구조 정보. 다 당 류 젤 전기 이동 법 (속도)에 따라 분석, 식물 세포 벽 재료 glycosyl hydrolases 특정 관심 (mannan에 대 한예를 들어, mannanases)의 다 당 류로 분해 이다. 대형 polyacrylamide 젤 다음 붙일 분류 되었습니다 릴리스 oligosaccharides 분리 하는 데 사용 됩니다. 이미징 시스템 수정 젤 젤을 구상 될 수 있다 ( 재료의 표참조). 결과 처리한후 지문도 비교할 수 있습니다 질적으로 하거나, 복제, 양적. 연계 및 분기 정보 추가 glycosyl hydrolases (예를 들어, mannosidases 및 galactosidases)를 사용 하 여 설정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 만점 구조를 분석 하는 방법에 설명 합니다, 하는 동안 어떤 다 당 류는 특징이 glycosyl hydrolases 존재에 적용할 수 있습니다. 또는, 그것은 소설 glycosyl hydrolases 사용 하 여 정의 된 다 당 류 기판의 특성을 사용할 수 있습니다.

여기, 우리가 보여 데이터 해석 및 문제 해결 지원에 대해 설명 프로토콜 당 실행 예제 속도 젤 그리고 이것은 일반적인 가이드 젤 해석13,16속도 성공적인 옵니다. 대표적인 젤 표준 속도의 세포 벽 mannan 콘텐츠 분석 결과 그림 2, 그리고 설명 차선으로 차선.
표준 차선 1, 2, 3 5 (S1), 10 (S2), 50 (S3) pmol 농도에 상업적으로 구입한 oligosaccharides (남자1-남자6)의 사다리를 보여줍니다. 새로운 상업 처리한후 많은 받을 때 그것은 젤에 순도 확인 하는 것이 중요입니다. 많은 oligosaccharides, 특히 tetrasacccharides 하 고, 수 중 합 (DPs), 다른도의 oligosaccharides와 중요 한 오염 같이 남자6 (으로 표시 된 *). 젤 quantitating, 하는 동안 때문에 표준 곡선을 계산 하는 것이 필요 하다는 표준의 적어도 3 농도 중요 하다. 표준 곡선의 계산 derivatization 반응 본질적으로 완료에 보장 도움이 수 있습니다. 알려진된 농도의 표준 젤, 사이 비교 되며 분리 품질 및 derivatization 품질에 대 한 유용한 제어.
긍정적인 통제 레인 4 곤 약 만점의 mannanase 소화를 보여준다. 곤 약 만점 상업적으로 사용할 수 있으며 그것은 것과 같은 구조를가지고 있지 않다면, 하는 동안 예를 들어 있는 애기, 역할 두 가지 목적. 첫째, 그것은 소화 효소에 대 한 중요 한 컨트롤입니다. 연구원은 선택의 그들의 GHs와 소화 상업 기판 모습 때 소화 완료 (즉, GH의 광대 한 과잉 반응에 추가 됩니다) 설정 해야 합니다. 미래에 실험 패턴 변경,이 활동의 손실 또는 GH의 오염을 나타낼 수 있습니다. 둘째, 그것은 derivatization 반응 효소 및 버퍼 소금의 존재에 대 한 컨트롤 역할을 합니다. 표준 보기 좋은, 하지만 긍정적인 통제는 가난,이 가수분해 반응의 구성 요소는 derivatization에 금지는 나타낼 수 있습니다.
야생 타입 (WT) 애기 줄기 공기 + mannanase 칵테일 (GH5 + GH26) 레인 5 WT 애기 줄기 (참조11,14와 비교)의 속도 지문을 보여줍니다.
csla9 애기 줄기 공기 + mannanase 칵테일 (GH5 + GH26) 레인 6 쇼는 애기에서 줄기의 속도 지문 주요 부족 식물 줄기 mannan synthase11보여줍니다. 지문을 WT 및 부정적인 제어를 비교 합니다. mannan의 대부분은 결 석 하는 동안이 공장에서 소량 남아, 모든 mannanase 파생 oligosaccharides이 추가 mannan synthases (CSLA2, 3)에 의해 합성에 대 한 감소 밴드 농도 의해 입증으로11.
부정적인 통제-효소만 레인 8 하지 않은 젤에 밴드를 보여줍니다 칵테일, mannanase에서 오염 물질에서 파생 되는 분석에서 제외 해야 하는 특정 (으로 표시 된 *).
부정적인 통제-WT 공기만 레인 9 특정 되지 않으며 분석에서 제외 해야 하는 젤에 밴드를 보여준다 (표시 *).
네거티브 제어- csla9 공기만 레인 10 특정 되지 않으며 분석에서 제외 해야 하는 젤에 밴드를 보여줍니다 (으로 표시 된 *).
소나무 나무 공기 + mannanase 칵테일 (GH5 + GH26) 레인 7 galactoglucomannan를 포함 하는 소나무의 속도 지문을 보여줍니다. 이것은 명확 하 게 그것의 다른 구조 때문에 애기, 출시 oligosaccharides의 다른 패턴은 있다.
부정적인 통제-파인에 어만 레인 11 특정 되지 않으며 분석에서 제외 해야 하는 젤에 밴드를 보여줍니다 (으로 표시 된 *).
해석 속도 젤은 비교적 간단 하지만 다음 사항에 대 한 인식을 요구 한다. 강력한 데이터를 수행 하기 위해 적어도 3 독립적으로 생물학 성장 속도 복제, 그리고 각 생물 복제에 적어도 2 기술 복제를 수행 하는 것이 좋습니다 하는 것이 좋습니다. 컨트롤 설명가 해석, 일반적인 밴드 제외 해야 합니다. 효과 transilluminator에 의해 고르지 조명에서 결과 제외 하려면 복제 젤에 다른 순서로 샘플 로드 것이 좋습니다. 정확한 해석 포화 되지 밴드의 분석을 요구 한다. 이후 일부 처리한후 지문을 모두 매우 높고 낮은 풍부한 다 당 류를 포함 될 수 있습니다, 같은 젤의 다중 노출 분석 하는 것이 좋습니다. 표준 다른 이미지 사이 정상화를 사용할 수 있습니다.
일부 유형의 실험에 대 한 공기 준비에서 다 당 류의 양을 계량 하는 것이 좋습니다 있을 수 있습니다. 페이스 젤에서 계량 하는 것이 가능 하다, 하는 동안 각 처리한후는 GHs에 의해 발표의 정확한 분자 id의 지식 그리고 속도 젤에 위치. 이것은 현재 완전히 알려져 있지 mannan, 하지만 그것은 다른 다 당 류 예: xylan3에 대 한 결정 되었습니다. 표준 정량 수행 하지 경우에 그리고 어떤 질적 또는 반 정량 분석에 도움이 될 것입니다 그래서 젤, 사이 정상화의 방법의 제공지 않습니다.
개별 oligosaccharides의 구조 식별 얻을 수 있는 칵테일을 사용 하 여 GHs 순차의 추가 GHs의 추가 연계 및 출시 oligosaccharides (예를 들어, 추가 β-1, 4-의 대체에 대 한 정보를 계시 할 수 있다 감소 비 끝에 glucosidase 발표할 예정 이다 혼합물에서 어떤 oligosaccharides 기능 포함). 사용할 수 있는 효소는 galactosidases, glucuronidases 및 glucosidases (자세한 내용은 CAZy 데이터베이스16 참조); Hogg, D. 그 외 참조 예를 들어 17 .
위의 프로토콜은 알 수 없는 GHs의 활동 특성을 사용할 수 있습니다. 이 경우에, 정의 된 바이오 매스, 애기 줄기 또는 곤 약 만점 등 알 수 없는 GHs13화면 사용 되어야 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
그림 1 :이 개미와 oligosaccharides의 형광 derivatization에 대 한 계획을 보여 줍니다. Goubet2에서 수정.<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"target ="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
그림 2 : 소나무, 애기, 애기 돌연변이에서 mannan 지문 보여주는 대표적인 페이스 젤 (csla9)는 mannan 생 합성 장애는. AlR 칵테일, mannanase로 분해 했다 고 발표 oligosaccharides는 fluorophore와 derivatized 했다. oligosaccharides 크기, 모양, 충전 단위의 젤 전기 이동 법으로 분리 되었다. 마 노-oligosaccharides (Man1-6)의 사다리 출시 oligosaccharides의 상대 mobilities 식별을 지원 하기 위해 표시 되 고 순화 mannan (곤 약에서 파생 된)의 가수분해는 긍정적인 컨트롤로 표시 됩니다. * 일반적인 밴드 =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

다 당 류 젤 전기 이동 법 (속도), 예를 들어, mannan를 사용 하 여 구조 분석을 위한 프로토콜을 설명 합니다.

속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K 조회수.  Joint BioEnergy Institute. 다 당 류 젤 전기 이동 법 (속도), 예를 들어, mannan를 사용 하 여 구조 분석을 위한 프로토콜을 설명 합니다.

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Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

라만 이미징과 다변량 분석을 결합하여 식물 세포벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 시각화합니다.

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

연구

생화학

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

화학

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

생물학

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

식물 조직의 세포 벽에 있는 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 형광 면역 국소화

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

발생학

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached to each other by &#945;-1,6 glucoside linkages, referred to as branch points. Among the different forms of carbon storage (i.e., starch, &#946;-glucan), glycogen is probably one of the oldest and most successful storage polysaccharides found across the living world. Glucan chains are organized so that a large amount of glucose can quickly be stored or fueled in a cell when needed. Numerous complementary techniques have been developed over the last decades to solve the fine structure of glycogen particles. This article describes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). This method quantifies the population of glucan chains that compose a glycogen particle. Also known as chain length distribution (CLD), this parameter mirrors the particle size and the percentage of branching. It is also an essential requirement for the mathematical modeling of glycogen biosynthesis.

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

In the present protocol, the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) technique is used to determine the chain length distribution (CLD) and the average chain length (ACL) of glycogen.

형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE) 방법을 이용한 글리코겐의 글루칸 사슬 길이 분포 결정

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Microarray Polymer Profiling을 사용한 Glycan 구조 및 발생 규명

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

저자 스포트라이트: MAPP 프로토콜 – 글라이칸 분석의 발전 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

고처리량 글라이칸 분석을 위한 마이크로어레이 폴리머 프로파일링(MAPP)

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...