תודה לך וילי שמש לקבלת סיוע טכני וד&quot;ר קריס Gellynck על הערות מועילות ושלושה מבקרים האנונימיים על העצה הבונה. עבודה זו מומנה על ידי יוזמת התחדשות השמיעה Sunnybrook

רקמת העכבר הייתה שנקטפו מן Sox2 EGFP -reporter עכברי 12 נשמרו ומורדמים בבהתאם להחלטת מועצה קנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה. 1. Culturing עוברי Cochleae <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) על ידי ערבוב 8.89 מיליליטר של DMEM, 1 מיליליטר של סרום שור העובר (FBS), של 100x תוספת N2 100 μl, ו -10 μl של 10 מ&quot;ג / מיליליטר ציפרופלוקסצין. תוספת מלח הפתרון מאוזן של האנק (HBSS) על ידי ערבוב 495 מיליליטר HBSS עם 5 מיליליטר של HEPES 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מנות תרבות תחתית זכוכית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזרימה למינרית, resuspend 200 מצע תמצית קרום במרתף μl ב 5 מיליליטר DMEM. הכן מנות תרבות תחתית זכוכית בקוטר 35 מ&quot;מ עם 10 בארות מ&quot;מ. פיפטה מצע / DMEM 150 μl למרכזו של כל כוס תחתית צלחת. ניתן להשתמש בכלים אלה לאחר דגירה 40 דקות, או יכולים לאחסן בCO 2 </sub&gt; חממה ב 35 מעלות צלזיוס במשך שבוע לפחות. הערה: זכוכית תחתית מנות משמשות מהסיבות הבאות: כדי להבטיח כי הבסיס של המנה הוא שקוף ומתאים להדמיה, כדי ליצור גם במרכז הצלחת, המאפשרת explants להתיישב באזור הממוקם בקלות ובסופו של דבר כך שלאחר ניסוי המדגם יכול להיות מעובד לimmunostaining וניתוח שלאחר מכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תחנת העבודה וכלים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הספסל הנקי הזרימה למינרית, ולרסס למטה עם 70% EtOH ליצור מרחב עבודה נקי. משרים מלקחיים, כפות, וצלחת שחורה 184 אלסטומר סיליקון (תערובת של אלסטומר 184 סיליקון (10 חלקים), סוכן ריפוי (חלק 1) ואבקת פחם (2.5 גר &#39;)) בEtOH 70%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתחנת העבודה נקייה, עוברי קציר לצורך הניסוי. איסוף עובר מההריון המתאים בקרח HBSS הקר בתוספת 1% HEPES. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע איבר חיצוני או גלוי שידגיםפעילות וכתב לבחון את העוברים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ניאון. לאסוף את העוברים שתערוכת פעילות עיתונאית בקרח HBSS הקר בתוספת HEPES 1% כמו אלה הם הנושא של הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עצמות זמניות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במהירות, תוך שימוש במקור אור מגניב ומלקחיים בסדר, לאסוף את ראשי הגורים. דואג לקליפ בחוליות הצוואר ומתחת ללסת כדי למנוע נזק לעצמות הזמניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בזהירות את הגולגולת. הסר את המוח, לקצץ את החלק הקדמי של הראש, ולהעביר את הגולגולת האחורית לHBSS קרח הטרי הקר בתוספת HEPES% 1 בצלחת נקייה. לנתח בזהירות העצמות הזמניות צורת הבוטן מקפידים לשמור על מערכת שיווי המשקל בטקט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את השבלול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העצמות הזמניות לצלחת מצופה אלסטומר סיליקון השחור בקרח HBSS הקר בתוספת 1% HEPES, להצמיד אזור שיווי המשקל של העצם. הכנס סיכות חרקים בזווית אלכסונית כדי לייצב את העצם הטמפורלית וליצור מקום למלקחיים. נעיצה היא צעד מכריע בתהליך כאילו העצם הטמפורלית מותר לנוע יותר מדי קשה מאוד למסוק שבלול בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הסחוס המקיף את שבלול האוזן. הכנס שן אחד המלקחיים לתוך הסחוס בקצה החיצוני של הבסיס של השבלול וקליפ חור בסחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ דש בצד, להכניס את שן של המלקחיים ובעדינות להפריד את הגג של הצינור מהסחוס. קליפ אופקי לרוחב החלק העליון ואלכסון, והרימו בזהירות מהחלק הקדמי של הקפסולה. הכנס שיניים של המלקחיים בין הסחוס שנותר ואת הצינור בעדינות קליפ מהחלק האחרון. משטח הפסגה של השבלול נחשף עכשיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בבסיס, לתפוס את האזור שבו הגג של הצינור עומד באפיתל השבלול ולפתוח את צינור השבלול. לקלף בעדינות מהגג, זמירהבעת צורך, עד להסרה מוחלטת. חתוך את כל חלקים של קרום שנותר בצד המדיאלי של הצינור. נקה את הצינור של רקמת mesenchymal עודפת ולנתק את הצינור ממערכת שיווי המשקל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות explants: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח explant, משטח עד לומינל, במרכז צלחת תרבות תחתית זכוכית מצופה מצע, בזהירות לצייר את כל הנוזלים ולהשאיר למשך שתי דקות. להוסיף 150 μl בתוספת DMEM הירידה מבחינת לexplant, נזהר שלא להפריע לו. צריך explant לצוף חופשי, למקם מחדש עם מלקחיים, אבל דואג שexplant ישקע לתחתית הצלחת, כך שהוא יכול לצרף המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צלחות זכוכית תחתונה בצלחת פטרי בקוטר 12 סנטימטר עמוקה, עם מנה קטנה של מים סטריליים כדי לשמור על לחות. שים התרבויות לC חממת 35 ° לילה על מנת שexplant לצרף את המצע ולשטח. </li></ol></li></ol> 2. לגור מתאר לעצמיing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר דגימות explant. השתמש במיקרוסקופ סטריאו ניאון כדי להעריך את מצבו של כל שבלול explanted. לבחור רק explants בי הצינור שלם ומחובר לכוס מבסיס לקודקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את החממה ב 35 ° C עם 5% CO 2 לרקמת שבלול התרבות. שים תרבויות למיקרוסקופ החממה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות את DMEM בתוספת ולהחליף עם לפחות 500 μl תקשורת טרי. עבור הדמיה עד 6 ימים, 1-1.5 מיליליטר הוא טוב יותר. במקרים בהם explants הם מחוברים באופן רופף, פיפטה טבעת של תקשורת סביב הקצה של המנה. נוזל נוסף זה יגרום &quot;תא humidified &#39;זעיר מבלי להפריע explant בזמן שהוא ממשיך לצרף למטריצה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, שימוש צירים צלחת מכסה כדי לפתוח את המכסים ואילו במנה נשאר בשלה ראוי במיקרוסקופ אם ריאגנטים צריכים להיות מוחלפים בהפסקות בין אוספי תמונות. כיסויי צלחת צירים לאפשר המכסים להיותנפתח מבלי להפריע דוגמאות או הסרת המנות מההגדרות שלהם. זה שומר את המיקום המדויק שלהם ללוכדים תמונה שלאחר מכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הכלים מזכוכית תחתונה המכילים דגימות מתאימות לבעל צלחת מדגם. מיקרוסקופ בדוגמא זו יש פלטפורמה מסתובבת שמחזיקה שמונה מנות מדגם 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מכסה המנוע הזרימה למינרית להחליף את מכסי פלסטיק עם מכסי זכוכית והכנס את המנות לבעל צלחת מדגם. הנח את בעל צלחת מדגם בתוך מטפל חממה שלא לעקור את explants מהחלק התחתון של המנה או להפריע לתקשורת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את שגרת ההדמיה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על המיקרוסקופ, מנורת UV ומצלמה ופתח את תוכנת ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את הדגימות, לאסוף אזור הדמיה, מטוס של מוקד ולהתאים זמני חשיפה לכל מנה ברצף. בחר המטוס של מוקד תלוי לא רק במבט של explant בעת ההתחלה, אבל אלכך בהתחשב באופן שבו הרקמה תעבור וכמה זמן כמובן הזמן ירוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר ערימת Z שבמרכזו מישור המוקד הנבחר בערוץ הקרינה. הגדר את התדירות ואורך הדגימה לצורך הניסוי. תדירות הדגימה תהיה מוגבלת על ידי הזמן שנדרש כדי לאסוף תמונות, כך זה צריך להיקבע לאחר בחירת שדות מבט והגדרת ערימת Z. במקרה זה דגימה מתקיימת בכל 30 דקות על פני חמישה ימים. משך הניסוי יכול להיות עד 14 יום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור סרט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום תקופת הזמן לשגות לפתוח את קבצי תמונה. במקרה זה תוכנת Metamorph שנפתחה נקודות איסוף רציפות משמשת. פריים אחר פריים לבחור את מישור המוקד הטוב ביותר להצגת אוכלוסיית התא של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת תמונות אלה לקובץ .avi, או לייצא אותם כמונטאז &#39;כדי ליצור סט של תמונות שניתן לפתוח ונותחו בתוכנת עיבוד תמונה או להמרה לפורמה מרובהTS באמצעות תוכנת עיבוד וידאו. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture.">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li><li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+for+canonical+Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea.">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li><li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

ישנן מספר נקודות טכניות לשקול בעת תרבויות הוקמו ובהקמת מיקרוסקופ הזמן לשגות במטרה להדמיה לטווח ארוך. אנו משתמשים במטריצת קרום במרתף כמצע לculturing explants שבלול, אבל המצע צריך להיות מותאם לסוג התא. לדוגמא, לתרבויות עצביות תמונה, זה יכו?...

השבלול של היונקים הוא איבר מורכב הורה מאוד. בעכבר, בין הופעתה של האוזן הפנימית הפרימיטיבית משלפוחית ​​otic ביום E11 והשלמת התכנית התפתחותית בשלבי לידה מוקדמים, גלים רבים של איתות תא ושינויים מתואמים בביטוי גנים יתקיימו. פועל מבסיס לקודקוד צינור השבלול הוא הצליל זיהוי האפיתל חושית, או איבר של קורטי. פיתוח של האיבר של קורטי נשלט להפליא כך שעד סוף הפיתוח, זה יהיה מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים, שלוש שורות של תאי שיער חיצוניים וביניהם חמש שורות של תאי תומכים (שתי שורות של תאי עמוד, שלוש שורות של התאים &#39;Deiters) 1. סטייה מתוצאות סדר המדויקת הזה בירידה בשמיעה, heighlighting חשיבות studye הצטברו בראשית ודפוסים של epithemlium החושי 2. בתרבית במבחנה של coch העכבר העוברילאה היא כלי חיוני בחקר המנגנונים של התפתחות של האיבר של קורטי. טכניקה זו הוקמה בשנת 1974 ובמשך 40 השנים האחרונות, נעשתה שימוש כדי להבהיר רבים מהמנגנונים שבאמצעותם האפיתל החושית מצוינת והאיבר של הקורט הוקמו 3. השבלול הוא איבר מורכב עם תהליכים התפתחותיים דינמיים; מניפולציה עשויה להימשך עוד כשבעה ימים כדי להגשים 1. לדוגמא, בעת הוספת מעכבי 3β GSK לתרבות explant שבלול בE13, תקופת הדגירה האופטימלית להתבונן השפעה חזקה של המתחם היא שישה ימים 4. הדמיה חיה של שבלול הפיתוח מאפשרת חקירת שינויים במורפולוגיה של האיבר של קורטי, שינויים בביטוי גנים, מעקב נודד, מתרבים או למות תאים, וזה מאפשר התבוננות בזמן אמת של התוצאות של סוכני תרופות ושיבוש האיתות מסלולים. עד עכשיו, לחיות הדמיה של השבלולבעיקר שבוצע באמצעות מיקרוסקופ confocal לאזורים קטנים תמונה של האיבר של קורטי על פני תקופות זמן קצרות 5-8, אבל טכניקה זו יש מגבלות בשל כדאיות explant. בהדמיה של ההשפעות של מניפולציות לטווח ארוך יותר על תהליכים ההתפתחותיים איטיים, סביבת ההדמיה היא קריטית. בדרך כלל מערכת הדמיה חיה confocal משתמשת קופסא פלסטיק humidified שיושב על המיקרוסקופ. חום ולחות יכולים לברוח דרך הפערים בתיבה דוגרות במפגש שולחן מיקרוסקופ, דרך חלונות הגישה, דרך פתחי צירים ודרך הפערים סביב חלקים שונים של microscope- כגון אובייקטיבי או מקור האור. זה לא אופטימלי לשמירת explants הבריא יותר מימים או שלוש. אנו מגדירים &quot;מיקרוסקופ חממה &#39;כמיקרוסקופ הפוכה אטומה בתוך CO 2 באינקובטור סטנדרטי, ולא חממה שנבנתה סביב מיקרוסקופ. לשעבר מיקרוסקופ החממהנוטה החיים של הניסוי כזה שלא הדמיה על שניים או שלושה ימים, ניתן הדמיה דגימות לתקופה של עד שבועיים. מיקרוסקופ חממה מספק סביבה מצוינת לצמיחה והתמיינות של תאים, עם הפרעה מינימאלית לexplant תרבויות ותנאים סטנדרטיים מבוקר. במחקרים שיתקיימו במשך ימים רבים זה מקובל לפנות לדגימות הדמיה על בסיס יומי על ידי הוצאתם מהחממה ונשא אותם למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. בעוד גישה זו יכולה לעבוד, הסרת המנות מהחממה גורמת ללחץ על רקמת הפיתוח רגישה. שינויים בחומציות של מדיום התרבית ותנודות טמפרטורה בשל ההסרה מן החממה יכולים לגרום להתפתחות תת אופטימלית ורקמות בריאים. הדמיה באותו האזור באותו מישור המוקד ובאותו כיוון בכל נקודת זמן היא מאוד מאתגרת. על ידי שימוש במערכת אוטומטית בתוך חממה, ניתן לשמור על בריאותרקמה, כדי לאסוף תמונות הנמצאות בנקודתי זמן ולהבטיח כי אותו האזור שנתפס בכל מסגרת. בשנים האחרונות כמה חממות רקמת מיקרוסקופ משולבות פותחו, אלה היו שימושיים לא רק בפרקטיקה קלינית 9 אלא גם בתאי גזע וסרטן מחקר 10,11. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה לחיות לטווח הארוך של explants שבלול עכבר העוברי. אנו משתמשים במערכת מיקרוסקופיה אוטומטית בתוך חממת CO 2 סטנדרטית שיש לו את היכולת ללכוד תמונות של דגימות מרובות בנקודות זמן מוגדר. המערכת מורכבת ממיקרוסקופ הפוך להגדיר בתוך חממה. דגימות ממוקמות בבמה מסתובבת המאפשרת הדמיה של דגימות מרובות בכל נקודת זמן. תאורה, לכידת תמונה, והסיבוב של הבמה נשלטות על ידי מערכת אוטומטית המופעלת באמצעות תוכנת Metamorph. על ידי הגדרה שגרתית הדמיה באמצעות תוכנת ההפעלה אנו יכולים להגדיר ניסוי כדי לרוץ עד TWשבועות o עם התערבות אנושית מינימאלית. בדוגמא זו אנו משתמשים הן שדה הקרינה בהירים להציג צמיחה בקנה מידה גדולה וסידור מחדש של השבלול, ובאופן ספציפי, באזור prosensory. בניסוי זה, cochleae יהיה גזור מעכברי כתב Sox2 EGFP ביום עוברי E13. תרבויות במבחנה תוקמנה ולאחר מכן צילם במשך חמישה ימים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026651</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

כאן אנו מציגים שיטה להדמית הזמן לשגות ארוך טווח של explants שבלול עכבר העוברי בשידור חי. תכנית התפתחותית אחראית על בניית מבנה הורה מאוד, מורכב מתמורת השבלול של יונקים לכעשרה ימים. על מנת ללמוד את השינויים בביטוי הגנים על פני תקופה זו ותגובתם לתרופות או מניפולציה גנטית, הדמיה לטווח ארוך יש צורך. בעבר, הדמיה חיה יש בדרך כלל מוגבלת על ידי יכולת הקיום של רקמת explanted בתא humidified על גבי מיקרוסקופ רגיל. קושי בשמירה על תנאים אופטימליים לצמיחת תרבות בכל קשור ללחות וטמפרטורה יש להציב מגבלות על האורך של ניסויי הדמיה. מיקרוסקופ המשולב בתרבית רקמת חממה שונה מספק סביבה מצוינת להדמיה לטווח ארוכה וחי. בשיטה זו אנו מדגימים כיצד להקים explants שבלול עכבר עוברי וכיצד להשתמש במיקרוסקופ חממה לנהל imagi הזמן לשגותng באמצעות שני שדה בהיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לבחון את התנהגותו של יום עוברי טיפוסי (E) 13 explant שבלול וSox2, סמן של תאי prosensory של השבלול, מעל 5 ימים.

כאן אנו מראים מונטאז &#39;(איור 1) וסרט (איור 2) המדגים כיצד explant שבלול organotypic טיפוסי יגדל אם מצופה על E13.5. עכבר כתב Sox2 שימש כדי להמחיש את אזור prosensory. הסרט ממחיש כי השבלול עובר צמיחה והתכנסות וסיומת, לא נראים התאים באזור הלטרלי של תחום Sox2 הירוק לחל...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Views.  Sunnybrook Research Institute.  הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים. 

Video: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

לטווח ארוך התנהגות מעקב של Freely בריכה בחולשת דגים חשמליים

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

דור ותחזוקה לטווח ארוך של עצבים ללא<em&gt; הידרה</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

הקונפליקט חושי לטווח ארוך באופן חופשי להתנהג עכברים

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...