Die Tempo-Methode wurde entwickelt und im Laufe der Jahre von verschiedenen Mitgliedern des Arbeitskreises Dupree (University of Cambridge, UK) optimiert, und wir freuen uns über ihre Beiträge. Diese Arbeit wurde im Rahmen des DOE gemeinsame Bioenergie Instituts (http://www.jbei.org) unterstützt vom U. S. Department of Energy, Office of Science, Büro des biologischen und Umweltforschung, durch Vertrag DE-AC02-05CH11231 zwischen Lawrence finanziert. Berkeley National Laboratory und das US Department of Energy. Wir danken auch Thea Pick- and -Vy Ngo für Hilfe bei der Vorbereitung der csla9 Proben.

1. Ernte von Pflanzenmaterial <ol><li>Ernte frisches Pflanzenmaterial (~ 20 mg) und sofort in Ethanol 96 % (V/V) Tauchen und bei 70 ° C für 30 min inkubieren; dadurch wird jede Zellwand entwürdigende Enzyme deaktiviert. Für trockenes Material, beginnen Sie mit Schritt 2. 
	Achtung: Ethanol ist brennbar. 
	Hinweis: Ein einzelnes Blatt Stängel oder Rosette bieten genügend Material für die Analyse. Jedoch weniger Fehler auftreten, wenn eine größere Menge an Gewebe zusammengefasst und analysiert, da dies einfacher zu wiegen und zu handhaben ist.</li>
	<li>Sorgfältig notieren Gewebetyp und Entwicklungsstadium als Polysaccharid Struktur variiert mit den beiden. Zum Beispiel mit Arabidopsis Thaliana (hier verwendet), inszenieren Sie das Gewebe nach den Methoden von Boyes Et al. 15 Hinweis: In diesem Protokoll haben wir die untere Hälfte des Blütenstandes Stammes, wo ist der erste Schote voll länglich aber nicht vergilben verwendet.</li></ol>
 2. Vorbereitung der Alkohol unlöslichen Rückstände (Luft) <ol><li>Prepare Luft, nach der Methode von Mortimer Et Al. 9 oder eine andere ähnliche Methode, um ein Pulver fehlen lösliche Zucker wie Saccharose und Stärke zu produzieren.</li>
</ol> 3. Aliquotierung und Vorbehandlung von AIR Hinweis: die genaue Menge der Luft benötigt für jede Probe (a) die Fülle des Polysaccharids von Interesse an dem Material und (b) die durchschnittliche Größe der Oligosaccharide hängt von veröffentlicht Das GH. Die Methode fügt ein fluoreszierendes Molekül der reduzierenden Ende jedes Oligosaccharid, d. h. die Anzahl der Oligosaccharide die Empfindlichkeit des Experiments bestimmt. Als Richtwert für Glucomannan in Arabidopsis Stamm verdaut mit GH5/GH26 (wie beschrieben), 500 µg empfiehlt 11, während für Xylan in Arabidopsis Stiel mit GH11 verdaut, 100 µg wie Mortimer empfohlen wird &#39; s Studie 3. <ol><li>Luft (10-15 mg) in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen wiegen und eine Endkonzentration von 2 mg/mL H 2 O hinzufügen. Wirbel um eine sogar Aussetzung zu erreichen. Wenn dies problematisch ist, verwenden Sie eine Glas-Homogenisator, um diesen Prozess zu unterstützen.</li>
	<li>Aliquoten 500 µg in Microfuge Röhren. Trocknen mit einer Vakuum-Zentrifuge Aliquote (siehe die Tabelle der Materialien) über Nacht bei 30 ° c</li>
	<li>Vorbehandlung Luft mit 1 M NaOH (20 µL) für 1 h bei Raumtemperatur; das de-acetylates die Polysaccharide und quillt Cellulose-Mikrofibrillen, stören die Biomasse-Struktur und GH Zugriff. 
	Hinweis: Dieser Schritt kann übersprungen werden, für gereinigte Polysaccharide. Vorsicht &#8211; starke Säure/Base.
	<ol><li>Gehören ein Aliquot für eine keine-Enzym AIR Control (gleich behandelt wie alle Proben, mit Ausnahme von Schritt 4.1. ist ausgeschlossen).</li>
	</ol></li> <li>Fügen Sie 200 µL H 2 O und 20 µL 1 M HCl neutralisieren. Testen Sie, ob der pH-Wert ~ 6-7 ist durch 1 µL entfernen und auf Papier pH-Indikator-Streifen Schmierblutungen.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL 1 M Ammonium-Acetat-Puffer, pH 6.0 (oder welcher pH-Wert für die GHs in der Studie verwendeten geeignet ist) und H 2 O zu einem Gesamtvolumen von 500 µL. 
	Hinweis: Ammoniumacetat wird verwendet, da es beim Trocknen sublimiert und so zum Beispiel nicht zusätzliche Salz hinzugefügt wird. Ein Überschuss an Salz kann zu führen schlechte Band-Form und Auflösung auf dem Tempo-Gel.</li>
</ol> 4. Hydrolyse von Luft mit Glycosyl Hydrolases (GHs) Hinweis: wie in der Diskussion erwähnt, die Reinheit der GHs ist von entscheidender Bedeutung. Verwenden Sie nur heterologously ausgedrückt, gereinigt Affinität Enzyme. Nach Erhalt der jede Charge des Herstellers, Hydrolyseneigung definierten Aliquote des Substrates (z. B. 500 µg Luft) mit zunehmenden Mengen von GH über Nacht (z. B. 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 Einheiten/µL). Wird ein Überschuss von GH, wird der Tempo Fingerabdruck identisch aussehen. Ein Übermaß an Enzym ist erforderlich, um ein reproduzierbares Ergebnis zu liefern, weil es sicher sein muss, dass die Hydrolysereaktion den Endpunkt nähert.
<ol><li>Hinzufügen einer vorher festgelegten Betrag (siehe oben) des Mannanases (GH5 und GH26 11) an der Luft Aliquote im Puffer ab Schritt 3.5 sowie eine Positive Kontrolle (30 µg von Konjac Glucomannan) und keine-AIR Negativkontrolle (Enzym-Mix in ein Leerrohr). Wirbel und dann Spin kurz auf das Reaktionsgemisch in den Boden des Röhrchens sammeln.</li>
	<li>Inkubation über Nacht bei 37 ° C (oder die geeignete Temperatur für die GH Wahl) mit sanften Agitation (~ 100 u/min).</li>
	<li>Stoppen die Reaktion durch Inkubation bei 95 ° C für 20 min. 
	Hinweis: Cap-Verschlüsse können verwendet werden, um Flip-Top Microfuge Röhren zu versiegeln.
	<ol><li>Mit einer Sitzbank Top Microfuge mit maximaler Geschwindigkeit für 10 min Zentrifugieren und bewahren Überstandes.</li>
	</ol></li> <li>Aufschwemmen Pellet in 250 µL H 2 O, Zentrifuge wie oben beschrieben, und behalten überstand.</li>
	<li>Kombinieren beide Überstände und trocknen in einem Vakuum-Zentrifuge (siehe die Tabelle der Materialien) bei 30 ° C (~ 3 h oder über Nacht ohne Heizung).</li>
</ol> 5. Vorbereitung der Oligosaccharid-Standards <ol><li>vorbereiten 1 mM Lager Lösungen in H 2 O der Mannose (Mann), Mannobiose (Man 2), Mannotriose (Man 3), Mannotetraose (Mann 4), Mannopentaose (Mensch 5) und Mannohexaose (Mann 6), alle β 1-4 verknüpft. Aliquoten und Store bei-20 ° C bis erforderlich.</li>
	<li>Bereiten Sie 3 unterschiedliche Konzentrationen eines Mannes 1-6 Mischung durch die Kombination von 1 µL (Standard S1), 2 µL (S2) oder 5 µL (S3) aller sechs.</li>
	<li>Trocken in einer Vakuum-Zentrifuge (siehe Tabelle der Materialien) bei 30 ° C (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Derivitization der Oligosaccharide <ol><li>vorbereiten eine Stammlösung von 0,2 M Ameisen (8-Aminonaphthalene-1,3,6-Trisulfonic Säure) in H 2 O: Essigsäure 17:3. Warmen Lager auf 60 ° C das Solid vollständig auflösen. Shop bei-20 ° C, lichtgeschützt, für ca. 2-3 Monate.</li>
	<li>Vorbereitung eine 0,2 M-Stammlösung von 2-Picoline Boran (2-PB) in DMSO. Dies ist extrem hygroskopisch, also sofort alle Pulver nach Erhalt in DMSO aufzuwirbeln. Aliquoten und Store bei-20 ° C für 1-2 Jahre. Auftauen Aliquote als erforderlich (Speicher bei 4 ° C für 2 Wochen und dann verwerfen).</li>
	<li>Vorbereitung den Derivatisierung Puffer von H 2 O: acetic Acid: DMSO um 17:03:20.</li>
	<li>, Jede Probe, 5 µL der Ameisen, 5 µL 2-PB und 10 µL Derivatisierung Puffer hinzufügen. Spin kurz, sammelt auf dem Boden des Rohres, Vortex gründlich, und dann wieder kurz schleudern. Abbildung 1 Reaktion Beschreibung finden Sie unter.</li>
	<li>Proben Inkubation über Nacht bei 37 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
	<li>Trocken in einer Vakuum-Zentrifuge (siehe Tabelle der Materialien) bei 30 ° C (~ 2 h).</li>
	<li>Aufschwemmen Proben und Standard in 100 µL 3 M Harnstoff. Shop bei-20 ° C, lichtgeschützt bis erforderlich.</li>
</ol> 7. Vorbereitung der PACE Gele Hinweis: Montage von Gel-Gießanlage abhängig von der Marke. Hier, wir uSe eine vertikale Elektrophorese-System (siehe Tabelle der Materialien), ausgestattet mit 18 x 24 cm Glasplatten und 1,5 mm Spacer.
<ol><li>Gel Gießanlage pro Hersteller montieren &#39; Anweisungen s.</li>
	<li>Machen 10 X Tempo Puffer (1 M Tris-Borat, pH 8,2) wie folgt: ~ 400 mL H 2 O und Mischung auflösen 121,14 g Tris-Base hinzufügen. Passen Sie den pH-Wert auf 8.2 durch Zugabe von soliden Borsäure (ca. 60 g), und dann Volumen bis zu 1 L.</li>
	<li>Machen eine 10 % (w/V) Ammonium Bleichen (APS) Lager H 2 O. Aliquot bei-20 ° c Auftauen Aliquote einmal speichern, bei 4 ° C lagern und nach 2 Wochen wegwerfen.</li>
	<li>Machen und gießen Sie die Lösung von Gel. Für die oben genannten Geräte entsprechen 1 Gel 50 mL. Mischen Sie in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen H 2 O (20,2 mL), 5 mL 10 X Tempo Puffer, 24,6 mL 40 % Acrylamid/Bis-Acrylamid (29,1 Acrylamide:Bis). (Vorsicht: giftig).
	<ol><li>200 µL APS und 20 µL von N, N, N, n-Tetramethyl-Ethylenediamine (TEMED) hinzufügen. Invert sanft zu mischen (zur Vermeidung von Luftblasen Einführung). Gießen Sie das Gel mit einem serologischen oder andere großvolumigen Pipette, ~ 4 cm unterhalb der Oberkante der Glasplatten. Achten Sie auf die Möglichkeit der Anreise in das Gel eingeschlossenen Luftbläschen. Wenn sie tun, nicht mehr gießen und Tilt/Tap das Gel um sie freizugeben.</li>
	</ol></li> <li>Gel mit Isopropanol (Vorsicht : entzündlich) oder sorgfältig, mit H 2 O. Allow Gel zu polymerisieren (20-30 min.), dann gießen Sie die oberste Schicht zu überlagern. Wenn Isopropanol verwendet wurde, dann waschen Sie 2 X mit H 2 O. Dry überschüssige Flüssigkeit mit Löschpapier.</li>
	<li>Machen und gießen Sie das stapelnde Gel. Mischen Sie 6,8 mL H 2 O, 1 mL 10 X Tempo Puffer, 2,8 mL Acrylamid/Bis-Acrylamid (Vorsicht: giftig), 80 µL APS und 8 µL TEMED in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Kehren Sie um zu mischen und auf polymerisierten Lösung von Gel zu überlagern. Sanft fügen Sie Kämme, Trapping Luftblasen unter den Kamm Zähnen zu vermeiden.</li>
	<li>Zulassen Gel (20-30 min), polymerisieren in feuchten Gewebe und dann in Plastikfolie wickeln und Lagerung bei 4 ° C bis erforderlich. Geschäft mit den Waben vorhanden. 
	Hinweis: Schritt Gele können gespeichert werden für maximal 2 Wochen (obwohl weniger als 1 Woche ideal ist), wenn sie feucht gehalten werden.</li>
</ol> 8. Mit einem Tempo Gel <ol><li>einen permanenten-Marker zu verwenden, um die gut Positionen auf dem Glas, beschriften, die dabei die Ladereihenfolge Überblick zu behalten helfen werden, und bei der Ermittlung von wo die Brunnen sind einmal der Kamm entfernt wird.</li>
	<li>Entfernen Sie den Kamm. Brunnen mit 1 X Tempo Puffer füllen.</li>
	<li>Verwenden eine 10 µL Microsyringe 2 µL Standards und Proben in den Brunnen zu laden. Vermeiden Sie die Verwendung der äußersten Bahnen, die neigen zu Proben laufen schlecht.</li>
	<li>Montage die obere Kammer des Apparates Gel-Ausführung und legen Sie das Gel in einem gekühlten (~ 10 ° C) laufenden Tank (10 ° C), 1 X Tempo Puffer enthält. Die obere Kammer mit 1 X Tempo Puffer füllen.</li>
	<li>Schalten Sie die macht, und führen Sie das Gel bei 200 V (konstante V) für 30 Minuten und dann Erhöhung der Spannung bis 1000 V für 1 h 40 Minuten. Schützen Gele aus Licht (z. B. durch das Einwickeln von Panzern in schwarzen Mülltüten). 
	Hinweis: Aktivieren Sie die Gele ~ 5 min nach dem Einschalten der Spannung, und dann noch 5 Minuten nach Erhöhung der Spannung bis 1000 V. Wenn das Power Pack nicht in der Lage ist, die Spannung aufrecht zu erhalten, dann gibt es wahrscheinlich ein Puffer-Leck. Nehmen Sie das Gel aus dem Becken. Montieren Sie die obere Kammer, sorgfältiger Kontrolle Platzierung aller Dichtungen. Ein großer Chip am oberen Rand der Glasplatte kann die Platte bilden eine gute Abdichtung mit der Dichtung verhindern. Dies kann in der Regel vorübergehend behoben werden, indem ein Rückgang von 5 % (w/V) flüssige Agarose zu den abgebrochenen Teil des Glases, vor dem Hinzufügen der oberen Kammer.</li>
</ol> 9. Visualisierung einer Tempo-Gels Hinweis: verwenden Sie eine Gel imaging-System ausgestattet mit langwelligem UV-Strahler in den Transilluminator und eine Emission Filter für die Kamera, die für das Fluorophor, hier 530 nm geeignet ist. Alternativ ein Laserscanner kann auch verwendet werden, wie unter Goubet 2.
<ol><li>Sicherzustellen, dass das Gel imaging-System staubfrei durch Abwischen mit einem feuchten fusselfreien Tuch.</li>
	<li>Das Gel aus dem Tempo-Becken nehmen und kurz angezeigt werden, solange das Gel nach wie vor in die Glasplatten ist (&#60; 80 ms) um festzustellen, ob die Farbstoff-Front noch auf das Gel ist.</li>
	<li>Das Gel mit einem Keil-Tool zu öffnen, und zwar Gel noch auf einer Glasplatte, ein Pizzaschneider verwenden, um sowohl das Stapeln Gel entfernen und, wenn die Farbstoff-Front noch auf das Gel, der Unterseite des Gels ist.</li>
	<li>~ 5 mL H 2 O auf der Oberfläche der Transilluminator und übertragen Sie dann das Gel direkt auf die Transilluminator. Setzen Sie den Filter UV-605, und schalten Sie die langwelligen UV-Transilluminator (siehe Tabelle der Materialien) mit Hilfe der Software. 
	Hinweis: Die Ameisen Fluorophor verwendet hier hat eine Anregung/Emission von 353/520 nm.</li>
	<li>Nehmen Sie mehrere Bilder bei verschiedenen Belichtungszeiten (z. B. 100 ms bis 10 s). Stellen Sie sicher, dass das UV-Licht zwischen Bilder durch Klicken auf das UV-Licht-Taste (um das Gerät auszuschalten) um zu vermeiden, die Fluoreszenz erniedrigende ausgeschaltet ist. Sicherzustellen, dass mindestens 2 der Bilder keine gesättigten Bands haben (das Gel imaging-Software zeigt dies).</li>
	<li>Gespeicherte Dateien als Bilder hoch-resolution.tif. 
	Hinweis: Bilder können mit der Software zur Verfügung gestellt mit dem Gel imaging-System oder durch die Verwendung von frei verfügbaren Bildanalyse-Software, wie z. B. ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) analysiert werden. Siehe Abschnitt Ergebnisse für eine Diskussion der Quantifizierung.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Tempo ist eine einfache Methode zur Charakterisierung von Polysaccharid-Struktur. Es kann angewendet werden, Polysaccharid, für die es GHs mit geprägten Tätigkeit bekannt, siehe zahlreiche Beispiele in der Literatur1,6,9,11. TT galt auch für die Charakterisierung der neuartigen GHs12,13,18 und Glycosyltransferases9, durch den Einsatz von definierten Polysaccharid Substrate und Akzeptoren.
Reproduzierbare, interpretierbare Ergebnisse hängen drei Hauptschritte. Erstens sollte das GHs verwendet frei von kontaminierenden Aktivitäten sein. Dies geschieht am besten nur mit heterologously ausgedrückt erreicht, Affinität gereinigt Enzyme. Für die meisten Experimente, zweitens ist es wichtig, dass die enzymatische Hydrolyse der Substrate bei Fertigstellung. Dadurch wird sichergestellt, dass die gleichen Biomasse mit der gleichen GH hydrolysiert bei jedem Versuch den gleichen Fingerabdruck gibt. Schließlich sollte ein Übermaß an Fluorophor in der Derivatisierung Reaktion. Dadurch wird sichergestellt, daß die verfügbaren reduzierenden enden bei nahezu 100 % gekennzeichnet werden. Dies wird dazu führen, dass hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sowie Daten, die quantitative.
Gel und Reagenz Qualität sind entscheidend für reproduzierbare Daten zu gewährleisten. Schlechte Qualität-Puffer, vor allem der falsche pH Luftblasen in das Gel, und Proben mit einem Überschuss an Salz können alle Affekt Auflösung und Retention Faktor der Oligosaccharide. Aufnahme der empfohlenen Kontrollen beschrieben im Abschnitt Protokoll und Ergebnisse werden allerdings Problembehandlung aktiviert.
Tempo ist begrenzt durch seine Fähigkeit, Oligosaccharide zu identifizieren. Für einige Versuche ist ein einfachen Fingerabdruck alles, die was notwendig ist. Um wirklich die Menge von Glucomannan in einer Stichprobe von Luft quantitate, z. B. die Identität von allen veröffentlichten Oligosaccharide ist jedoch erforderlich, die ist ein zeitaufwendiger Prozess. Dies ist einfacher für weniger komplexe Polysaccharide wie Xylan-3. Da gibt es einige Oligosaccharid-Standards im Handel erhältlich, kann es nicht immer möglich oder wünschenswert, alle Bands zu identifizieren sein. In diesem Fall kann Tempo sehr schmeichelhaft Daten für Massenspektrometrie (d. h. MALDI-CID9 oder ESI-MS7und NMR6) bereitstellen. Für diese Methoden ist es oft hilfreich, eine groß angelegte Vorbereitung zu tun, durch Größe-Ausschluss Chromatographie trennen und dann analysieren jede Fraktion durch beide Tempo vor MS oder NMR. Während es berichtet wurde, dass Bands herausgeschnitten und durch MALDI-CID identifiziert werden können, in der Praxis fanden wir, dass dies eine geringe Erfolgsquote (möglicherweise aufgrund von Wechselwirkungen der beschrifteten Oligosaccharide mit dem Acrylamid-Gel UV-Licht).
Die andere große Einschränkung der PACE ist Durchsatz. Gute Qualität, interpretierbare Gele mit den entsprechenden Kontrollen haben jedes Gel haben nur ~ 10 experimentelle Proben und Forscher kann erwarten, ~ 4 Tempo Gele pro Tag laufen. Vor kurzem wurde eine Version von Tempo mittels Kapillarelektrophorese (CE) entwickelten19, die Vorbereitung der Proben in 96-Well Platten ermöglicht. Es hat erfolgreich eingesetzt Glycosyltransferase Enzymaktivitäten und Polysaccharid Strukturen6,19, zu charakterisieren, obwohl es Zugriff auf eine CE-Maschine, die sind teuer erfordert in der Anschaffung und Wartung.

Polysaccharid-Analyse durch Gelelektrophorese (PACE) ist eine Methode für die detaillierte Charakterisierung der Polysaccharide1,2,3. Pflanzlichen Zellwand Polysaccharide sind notorisch schwierig zu analysieren, und die meisten Methoden erfordern teure Geräte, qualifiziertes Personal und große Mengen von gereinigtem Material. Hier beschreiben wir eine einfache Methode für die Gewinnung von detaillierte Strukturinformationen Polysaccharid, einschließlich Resolution strukturelle Isomere.
Verständnis Anlagenstruktur Zellwand Polysaccharid ist notwendig für diese Forscher pflanzlichen Zellwand Biosynthese oder die Rolle der pflanzlichen Zellwand Pflanzenentwicklung zu erkunden. Vor kurzem jedoch Zellwand Pflanzenzusammensetzung interessant, eine größere Gruppe von Forschern durch die Ausrichtung auf mit pflanzlicher Biomasse (im Wesentlichen die Zellwand) als Rohstoff für Biokraftstoffe und Biochemikalien4produzieren geworden. Beispielsweise erfordert effiziente enzymatische Verzuckerung dieses Materials ein detailliertes Verständnis der Polysaccharid-Strukturen, damit optimierte enzymatische Cocktails ausgewählte5sein können.
Tempo hat mehrere Vorteile gegenüber alternativen Methoden, die es ideal für die schnelle Analyse von komplexen Glycan Strukturen bilden. Erstens benötigt es keine Reinigung des Polysaccharids in Frage, da für Lösung State Kernspinresonanz (NMR)6benötigt wird. Zweitens Tempo lösen strukturelle Isomere, im Gegensatz zu Massenspektrometrie (MS, z. B. Matrix-unterstützte laser Desorption/Ionisierung (MALDI) und Elektrospray-Ionisation (ESI)), die kann auch schwierig sein, von Flüssigchromatographie (LC) durchführen 7. Drittens Tempo ist sehr empfindlich, mit niedrig-Picomole Auflösung, im Gegensatz zu Dünnschichtchromatographie (TLC) oder Papierchromatographie. Schließlich erfordert keine teure Ausrüstung oder Spezialisten wissen, wie bei MS, NMR und LK der Fall ist.
Die Tempo-Methode stützt sich auf die Spezifität der a1 Hydrolase (GH) Enzyme, die auf bestimmte Glykosid-Gestänge in einem Gemisch von Polysacchariden. Wenn das GH-Enzym auf die Polysaccharid-Kette wirkt, zeigt es eine reduzierende Ende, dann chemisch, in diesem Fall mit einem fluoreszierenden Label derivatisiert werden kann. Der unhydrolyzed Teil der Probe ist durch diese Methode daher nicht nachweisbar gerendert. Die beschrifteten Oligosaccharide werden dann in einem Großformat-Acrylamid-Gel durch Elektrophorese getrennt. Dadurch hervorragende Auflösung sehr ähnliche Moleküle, die Trisaccharides Glc-Mann-Mann und Glc-Mann-Glc haben beispielsweise ein anderes Rf.
Tempo ist weitgehend benutzt worden, um verschiedene Xylan Strukturen über Pflanzen Arten8, zu charakterisieren, Ermittlung Glycosyltransferase Mutanten in Arabidopsis6,9,10,11 , Glycosyltransferase-Assays9durchführen und neuartige GH Aktivitäten12,13zu charakterisieren. Wir haben auch vor kurzem verwendet, um Hefe Zellwand Mannan (Mahboubi und Mortimer, in Vorbereitung) zu charakterisieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Charakterisierung der pflanzlichen Zellwand Glucomannan Struktur, basierend auf früheren Berichte11,14.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Oligosaccaharide Standards&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Mannobiose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 14417-51-7</td><td></td></tr><tr><td>Mannotriose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 28173-52-6</td><td></td></tr><tr><td>Mannotetraose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannopentaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannhexaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td><td>Megazyme</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other specialty chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td><td>(Molecular probes) Thermo</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-picoline borane</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td><td>Bio-rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialty Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel casting kit</td><td>Hoefer</td><td>SE660 kit</td><td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td></tr><tr><td>Cooling recirculating water bath&amp;nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td><td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td></tr><tr><td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td></tr><tr><td>High Voltage Power Pack</td><td>Thermo</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td><td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel electrophoresis system</td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Glycosyl hydrolases&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lab supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel imaging software ( Genesys)</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

Pflanzlichen Zellwand Polysaccharide sind notorisch schwierig zu analysieren, und die meisten Methoden erfordern teure Geräte, qualifiziertes Personal und große Mengen von gereinigtem Material. Hier beschreiben wir eine einfache Methode für die Gewinnung von detaillierte Strukturinformationen Polysaccharid, einschließlich Resolution strukturelle Isomere. Für Polysaccharid-Analyse durch Gelelektrophorese (PACE) ist die Zellwand Pflanzenmaterial mit a1 Hydrolasen spezifisch für das Polysaccharid von Interesse (z. B. Mannanases für Mannan) hydrolysiert. Großformat-Polyacrylamid-Gele werden verwendet, um freigegebene Oligosaccharide, trennen das Eindringmittel beschriftet worden. Gele können mit einem modifizierten Gel imaging-System visualisiert werden (siehe Tabelle der Materialien). Der daraus resultierende Oligosaccharid-Fingerabdruck kann entweder qualitativ oder mit der Replikation, quantitativ verglichen werden. Gestänge und Verzweigung Informationen können zusätzliche a1 Hydrolasen (z. B. Mannosidases und Galactosidases) hergestellt werden. Während dieses Protokoll eine Methode beschreibt für die Analyse von Glucomannan Struktur, kann es auf jede Polysaccharid angewendet werden, bei denen charakterisierten a1 Hydrolasen bestehen. Alternativ können verwendet werden, um neuartige a1 Hydrolasen mit definierten Polysaccharid Substrate zu charakterisieren.

Hier zeigen wir eine Beispiel Tempo Gel laufen pro das Protokoll zusammen mit Beschreibungen zur Unterstützung Dateninterpretation und Fehlerbehebung, und es folgt eine allgemeine Anleitung zum erfolgreichen Schritt Gel Auslegung13,16. Eine repräsentative Gel von einem standard Tempo Assay Zellwand Mannan Inhalte ist in Abbildung 2gezeigt, und wird beschrieben durch Bahn-Bahn.
Normen Bahnen 1, 2 und 3 zeigen eine Leiter kommerziell gekauften Oligosaccharide (Mann1- Mann-6) von 5 (S1), 10 (S2) und 50 (S3) Pmol Konzentration. Wenn Sie eine neue Menge eine kommerzielle Oligosaccharid empfangen, ist es wichtig, die Reinheit auf einem Gel zu überprüfen. Viele Oligosaccharide, besonders Tetrasacccharides und mehr, können erhebliche Kontamination mit Oligosaccharide von anderen Grad der Polymerisation (DPs), wie hier gezeigt für Mann6 (markiert mit *). Bei der Quantifizierung eines Gels, ist es wichtig, mindestens 3 Konzentrationen von den Standards zu haben, da es notwendig für die Berechnung der Standardkurve. Berechnung der Standardkurve kann auch dafür, dass die Derivatisierung Reaktion im Wesentlichen bei Fertigstellung ist hilfreich sein. Standards der bekannte Konzentrationen erlauben Vergleiche zwischen Gele und sind ein nützliches Steuerelement für Trennung und Derivatisierung Qualität.
Positivkontrolle Bahn 4 zeigt eine Mannanase Verdauung von Konjac Glucomannan. Konjac Glucomannan ist im Handel erhältlich, und während es nicht die gleiche Struktur wie das haben, z. B. fand in Arabidopsis, es dient zwei Zwecken. Erstens ist es eine wichtige Kontrolle für die enzymatische Verdauung. Der Forscher soll sieht eine kommerzielle Substrat verdaut mit ihren GHs Wahl wenn verdaut bis zur Fertigstellung (d. h. , die einen großen Überschuss an GH die Reaktion hinzugefügt wird). Wenn künftig Experimente das Muster ändert, kann dies entweder ein Verlust an Aktivität oder Kontamination der GH-Aktie hinweisen. Zweitens dient es als ein Steuerelement für die Derivatisierung Reaktion in Anwesenheit des Enzyms und Puffer Salze. Wenn die Standards gut aussehen, sondern die Positivkontrolle schlecht ist, kann dann dies bedeuten, dass ein Bestandteil der Hydrolysereaktion hemmenden, die Derivatisierung ist.
Wildtyp (WT) Arabidopsis ergeben sich Luft + Mannanase cocktail (GH5 + GH26) Bahn 5 zeigt den Tempo-Fingerabdruck eines WT Arabidopsis-Stammes (vgl. Referenzen11,14).
csla9 Arabidopsis ergeben sich Luft + Mannanase cocktail (GH5 + GH26) Bahn 6 zeigt, zeigt der Tempo Fingerabdruck des Stammes von einem Arabidopsis Pflanzen fehlen die großen Mannan-Synthase11stammen. Vergleichen Sie mit den WT und Negativkontrolle Fingerabdrücke. Während der Großteil der Mannan fehlt in diesem Werk eine kleine Menge bleibt, wie die reduzierten Band Intensitäten für alle Mannanase abgeleitet Oligosaccharide belegt wird dies durch zusätzliche Mannan Synthasen (CSLA2, 3) synthetisiert11.
Negativ-Kontrolle - Enzym nur Bahn 8 zeigt Bänder auf dem Gel, die nicht spezifisch, das ableiten von Schadstoffen in der Mannanase cocktail, und sollte aus der Analyse ausgeschlossen werden (markiert mit *).
Negativ-Kontrolle - WT nur Luft Lane 9 zeigt Bänder auf das Gel, das sind nicht spezifisch und sollte aus der Analyse ausgeschlossen werden (markiert mit *).
Negativ-Kontrolle- csla9 Nur Luft Lane 10 zeigt Bänder auf das Gel, das sind nicht spezifisch und sollte aus der Analyse ausgeschlossen werden (markiert mit *).
Kiefer Holz Luft + Mannanase cocktail (GH5 + GH26) Lane 7 zeigt den Tempo-Fingerabdruck aus Kiefernholz, die Galactoglucomannan enthält. Dies hat eindeutig ein anderes Muster der veröffentlichten Oligosaccharide, Arabidopsis, aufgrund ihrer unterschiedlichen Struktur.
Negativ-Kontrolle - Kiefer nur Luft Lane 11 zeigt Bänder auf das Gel, das sind nicht spezifisch und sollte aus der Analyse ausgeschlossen werden (markiert mit *).
Interpretation eine Tempo-Gel ist relativ einfach, erfordert aber Bewusstsein für die folgenden Punkte. Für robuste Daten empfiehlt es sich zur Durchführung Tempo auf mindestens 3 unabhängig voneinander gewachsen biologische repliziert, und es wird empfohlen, mindestens 2 technische Wiederholungen auf jede biologische Replikation durchführen. Beschriebenen Steuerelemente sind entscheidend für die Auslegung, wie unspezifische Bänder müssen ausgeschlossen werden. Wir empfehlen auch laden Proben in einer anderen Reihenfolge auf replizieren Gele, Effekte auszuschließen, die ungleichmäßige Ausleuchtung durch die Transilluminator entstehen. Genaue Interpretation erfordert eine Analyse der Bands, die nicht ausgelastet sind. Da einige Oligosaccharid Fingerabdrücke sowohl sehr hohe und niedrige Fülle Polysaccharide enthalten können, empfiehlt es sich, mehrere Aufnahmen des gleichen Gels zu analysieren. Die Standards können verwendet werden, um zwischen verschiedenen Bildern zu normalisieren.
Für einige Arten von Experimenten es möglicherweise wünschenswert, die Menge der Polysaccharid in der Luftaufbereitung zu quantifizieren. Zwar ist es möglich, aus einem Tempo-Gel zu quantifizieren, es erfordert Kenntnisse über die genaue molekulare Identität jedes Oligosaccharid, veröffentlicht von der GHs und wo befindet es sich auf das Tempo gel. Dies ist derzeit nicht vollständig bekannt für Mannan, aber für andere Polysaccharide z.B. Xylan3festgestellt wurde. Die Standards bieten einen Weg der Normalisierung zwischen Gele, auch wenn Quantifizierung nicht durchgeführt wird, und so in eine semi-quantitative oder qualitative Analyse unterstützen wird.
Identifizierung der Struktur der einzelnen Oligosaccharide lässt sich mit Cocktails der GHs. Sequential Zugabe von weiteren GHs kann enthüllen Details über Zusammenhänge und Ersetzungen von freigegebenen Oligosaccharide (z. B. Zugabe von β - 1,4 - Glucosidase, die auf nicht-reduzierenden Ende wirkt wird zeigen, welche Oligosaccharide in der Mischung enthalten diese Funktion). Verfügbaren Enzyme gehören Galactosidases, Glucuronidases und Glucosidases (siehe CAZy Datenbank16 zusätzliche Informationen); Hogg, D. Et Al. sehen 17 als Vorbild.
Das obige Protokoll kann verwendet werden, um die Aktivität des unbekannten GHs zu charakterisieren. In diesem Fall sollte eine definierte Biomasse, wie Arabidopsis Stiel oder Konjac Glucomannan, verwendet werden, die unbekannte GHs-13auf den Bildschirm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Dies zeigt das Schema für die fluoreszierenden Derivatisierung Oligosaccharide mit Ameisen. Geändert von Goubet2.<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"Target ="_blank"> klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Repräsentative Tempo Gel zeigt des Mannan-Fingerabdrucks von Arabidopsis, Kiefer und eine Arabidopsis-Mutante (csla9) hat die Mannan Biosynthese beeinträchtigt. AlR wurde mit einem Mannanase cocktail hydrolysiert und veröffentlichten Oligosaccharide wurden mit einem Fluorophor derivatisiert. Die Oligosaccharide trennten sich durch Gelelektrophorese auf der Grundlage von Größe, Form und kostenlos. Eine Leiter Manno-Oligosaccharide (Man1-6) ist zur Unterstützung bei der Identifizierung von relativer Mobilitäten veröffentlichten Oligosaccharide und eine Hydrolyse des gereinigten Mannan (abgeleitet von Konjac) ist als Positivkontrolle angezeigt. * = unspezifische Bänder. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Ein Protokoll für die Strukturanalyse von Polysacchariden durch Gelelektrophorese (PACE), mit Mannan als Beispiel, wird beschrieben.

Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

structural-characterization-mannan-cell-wall-polysaccharides-plants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Aufrufe.  Joint BioEnergy Institute. Ein Protokoll für die Strukturanalyse von Polysacchariden durch Gelelektrophorese (PACE), mit Mannan als Beispiel, wird beschrieben.

Serie: Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

Kombinieren von Raman Imaging und multivariater Analyse zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in der Pflanzenzellwand

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Forschung

Biochemie

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Chemie

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil II: Kohlenhydrate

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Biologie

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

Fluoreszierende Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen in der Zellwand von Pflanzengeweben

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Entwicklungsbiologie

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached to each other by &#945;-1,6 glucoside linkages, referred to as branch points. Among the different forms of carbon storage (i.e., starch, &#946;-glucan), glycogen is probably one of the oldest and most successful storage polysaccharides found across the living world. Glucan chains are organized so that a large amount of glucose can quickly be stored or fueled in a cell when needed. Numerous complementary techniques have been developed over the last decades to solve the fine structure of glycogen particles. This article describes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). This method quantifies the population of glucan chains that compose a glycogen particle. Also known as chain length distribution (CLD), this parameter mirrors the particle size and the percentage of branching. It is also an essential requirement for the mathematical modeling of glycogen biosynthesis.

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

In the present protocol, the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) technique is used to determine the chain length distribution (CLD) and the average chain length (ACL) of glycogen.

Bestimmung der Glucankettenlängenverteilung von Glykogen mit der Fluorophor-gestützten Kohlenhydratelektrophorese-Methode (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Messe Profiling (OLIMP) der extrazellulären Polysacchariden

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Aufklärung der Glykanstruktur und des Vorkommens mittels Microarray-Polymer-Profiling

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

Autor im Rampenlicht: MAPP-Protokoll – Weiterentwicklung der Glykananalyse 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

Microarray-Polymer-Profiling (MAPP) für die Hochdurchsatz-Glykananalyse

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...