טכניקה זו מאפשרת לנו לאסוף אוכלוסיות תולעים בקנה מידה גדול כדי לשמש פלטפורמות omics מרובים עם מניפולציה מינימלית. טכניקה זו מאפשרת לנו לאסוף אוכלוסיות C.elegans בשלב מעורב על פני ניסויים omics מרובים כדי לקבל תמונה הוליסטית של כל מדגם. להלבנת כתמים של מבוגרים מגושמים על צלחות תרבות בקנה מידה גדול, להבה תולעת לבחור מעל מבער Bunsen ולהשתמש בבחירה כדי לגרוף E.coli טרי מקצה מדשאת החיידקים על צלחת תרבות בקנה מידה גדול.
בחרו מבוגר אחד מהצלחת הרביעית להלבנת כתמים והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של פתרון היפוכלוריט אלקליין שהוכן זה עתה לפינה אחת של צלחת התרבות בקנה מידה גדול הרחק ממדשאת אי קולי. מניחים את המבוגר gravid לתוך הפתרון hypochlorite אלקליין ולהקיש על nematode כדי לשבש את הקוטיקל ולשחרר ביצים. כאשר בסך הכל חמישה מבוגרים הוצבו באופן שווה סביב מדשאת E.coli באותו אופן, מניחים את המכסה בחזרה על הצלחת.
כדי לקצור דגימות מצלחות תרבות בקנה מידה גדול, יוצקים 50 מיליליטר של פתרון M9 על משטח צלחת תרבות בקנה מידה גדול אחד מערבלים את הצלחת כדי להבטיח כי M9 מכסה את כל משטח צמיחה נמטודה בינוני agarose. ראש פיפטה סרולוגית סטרילית עם M9 ולהטות את הצלחת כך M9 ואוכלוסיית התולעת לאסוף בפינה אחת של הצלחת. השתמש פיפטה מוכן לשאוף את השעיית התולעת ולהוסיף את התולעים לצינור חרוט 50 מיליליטר.
מניחים את הצינור על נדנדה כדי לשבש את כל גושים חיידקיים ופסולת. כאשר כל התולעים נאספו מכל שלוש הצלחות, להעביר 15 מיליליטר של תולעים מכל צינור לתוך כל אחד משלושה צינורות חרוט 15 מיליליטר ומשקעים התולעים בצינורות על ידי צנטריפוגה. בזהירות לשאוף את supernatants מבלי להפריע כדורי תולעת ולהוסיף 13 מיליליטר של השעיית תולעת לכל צינור.
הפוך את הצינורות כדי resuspend כדורי לשטוף כמה שיותר חיידקים ופסולת ככל האפשר צנטריפוגה התולעים שוב. כאשר כל אוכלוסיית תולעים נאספה, לשטוף את כדורי התולעת שלוש פעמים ב 10 מיליליטר של פתרון M9 טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, resuspend כל גלולה תולעת ניקה ב 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים.
להערכת גודל האוכלוסייה, לדלל במהירות שלושה 100 aliquots microliter של מדגם תולעת מכל צינור ב 900 microliters של פתרון M9 לכל מדגם ולהשתמש aliquots לעשות דילול סדרתי. מניחים את ההשעיות מדגם תולעת מלאי על נדנדה לתנועה רציפה של התרבויות בעוד aliquots נספרים ומערבבים את דילול התולעת עד שהם הומוגניים. הוסף חמישה מיקרוליטרים של פתרון מהראשון עד 10 דגימת תולעת למגלשת מיקרוסקופ זכוכית ולספור את התולעים על ידי מיקרוסקופ אור.
אם יש פחות מ-50 תולעים במדגם, ספור את הדילולים של 1:100 ו-1:1, 000. אם יש יותר מ-50 תולעים, עבור לדילול הסדרתי הבא. לאחר ספירת כל שכפול aliquot של כל דילול שלוש פעמים, ממוצע ספירת הדילול כדי לקבוע את גודל האוכלוסייה המשוער של התולעת.
ואז לפצל את דגימות התולעת לתוך aliquots ניסיוני המתאים פלאש להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון. כדי להכין דגימת תולעת עבור cytometry זרימת חלקיקים גדולים, לדלל כחמש פעמים 10 אל aliquot תולעת השלב המעורב הרביעי לנפח סופי של 10 מיליליטר של פתרון M9 ולהוסיף 200 microliters של מיליגרם אחד מיליליטר E.coli ו 1:50 דילול של 0.5 מיקרומולאר אדום פלואורסצנטי פתרון לתולעת. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה, לאסוף את התולעים והמיקרוספרות על ידי צנטריפוגה ולשטוף את התולעים פעמיים עם פתרון M9 טרי כדי להסיר כל חיידקים עודפים מיקרוספרות לא אינטרנליין.
לאחר הכביסה השנייה, resuspend גלולה בחמישה מיליליטר של פתרון M9. אם גלולה נראה נקי, להוסיף חמישה מיליליטר של M9 בתוספת 50 מילימולאר נתרן אזיד לתולעים ומניחים את הצינור על נדנדה הן ליישר המתת התולעים לספירה מדויקת וגודל. לתיעוד התפלגות האוכלוסין, פתחו את תבנית הלוח המכוילת של 384 באר והגדירו את התבנית לחלק 20 אובייקטים מגודרים לארבע בארות כדי להשיג ארבעה שכפולים טכניים של כל אזור מגודר עבור כל אחד מ- 20 אזורי מייצגי המידה של המדגם.
לטעון מדגם 40 מיליליטר של תולעים על cytometer זרימת החלקיקים הגדולים ולהתחיל באופן אוטומטי למיין את המדגם תוך ערבוב מתמשך של המדגם כדי למנוע התיישבות ובמקביל לחלק חפצים מן המדגם לתוך צלחת 384-well מכויל. לאחר המדגם כולו כבר ממוין ואת המספר המרבי של אזורים מגודרים חולקו לתוך צלחת 384-well, להסיר את המדגם מן cytometer ולנקות את המכשיר. שיטת צלחת התרבות בקנה מידה גדול נבדקה על 15 זנים של C.Elegans, כולל תערובת של מוטציות מרכז גנטיקה Caenorhabditis ו Caenorhabditis elegans גיוון טבעי משאב זנים פראיים.
בניתוח זה, שיטת צלחת התרבות בקנה מידה גדול הניבה גדלי אוכלוסייה מכ-94, 500 עד 9, 290, 000. גודל האוכלוסייה הממוצע בתוך זן הייחוס PD1074 ועל פני זנים היה כ 2.4 מיליון תולעים. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בגדלים המשוערים של האוכלוסייה בין זנים C.elegans במהלך ממוצע של 12.2 ימי צמיחה צלחת תרבות בקנה מידה גדול.
PD1074 צלחות תרבות בקנה מידה גדול לקח בין 10 ל 14 ימים לגדול לאוכלוסייה בשלב מעורב מלא עם זמן צמיחה ממוצע של 12.2 ימים. הזן הגדל האיטי ביותר גדל במשך מקסימום של 20 ימים ואת הזן הגדל במהירות הגבוהה ביותר גדל במשך מינימום של 10 ימים. בהתפלגות מדגם זו עבור PD1074, תולעים נמדדו משלב L1 דרך מבוגר gravid על סיטרומטר זרימת חלקיקים גדולה.
הדמיה והדמיה עוקבות של הווריאציות בהתפלגות האוכלוסייה על פני דגימות גילו שהצינור יצר אוכלוסיית שלבים מעורבת של C.elegans. חשוב לספור במדויק את התולעים לאורך איסוף המדגם כך שתקבל נתונים דומים בין גידולים ומחקרים. ניתן ליישם גישת איסוף זו על רצף RNA, גנומיקה וניתוח אומיקים אחרים כדי להרחיב את הבנתנו את הדינמיקה המורכבת המתרחשת באוכלוסיות C.elegans.
טכניקה זו מאפשרת לנו לאסוף אוכלוסיות C.elegans מבוימות מעורבות על פני ניסויים אומיקים מרובים כדי לקבל תמונה הוליסטית של כל מדגם.
