הפרויקט הנוכחי מומן על ידי אוניברסיטת קנזס הוכחת הרעיון קרן. ברצוננו להודות. האחיות-KUMC (קנזס סיטי, קאי אס) עבור מסייע לנו בהשגת האנושי חבל הטבור חוטי יורגנסן דוד על סיוע עם תרבויות cochleae.

כל ההליכים, לרבות בעלי חיים המתת חסד, נערכו לפי שאושרו אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) הפרוטוקול (תגיד #2014-2234) במרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס (KUMC).
הערה: HWJCs הם בודדו אותנו מהמתרחש חוטי חבל הטבור אנושי זה נתרמו על ידי מטופלים סיפק מדעת, דגימות שימשו לפי הפרוטוקולים שאושרו על-ידי אוניברסיטת קנזס הוועדה בנושאים אנושיים (KU-IRB #15402).
1. עצם הרקה הקציר ובידוד שבלול
<ol>
	<li>לערוף כראוי לאללה, בת שבוע 15 עכבר על ידי חיתוך בין הגולגולת לבין חוליות הראשון עם זוג מספריים כירורגיים חדים, ואז לרסס את הראש עם 70% אתנול לחטא (איור 1 א').</li>
	<li>קטיעות הגולגולת במטוס מאמצע-הווריד באמצעות אותו זוג מספריים כירורגיים (איור 1B-C, קווים מקווקווים) חדה.</li>
	<li>הסר את רקמת המוח לגולגולת באמצעות זוג מלקחיים (איור 1D, ראש חץ).</li>
	<li>לזהות העצם הטמפורלית דרך נוכחות של השמיעה העצב vestibular שורשים (איור 1E-F, ראשי חץ) על החלק הפנימי של הגולגולת, תעלת האוזן מבחוץ (איור 1F, חץ). לחתוך בזהירות דרך הגולגולת כדי לבודד את עצם הרקה מהשארית של הגולגולת (איור 1 ג'י). הערה: במקרים מסוימים, ייתכן שתהיה אפשרות לחטט בעדינות את עצמות הגולגולת מן העצם הטמפורלית שמסביב ללא צורך חיתוך.</li>
	<li>הכנס המלקחיים בסדר פתיחת תעלת האוזן כ 5 מ מ (איור 1 H), אז הטיפים לא לסכן את ניקב שבלול. בעדינות שבירת העצם של בולה (איור 1 H, האזור המוצלל אדום) אז זה שברים (קואיור 1I, אדום מנוקד). הערה: אם יש צורך, מיקרוסקופ לנתיחה עשויים לסייע בתהליך זה כדי להבטיח מיקום מדויק ומניפולציה של כלי נגינה.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים בסדר, לחטט משם את שארית בולה מן העצם הטמפורלית, חשיפת המבוך הגרמי של שבלול (איור 1J, מרובעים אדום).</li>
	<li>מניחים צלחת פטרי גדולה מספיק כדי להכיל הרקה (לדוגמה, 30 מ מ ומעלה) מתחת לנתח היקף שדה ראייה, למלא אותו עם מספיק פוספט Buffered מלוחים (PBS) כדי לכסות את העצם הטמפורלית (למשל, 0.5-1 מ ל).</li>
	<li>להטביע הרקה עם בולה להסיר את PBS עם החלונות עגולה, סגלגל של שבלול פונה כלפי מעלה. הערה: הסרת שיווי המשקל של שבלול הוא לא הכרחי, כפי שיווי המשקל משמש גם נקודת אחיזה עבור מניפולציה המכוונת תכונות של שבלול (איור 1I ו איור 2B).</li>
	<li>באמצעות זוג מלקחיים ultra-בסדר, להסיר את העורק stapedial, אשר עובר דרך באוזן.</li>
	<li>הוסף עצה אחת של המלקחיים ultra-בסדר דרך הקשת של באוזן שבו העורק עברו, והרם בעדינות באוזן כלפי מעלה. באוזן disarticulated צריך להרים את החלון הסגלגל.</li>
	<li>משתמש קצה אחד של המלקחיים ultra-בסדר, לנקב את האליפסה, בחלונות העגולים.</li>
	<li>שימוש של PBS 1 x מלא 28.5-מד מזרק עם אבובים (הקוטר הפנימי 0.28 מ מ, הקוטר החיצוני 0.61 מ"מ) מצורפים, מקם את הצנרור מעל החלון הסגלגל (איור 2A -B). הערה: הפתיחה של הצינור ניתן לטפל באמצעות מלקחיים ultra-בסדר לסייע להבטיח מיקום מדויק.<ol>
		<li>השתמש מזרק טריים ואת צינורות עבור כל שבלול.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuse 2 מיליליטר 10% אנטיביוטיקה-antimycotic (אנטי-נגד) ו- 10% פניצילין-סטרפטומיצין (עט-דלקת) ב- PBS דרך שבלול מעל 5 דקות כדי להסיר את perilymph. מה קורה מהר מדי עם לחץ רב מדי יגרום נזק המבנים הקנס בתוך שבלול. הערה: נהיגה באופן ידני את המזרק ביד כדי perfuse את הנוזל דרך שבלול הוא יעיל, למרות משאבה זלוף יכול לשמש אלטרנטיבה.<ol>
		<li>אם פרפוזיה באופן ידני, השתמש זוג הקנס, עצמי סגירת מלקחיים לייצב שבלול (איור 2 א) במהלך זלוף על ידי האוחז בחלק שיווי המשקל של העצם הטמפורלית. הערה: למרות שאינך נדרש, זה משאיר שתי ידיים חופשיות להתמודד עם מכשירים; יד אחת יכול להסיע את המזרק (איור 2 א) ואילו השני ניתן למקם את הצנרור כראוי (איור 2B).</li>
		<li>שלב זה קדימה, לטפל כדי למנוע חשיפת שבלול שלא לצורך לשידור. היכרות עם בועות אוויר לתוך שטחים נוזלים יחסום זרימת נוזל ולאחר ייבוש נוסף יגרום נזק המבנים הקנס בתוך שבלול.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>להסיר ולמחוק כל שריר רקמות ועצמות והשריד באמצעות מלקחיים משובחים.</li>
	<li>במידת הצורך, אחסן cochleae מבודדים ב 4 ° C אנטי-אנטי 10%, 10% הפתרון עט-דלקת ב- PBS עד שבעה ימים בשינויים קבועים של פתרון אנטיביוטי כל 48 שעות.</li>
</ol>
2. עיבוד שבלול
<ol>
	<li>Decellularization
	<ol>
		<li>עבור כל שבלול, מילוי בקבוקון נצנוץ 20-מ ל זכוכית עם dodecyl נתרן 1% חומצה גופרתית (מרחביות) פתרון במים מיוננים (DI) אשר משמש כדי decellularize שבלול.</li>
		<li>חותכים את העצה ממני פיפטה פלסטיק 7-mL העברה באמצעות סכין גילוח כך הפתח מספיק גדול עבור שבלול לעבור.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של העברה, בעדינות צייר שבלול לתוך פיפטה כך עובר לקצה ניתוק על ידי כמה מילימטרים.</li>
		<li>לגרש שבלול לתוך המבחנה 1% פתרון מלא נצנוץ מרחביות.</li>
		<li>הפיצו 2 מ של 1% מרחביות במים מיוננים (DI) דרך שבלול בבקבוקון נצנוץ באמצעות פיפטה של העברה.</li>
		<li>למקם את המבחנה נצנוץ מסובב, ולאפשר את המבחנה נצנוץ לסובב במהירות של סל ד 10 במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר.<ol>
			<li>שנה 1% פתרון מרחביות כל 24 שעות ביממה במשך 72 h. . שמור על עצמך בעת שינוי מרחביות לחשוף לעולם לא שבלול לאוויר.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>רחץ שבלול שלוש פעמים במשך 30 דקות כל במים DI.</li></ol></li></ol>לבצע את מנקי בבקבוקון נצנוץ באותו המשמש את ההאשמות מרחביות; בשלב זה, שבלול הוא decellularized.
	
	
	<li>Decalcification
	<ol>
		<li>הסר את יתרת כמות המים DI המבחנה נצנוץ, משאיר מספיק כדי להשאיר שבלול מתחת למים.</li>
		<li>כדי להתחיל decalcification, הוסף 5 מ של 10% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0.02 נקודות ז) במים DI נצנוץ למבחנה המכילה שבלול.</li>
		<li>הפיצו 2 מיליליטר 10% EDTA במים DI דרך שבלול בבקבוקון נצנוץ באמצעות פיפטה של העברה.</li>
		<li>הכנס את המבחנה נצנוץ בחזרה מסובב, ולאפשר את המבחנה נצנוץ לסובב במהירות של סל ד 10 במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר. לשנות את הפתרון EDTA 10% בכל 24 שעות ביממה במשך 72 h. יש להיזהר בעת שינוי פתרונות כך שבלול ואינו חשוף לאוויר.</li>
		<li>לשטוף שבלול 3 פעמים עבור 2 h כל עם PBS 1 x; בשלב זה, שבלול הוא decalcified.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>אחסון
	<ol>
		<li>לאחסן את cochleae עבור עד 72 שעות ב- 10% אנטי-נגד, 10% עט-דלקת פתרון ב- PBS ב 4 º C. הערה: פרקי זמן ממושכים אחסון ייתכן שניתן בשינויים קבועים של פתרון לאנטיביוטיקה; עם זאת, אחסון מורחב של cochleae מעובד לא אומתה ב פרוטוקול זה.</li>
	</ol>
	</li>

3. רכש והרחבה של hWJCs
<ol>
	<li>לבודד hWJCs על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר22. בקצרה, קטע חבל הטבור מיתרי למקטעים של 3 ס מ.</li>
	<li>בזהירות עושים חתך רדוד עם איזמל לאורכו על כל קטע הטבור לפרוש ולחשוף וורטון הטבור. להשתמש מלקחיים כדי להסיר את כלי הדם.</li>
	<li>רחץ הטבור מקטעי פעמיים עם מספיק PBS (למשל, מ 40 ל 60 מ מ פטרי) ומטביעים את הרקמה. דק מינצ מקטעי רקמת עם אזמל. מעכלים רקמת ב- 100 מ מ צלחת פטרי עם 50 מ של עיכול בינוני (0.2% מסוג 2 collagenase, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, בגלוקוז נמוך בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco)).</li>
	<li>מקום רקמות לעכל בינוני על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד לילה ב- 5% CO2, חממה 37 º C. למחרת, לדלל עיכול בינוני ביחס של 1:16 % 2 אנטיביוטיקה-antimycotic ב- PBS, גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g בטמפרטורת החדר (~ 27 ° C) במשך 10 דקות להשליך תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend כדורי ב Mesenchymal תא גזע הצמיחה בינונית (MSCGM) ולשלב מחדש תאים. צלחת תאים על צפיפות של 7 x 103 תאים/cm2 בתרבות רקמה מטופלים T-75 המבחנות. תרבות HWJCs ב MSCGM, להרחיב את המעבר 5 לניסויים. הערה: HWJCs עשוי להיות תת תרבותי לתוך T-מבחנות גדולות יותר (למשל, T-150, T-300) כאשר passaging להגדיל תשואה של hWJCs לניסויים.</li>
</ol>
4. אינפוזיה של hWJCs אל Decellularized Cochleae
<ol>
	<li>להכין decellularized cochleae
	<ol>
		<li>באמצעות הטכניקה aseptic, לשטוף cochleae מאוחסנת ב- PBS 1 x שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד.</li>
		<li>להעביר את cochleae לתוך בארות נפרדים של צלחת 24-ובכן, ולהוסיף 1 מ"ל של 37 ° C מראש חימם MSCGM.</li>
		<li>דגירה cochleae ב 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה לקבוצות של h 1 לפני אינפוזיה של תאים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>מביצועם hWJCs, resuspend
	<ol>
		<li>שטיפת hWJCs עם 37 ° C מראש חימם 1 x PBS פעמיים.</li>
		<li>הוסף מספיק 37 ° C מראש חימם טריפסין עם EDTA 0.5% כדי לכסות את המשטח הקיבול של התא.</li>
		<li>דגירה hWJCs של עד 5 דקות 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה.<ol>
			<li>ודא כי 90% של תאים יש מנותקת השטח התרבות התא על-ידי הצגת תאים תחת מיקרוסקופ הפוכה. הערה: תאים ינוע הכלי תרבות הוא טפח בעדינות, יש להתנתק. תאים דייל, יש אינו מנותק.</li>
			<li>טפח בעדינות את צידי הבקבוק עוד יותר מכך התאים המצורפת.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>באמצעות הטכניקה aseptic, hWJCs העברה מכלי הקיבול תרבות אל צינור חרוטי 50-mL המכילים אמצעי אחסון המקבילה של MSCGM לנפח של טריפסין נהגו מביצועם התאים.</li>
		<li>גלולה של hWJCs על ידי צריך שתוציאו ב 500 g x בטמפרטורת החדר (~ 27 ° C) במשך 5 דקות.</li>
		<li>האחות תגובת שיקוע, resuspend hWJCs של MSCGM-ריכוז של תאים למ"ל 500,000.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuse cochleae
	<ol>
		<li>העברת cochleae צלחת 24-ובכן חדשה באמצעות פיפטה של העברה.</li>
		<li>להוסיף טיפה של MSCGM כל שבלול כדי למנוע כל שבלול ממנו להתייבש.</li>
		<li>בעדינות אוריינט שבלול באמצעות מלקחיים ultra-בסדר, כך החלונות סגלגל ועגול פונות מעלה. הערה: שמור על עצמך קיצוני בעת טיפול ישירות כל שבלול כמו שבלול בקלות יתערער.</li>
		<li>באמצעות מזרק אינסולין 28.5-מד סטרילי עם צינורות מחוברים, צייר עד 0.2 מ"ל resuspended hWJCs (100,000 תאים).</li>
		<li>בעזרת מלקחיים בסדר מעוקר, הצב אבובים החלון הסגלגל.</li>
		<li>בעדינות, לאט לאט perfuse שבלול 0.2 מ של hWJCs resuspended באמצעות מזרק אינסולין 28.5-מד מחובר לצנרת פוליאתילן (הקוטר החיצוני: 0.61 מ מ, קוטר פנימי: 0.28 מ מ) במשך כ 5 דקות.</li>
		<li>לאחר זלוף, להוסיף 0.8 מ של 37 ° C מראש חימם MSCGM את טוב המכיל שבלול להביא את הנפח הכולל בבאר 1 מ"ל.</li>
		<li>חזור על צעדים 4.3.3-4.3.7 עבור כל שבלול, באמצעות מזרק טריים, אבובים בכל פעם.</li>
		<li>הכנס perfused cochleae 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה, ושנה מדיה שלוש פעמים בשבוע.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. שבלול הקציר ושימור
הערה: Cochleae עשוי להיות בתרבית וקצרו בכל נקודת זמן עד 30 ימים שלאחר זלוף.
<ol>
	<li>כדי לשמר את cochleae, לתקן את paraformaldehyde 4% ב- PBS 1 x לילה ב 4 ° C על פלטפורמה נדנדה.</li>
	<li>לאחר קיבוע, לשטוף cochleae עם 1 x PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות.</li>
	<li>בהדרגה מייבשים שבלול עם אתנול, לנקות עם הממס פחמימן אליפטיות לפני הטבעה של פרפין.</li>
	<li>סעיף דגימות עובי של 10 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום הר על זכוכית שקופיות מיקרוסקופ. הערה: הדוגמאות הם עכשיו מוכן היסטולוגית או immunohistochemical עיבוד באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+innervation+of+the+cochlea.">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).</li><li>LeMasurier, M., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-Cell+Mechanotransduction+and+Cochlear+Amplification.">Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification.</a> Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).</li><li>Neal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+counts+in+a+rat+model+of+sound+damage:+Effects+of+tissue+preparation+&amp;+identification+of+regions+of+hair+cell+loss.">Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation &amp; identification of regions of hair cell loss.</a> Hear Res. 328, 120-132 (2015).</li><li>Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+hearing+loss:+a+recreational+noise+perspective.">Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).</li><li>Stucken, E. Z., Hong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+hearing+loss:+an+occupational+medicine+perspective.">Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).</li><li>Dille, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinnitus+onset+rates+from+chemotherapeutic+agents+and+ototoxic+antibiotics:+results+of+a+large+prospective+study.">Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study.</a> J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).</li><li>Sajjadi, H., Paparella, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meniere's+disease.">Meniere's disease.</a> Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).</li><li>House, J. W., Brackmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinnitus:+surgical+treatment.">Tinnitus: surgical treatment.</a> Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure:+evidence+of+a+misspent+youth.">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li><li>Ryals, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+species+differences+in+susceptibility+to+noise+exposure.">Avian species differences in susceptibility to noise exposure.</a> Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).</li><li>Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+inner+ear+sensory+epithelia+from+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).</li><li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+to+the+auditory+nerve+and+cochlear+duct.">Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct.</a> Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).</li><li>Shi, F., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+for+replacement+of+auditory+neurons+by+stem+cells.">Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells.</a> Hear Res. 297, 106-112 (2013).</li><li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+decellularized+cochleae+as+scaffolds+for+inner+ear+tissue+engineering.">Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering.</a> Stem Cell Res Ther. 8, (2017).</li><li>Santi, P. A., Johnson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+ear+tissues+as+scaffolds+for+stem+cell+differentiation.">Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).</li><li>Davies, D., Holley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+alpha+3+and+alpha+6+integrins+in+the+developing+mouse+inner+ear.">Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear.</a> J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).</li><li>Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+extracellular+matrix+in+the+formation+of+the+inner+ear.">Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear.</a> Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).</li><li>Goodyear, R. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrices+associated+with+the+apical+surfaces+of+sensory+epithelia+in+the+inner+ear:+molecular+and+structural+diversity.">Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity.</a> J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).</li><li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+Viability+and+Transfection+Efficiency+with+Human+Umbilical+Cord+Wharton's+Jelly+Cells+Through+Use+of+a+ROCK+Inhibitor.">Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor.</a> Cell Reprogram. , (2014).</li><li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Photo-conversion:+A+second+chance+to+label+unique+cells.">Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells.</a> Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).</li><li>Mitchell, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+cells+from+Wharton's+jelly+form+neurons+and+glia.">Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia.</a> Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).</li><li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+Reprogramming+of+Human+Wharton's+Jelly+Cells+Reveals+Differences+Between+ATOH1+Homologues.">Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues.</a> Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).</li><li>Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+versus+sTSLIM+3D+imaging+of+the+mouse+cochlea.">MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea.</a> J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).</li><li>Nonoyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+ototoxicity+of+gadoteridol+(ProHance)+and+gadodiamide+(Omniscan)+in+mice.">Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice.</a> Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhesus+Cochlear+and+Vestibular+Functions+Are+Preserved+After+Inner+Ear+Injection+of+Saline+Volume+Sufficient+for+Gene+Therapy+Delivery.">Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery.</a> J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).</li><li>Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioactivity+of+cartilage+extracellular+matrix+in+articular+cartilage+regeneration.">The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration.</a> Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בהצלחה הראו כי ניתן להסיר תאים שבלולי יליד שבלול באמצעות תהליך decellularization, מה שמאפשר עבור השימוש של שבלול לגרדום רקמות מורכבות, תלת מימדי. סנטי ואח. 15 פיתח את שיטת הראשוני עבור decellularizing cochleae, במדויק העריכו את אמצעי האחסון של מבנים רבים-שבלולי דרך בעזרת מיקרוסקופ אור גיליון<s...

שבלול הוא מבנה לולייני המורכב נמצאו הרקה. הוא מורכב של המבוך הגרמי החיצוני ואת המבוך membranous קונצנטריים, פנימית1. המבוך membranous מורכב 3 משבצות נוזלים: סקאלה vestibuli, סקאלה מדיה, ו טימפני סקאלה1. התקשורת סקאלה בתים האפיתל חושית, המורכב משילוב של מספר רב של סוגי תאים, אך התאים שיער חושית (HC), אשר מגלי אנרגיה מכנית של גלי קול דחפים עצביים2, הם מעניינים במיוחד. חשיפה טראומה אקוסטית3,4,5, תרופות6,7,המחלה8והזדקנות9 כל יכול לגרום תפקוד לקוי השמיעה דרך המוות HC. איבוד תאים שיער אצל יונקים הוא קבע, בניגוד HCs העופות, אשר יכול להתחדש לאחר פציעה10.
מגוון רחב של מאמצי מחקר עכשווי ביקשו לשחזר HCs אבוד, אף הגישות ניסיוני ספציפיים משתנים. מניפולציה של ביטוי גנים בתוך האפיתל חושית, השתלה של תאי גזע הבדיל מחוץ לגוף הם גישות דומיננטי בתחום, למרות שיטות אינדוקציה שואפים להבדיל תאי גזע לתוך שבלולי organoids היה ניסיון11,12,13. כל הגישות הללו הוא גם מסתמך ישירות על תאי גזע, או התפתחותית הותאם בשימוש בתאי גזע; עם זאת, רגע משותף, שעשוי להיות קריטי, אלמנט זה ה-ECM של שבלול עצמו14,15.
ECM לא רק מספק תמיכה פיזית תאים ורקמות, אשר כולל משטח אדהזיה תא, התפשטות, הישרדות של ההעברה, אך גם ממלא תפקידים חיוניים להתפתחות HCs ומן ספירלה גנגליון15,16 ,17. באופן טבעי ECM המתרחשים מספק אותות אינדוקטיבית להנחות תא בנחישות פנוטיפ ו/או תא אדהזיה התפשטות, הישרדות18. כתוצאה מכך, השימוש של שבלול decellularized בשילוב עם hWJCs בתרבית מציעים הזדמנות ייחודית לגלות את התפקיד של התחדשות ECM ו- HC. HWJCs הם סוג זמינים, נתינת תא מבודד מן האדם חוטי חבל הטבור המתנהגים כמו גזע mesenchymal19. HWJCs הראו את היכולת להבחין תא neurosensory שושלות20,21. לפיכך, בפרוטוקול הנוכחי מפרט את הבידוד, decellularization ו זלוף של cochleae מ- C57BL הגוויות עכבר עם hWJCs עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allegra X-14R Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>B08861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intramedic Semi-Rigid Tubing</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1190-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18155-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB087579B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-100 Insulin Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-341-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-170-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-170-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear-Rite 3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell Growth Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-75 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-150 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-300 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MFA51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% SDS Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for decellularizing mouse cochleae for inner ear tissue engineering

אצל יונקים, תאים שיער mechanosensory המאפשרים שמיעה חוסר היכולת להתחדש, אשר מוגבל טיפולים עבור אובדן שמיעה. אסטרטגיות רפואה רגנרטיבית הנוכחי התמקדו משתילים בתאי גזע או מניפולציה גנטית של סביב תמיכה התאים באוזן הפנימית כדי לעודד החלפה של תאים פגומים גזע כדי לתקן אובדן שמיעה. ובכל זאת, מטריצות (ECM) עשוי לשחק תפקיד חיוני גרימת ושמירה על תפקוד של תאים שיער, לא נבדקה היטב. באמצעות את שבלולי ECM בדומה לפיגום לגדל תאי גזע בוגרים עשויים לספק תובנות ייחודיות איך הרכב ואת הארכיטקטורה של הסביבה חוץ-תאית מסייע תאים הסדירה פונקציה השמיעה. כאן אנו מציגים שיטה אנליטית, decellularizing cochleae של עכברים להשתמש פיגומים מקבל תאי גזע בוגרים perfused. בפרוטוקול הנוכחי, cochleae הם בודדו אותנו מהמתרחש עכברים לאללה, decellularized, decalcified. לאחר מכן, תאים ג'לי האנושי וורטון (hWJCs) הם בודדו אותנו מהמתרחש הטבור היו perfused בזהירות לתוך כל שבלול. Cochleae שימשו ריאקטורים, התאים היו תרבותי עבור 30 ימים לפני שעברו עיבוד לניתוח. Decellularized cochleae נשמרות לזיהוי מבנים חוץ-תאית, אך אינו חושף את הנוכחות של תאים או מורגש שברי DNA. התאים perfused לתוך שבלול פלשו רוב הפנים והחוץ של שבלול, גדלה ללא תקלות משך זמן של 30 ימים. לכן, השיטה הנוכחית ניתן ללמוד איך שבלולי ECM משפיע על התא התפתחות והתנהגות.

באמצעות השיטות המובאות כאן, decellularization מוצלחת של cochleae הוערך על-ידי בדיקת נוכחות או היעדרות של ה-DNA באמצעות 4 אינץ ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. Cochleae נחשבו decellularized באופן מלא אם הדנ א לא זוהה בתוך שבלול decellularized. שבלול יליד מהניסוי הקודם זה לא עברה decellularization או decalcification שימש פקד ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering at JoVE.com

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין שיטה יעילה decellularize, decalcify cochleae העכבר עבור ניצול כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

a-protocol-for-decellularizing-mouse-cochleae-for-inner-ear-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K Views.  University of Kansas Medical Center. המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין שיטה יעילה decellularize, decalcify cochleae העכבר עבור ניצול כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.

Video: A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

ייצור של חומרים בזריקות נגזר ביולוגית של הנדסת רקמות שריר הלב

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

נוהל הנדסה ריאות

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

Encapsulation של cardiomyocytes ב Hydrogel הפיברין עבור הנדסת רקמות לב

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

פרוטוקול להערכה הידרודינמית יחסית של הפולימר שסתום Tri-עלון

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...