현재 프로젝트 개념 펀드의 캔자스의 대학 증거에 의해 투자 되었다. 우리는 cochleae 문화 지원에 대 한 인간의 탯, 그리고 데이비드 조 젠 슨은 취득에 우리 위한 KUMC (캔사스 시, KS)에서 간호 직원을 감사 하 고 싶습니다.

동물 안락사를 포함 하 여 모든 절차는 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 프로토콜 (ACUP #2014-2234) 캔자스의 대학 의료 센터 (KUMC)에 따라 실시 했다.
참고: HWJCs 동의 제공 하는 환자에 의해 기증 된 인간 탯 으로부터 격리 되었고 표본 캔자스의 대학 인간 주제 위원회 (구 IRB #15402)에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 사용 했다.
1. 측 뼈 수확과 달팽이 관 절연
<ol>
	<li>수술가 위, 날카로운 쌍 두개골과 첫 번째 자 궁 경부 척추 사이 절단 하 여 적절 하 게 안락사, 15 주 된 마우스를 목을 벨 다음 스프레이로 소독 (그림 1A) 70% 에탄올과 머리.</li>
	<li>(그림 1B-C, 파선) 수술가 위 같은 날카로운 쌍을 사용 하 여 중간에 화살 평면에서 두개골 이등분</li>
	<li>(그림 1D, 화살촉) 집게의 쌍을 사용 하 여 두개골에서 뇌 조직을 제거 합니다.</li>
	<li>청각의 존재 및 두개골 및 외관 (1 층 그림, 화살표)에서 외가도의 내부에 vestibular 신경 뿌리 (그림 1E-F, 화살촉) 통해 측 뼈를 식별 합니다. 측 뼈 두개골 (그림 1G)의 나머지에서 분리 두개골을 통해 조심 스럽게 잘라. 참고: 어떤 경우에, 그것 가능 할지도 모른다 섬세 하 게 절단 하지 않고도 측 뼈에서 두개골의 주변 뼈를.</li>
	<li>그래서 팁 달팽이 puncturing 위험 하지 않습니다 약 5 m m (그림 1 H), 외가도의 개통으로 미세 집게를 삽입 합니다. 부드럽게 깨 물집 (그림 1 H, 상단 빨간색 음영 처리 된 영역)의 뼈 그래서 그것 골절 (1I 그림, 빨간 점선 라인). 참고: 필요한 경우, 해 부 현미경 수 있습니다 원조이 과정에서 정확 하 게 배치 하 고 악기의 조작.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여, 놀 리 려 멀리 측 뼈, 뼈 미로 달팽이 관 (그림 1J, 빨간 괄호)의 노출에서 물집의 나머지.</li>
	<li>페 트리 접시 측 뼈를 충분히 큰 장소 (예를 들어, 30 m m 이상)는 해 부 아래 시야 범위와 함께 충분 한 인산 염 버퍼링 염 분 (PBS) 측 뼈 (예를 들어, 0.5 ~ 1 mL)를 작성.</li>
	<li>향하도록 하는 달팽이 관의 타원형과 둥근 창문이 PBS에 제거 물집과 측 뼈를 잠수함. 참고: 달팽이 관에서 vestibular 시스템의 제거 필요는 없습니다,로 vestibular 시스템 역할 잘 조작 하 고 방향을 (1I 그림 및 그림 2B) 달팽이 관의 기능에 대 한 핸들.</li>
	<li>집게의 초 미세 쌍을 사용 하는 등골을 통과 stapedial 동맥을 제거 합니다.</li>
	<li>어디 동맥을 통과 하는 등골의 아치를 통해 초 미세 집게의 한 끝을 삽입 하 고 섬세 하 게 위쪽으로 등골을 리프트. Disarticulated 등골 타원형 창에서 리프트 해야 합니다.</li>
	<li>초 미세 집게의 한 팁을 사용 하 여 타원형 펑크 및 windows를 둥근.</li>
	<li>튜빙 28.5 게이지 주사기 가득 1 x PBS를 사용 하 여 (내부 직경 0.28 m m, 외경 0.61 m m) 타원형 창 튜브를 놓고, (그림 2A -B). 참고: 튜브의 오프닝 조작할 수 있습니다 정확 하 게 배치 되도록 돕는 초 미세 집게를 사용 하 여.<ol>
		<li>신선한 주사기와 튜브를 사용 하 여 각 달팽이 관에 대 한.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10% 항생제 antimycotic (방지) 및 10% 페니실린-스 (펜-strep) PBS에 5 분 이상 달팽이 관을 통해 제거 하는 perilymph의 2 개 mL perfuse 너무 빨리 너무 많은 압력으로 perfusing는 달팽이 관 내의 미세 구조 손상 것입니다. 참고: 수동으로 perfuse 달팽이 관을 통해 액체를 손으로 주사기 운전은 효과적 이다, 관류 펌프 대신으로 사용 될 수 있지만.<ol>
		<li>수동으로 perfusing, 자동 폐쇄 달팽이 관 (그림 2A) 안정 집게 관류 동안 측 뼈의 vestibular 부분을 파악,의 쌍을 사용 합니다. 참고: 필요 하지 않지만 이것은 두 손을 자유롭게 처리 계기; 다른 튜브를 배치할 수 있습니다 하는 동안 한 손으로 주사기 (그림 2A)를 구동할 수 있다 적절 하 게 (그림 2B).</li>
		<li>이 단계에서 앞으로, 공기에 불필요 하 게 달팽이 관을 노출 하지 않도록 주의. 유체 순환 차단 유체 공간으로 기포를 도입 하 고 달팽이 관 내의 미세 구조 손상 더 밖으로 건조.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>제거 하 고 미세 집게를 사용 하 여 하 모든 나머지 근육 조직과 뼈 파편을 삭제.</li>
	<li>필요한 경우, 최대 7 일간 항생제 솔루션 모든 48 h의 일정 변경에 대 한 10% 방지와 PBS에서 10% 펜 strep 솔루션에 4 ° C에서 고립 된 cochleae를 저장 합니다.</li>
</ol>
2. 인공 처리
<ol>
	<li>Decellularization
	<ol>
		<li>각 달팽이 관에 대 한 채우기 20 mL 유리 섬광 유리병으로 1% 나트륨 라우릴 황산 드 이온된 (DI) 수, 달팽이 관을 decellularize 하는 데 사용 되는에 (SDS) 솔루션.</li>
		<li>개통은 달팽이 관 통과를 위해 충분히 큰 되도록 면도날을 사용 하 여 플라스틱 7 mL 전송 피 펫의 끝을 잘라.</li>
		<li>전송 피 펫을 사용 하 여, 부드럽게 그릴 달팽이 관 피펫으로에 그래서 그것은 단지 몇 밀리미터에 의해 잘라 가장자리를 전달.</li>
		<li>1 %SDS 솔루션 가득 섬광 유리병에 달팽이 관을 추방.</li>
		<li>전송 피 펫을 사용 하 여 섬광 유리병에 달팽이 관을 통해 드 이온된 (DI) 수에서 1 %SDS 2 개 mL를 순환.</li>
		<li>회전으로 섬광 유리병을 놓고 실내 온도에서 72 h에 대 한 10 rpm 회전 섬광 유리병을 허용 합니다.<ol>
			<li>1 %SDS 솔루션 마다 24 h 72 h 동안 변경 합니다. 결코 공기에 달팽이 관을 노출 하는 SDS를 변경할 때 주의 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>디 물으로 30 분 각각에 대 한 세 번 달팽이 관을 세척.</li></ol></li></ol>SDS 요금; 사용 같은 섬광 유리병에는 세척을 수행 이 단계에서 달팽이 관은 decellularized입니다.
	
	
	<li>Decalcification
	<ol>
		<li>충분히 빠져들 달팽이 관을 계속 떠나 섬광 유리병에서 나머지 디 물을 제거 합니다.</li>
		<li>Decalcification를 하려면, 달팽이 관을 포함 하는 섬광 유리병에 디 물에 10 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (0.02 M)의 5 mL을 추가 합니다.</li>
		<li>전송 피 펫을 사용 하 여 섬광 유리병에 달팽이 관을 통해 디 물에 10 %EDTA 2 개 mL를 순환.</li>
		<li>회전에 다시 섬광 유리병을 놓고 실 온에서 72 h에 대 한 10 rpm 회전 섬광 유리병을 허용 합니다. 10 %EDTA 솔루션 마다 24 h 72 h 동안 변경 합니다. 달팽이 관은 공기에 노출 되지 않습니다 있도록 솔루션을 변경할 때 주의 합니다.</li>
		<li>2 h 각 1 x PBS;에 대 한 3 번 달팽이 린스 이 단계에서 달팽이 관은 석.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>스토리지
	<ol>
		<li>10% 방지, 10% 펜 strep 솔루션에 PBS에서 4 ° c.에 최대 72 h에 대 한 cochleae를 저장 참고: 긴 저장 기간 항생제 솔루션;의 일정 변경 가능 있을 수 있습니다. 그러나, 처리 된 cochleae의 확장된 저장이이 프로토콜에서 검증 되지 않았습니다.</li>
	</ol>
	</li>

3. 조달 및 hWJCs의 확장
<ol>
	<li>이전에 게시 프로토콜22에 따라 hWJCs를 격리 합니다. 간단히, 3 cm 섹션으로 탯 세그먼트.</li>
	<li>조심 스럽게 만들 메스로 절 개를 얕은 세로 각 탯 선분을 풀 튼의 젤리 탯의 노출에. 집게를 사용 하 여 혈관을 제거.</li>
	<li>조직 잠수함 탯 세그먼트 (예를 들어, 60 mm 페 트리 접시에에서 40 mL) 충분 한 PBS로 두 번 씻는 다. 가늘게 조직 세그먼트 메스를 말하다. 다이제스트 100 mm 페 트리 접시 소화 매체의 50 mL와 조직 (0.2 %2 형 콜라, 1% 페니실린-스, 낮은 혈당에서 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)).</li>
	<li>소화는 5% CO2, 37 ° C 배양 기에서 1 박 50 rpm에서 궤도 통에 중간에 티슈를 놓습니다. 다음 날, 소화 매체 2% 항생제-PBS에서 antimycotic에 1시 16분의 비율로 희석 하 고 실 온에서 500 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 (~ 27 ° C) 10 분 삭제 상쾌한에 대 한.</li>
	<li>Resuspend 펠 릿 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSCGM)에서 하 고 세포를 재결합. 조직 문화에 7 x 103 셀/c m2 의 조밀도에 접시 셀 T-75 플라스 크 취급. MSCGM에서 HWJCs 문화 한 통로 5 실험을 확장 합니다. 참고: HWJCs 수 수 하위 양식 큰 T-플라스 크로 (예를 들어, T-150, T-300) 실험에 대 한 hWJCs의 수확량 증가를 뿌리고 때.</li>
</ol>
4입니다. Decellularized Cochleae에 hWJCs의 주입
<ol>
	<li>Decellularized cochleae을 준비
	<ol>
		<li>무 균 기술을 사용 하 여, 3 시간 30 분 대 한 1 x PBS에 저장된 cochleae 세척.</li>
		<li>Cochleae 24-잘 접시의 별도 우물으로 전송 하 고 37 ° C의 1 mL를 추가 MSCGM를 미리 예 열.</li>
		<li>Cochleae는 5% CO2, 세포의 주입 하기 전에 1 h의 최소 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서에서 품 어.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>해리 hWJCs 및 resuspend
	<ol>
		<li>37 ° c 워시 hWJCs 전 두 번 1 x PBS를 따뜻하게합니다.</li>
		<li>37 ° c 충분 한 사전 예 열 셀 선박 표면에 0.5 %EDTA 트립 신.</li>
		<li>HWJCs는 5% CO2, 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서에서 최대 5 분을 품 어.<ol>
			<li>세포의 90%는 거꾸로 현미경 세포를 확인 하 여 세포 문화 표면에서 분리 된 확인 합니다. 참고: 때 문화 배 도청 부드럽게 이동 하는 셀 분리 했습니다. 셀 고정, 남아 있는 분리 하지 있다.</li>
			<li>부드럽게 연결 된 셀을 더 꺼내 려 플라스 크의 측면을 누릅니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>무 균 기술을 사용 하 여, 해당 볼륨 MSCGM의 Trypsin의 볼륨을 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 문화 선박에서 전송 hWJCs는 세포 분열을 사용.</li>
		<li>실 온에서 500 x g에서 centrifuging 여는 hWJCs 작은 (~ 27 ° C) 5 분.</li>
		<li>상쾌한, 발음 하 고 500, 000 셀/mL의 농도에서 MSCGM에 hWJCs를 resuspend.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cochleae perfuse
	<ol>
		<li>Cochleae 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 24-잘 접시에 전송 합니다.</li>
		<li>어떤 달팽이 관 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 각 달팽이 관에 MSCGM의 한 방울을 추가 합니다.</li>
		<li>섬세 하 게 타원형과 둥근 창문을 향하도록 하 초 미세 집게를 사용 하 여 달팽이 관을 방향을 정하십시오. 참고: 주의 극단적인 달팽이 관 손상 쉽게 각 달팽이 관을 직접 처리 하는 경우.</li>
		<li>살 균 28.5 게이지 인슐린 주사기를 사용 하 여 연결 된 튜빙, 0.2 mL resuspended hWJCs (100000 셀)를 그립니다.</li>
		<li>멸 균된 미세 집게를 사용 하 여 케이블의 튜빙을 타원형 창에 놓으십시오.</li>
		<li>섬세 하 게 그리고 천천히 perfuse 폴 리 에틸렌 튜브에 연결 28.5 게이지 인슐린 주사기를 사용 하 여 resuspended hWJCs의 0.2 mL와 달팽이 관 (외경: 0.61 m m, 내경: 0.28 m m) 약 5 분 이상.</li>
		<li>관류, 후 37 ° C의 0.8 mL를 추가할 필요는 잘 포함 하는 잘에서 1 mL 전체 볼륨을가지고 달팽이 관에 MSCGM를 미리 따뜻하게.</li>
		<li>각 달팽이 관, 신선한 주사기를 사용 하 고 각 시간을 튜브에 대 한 4.3.3-4.3.7 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>5% CO2, 37 ° C 세포 문화 인큐베이터, 끼얹는다 cochleae를 놓고 미디어 주 당 3 시간을 변경 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 달팽이 수확 및 보존
참고: Cochleae 그리고 경작 수 있습니다 최대 30 일 후 관류 시간 언제 든 지 수확.
<ol>
	<li>Cochleae를 유지 하려면 1 x PBS 락 플랫폼에 4 ° C에서 하룻밤에 4 %paraformaldehyde 수정 했다.</li>
	<li>고정, 후 5 분에 대 한 세 번 1 x PBS 가진 cochleae 세척.</li>
	<li>점차적으로 에탄올과 달팽이 관을 탈수 하 고 파라핀에 포함 하기 전에 지방 족 탄화수소 용 매로 취소 합니다.</li>
	<li>에 톰 및 마운트를 사용 하 여 10 µ m의 두께로 섹션 샘플 현미경 슬라이드 유리. 참고: 샘플 준비가 이제 조직학 immunohistochemical 처리 표준 프로토콜을 사용 하 여 또는.</li>
</ol>

<ol>
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J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioactivity+of+cartilage+extracellular+matrix+in+articular+cartilage+regeneration.">The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration.</a> Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

우리는 성공적으로 복잡 한 3 차원 조직 발판으로 달팽이 관의 사용을 허용 하는 decellularization 과정을 통해 달팽이 관에서 네이티브 인공 세포를 제거할 수 있습니다 시연 했다. 산 티 외. 15 decellularizing cochleae에 대 한 초기 방법을 개발 하 고 정확 하 게 빛 시트 현미경23의 도움으로 많은 인공 구조를 통해 볼륨 견적 했다. 이러한 초기 작업 조직 엔지니어?...

달팽이 관은 측 뼈에서 발견 하는 복잡 한 나선형 구조. 그것은 외부 뼈 미로 동심, 내부 membranous 미로1로 구성. Membranous 미로 3 유체 공간 구성: 스칼라 vestibuli, 스칼라 언론과 Scala tympani1. 스칼라 미디어 하우스 수많은 종류의 세포로 구성 되어, 감각 상피, 하지만 감각 머리 세포 (HC), 신경 충 동2음파 기계적 에너지 transduce는 특정 관심의. 음향 외상3,,45, 약6, 질병7,8, 및 노화9 노출 모두 HC 죽음 통해 장애인된 청각 기능 발생할 수 있습니다. 포유류에서 머리 세포 손실 부상10후 재생성 수 조류 HCs 달리 영구적 이다.
다양 한 현대 연구 노력 하고자 했다 손실된 HCs 복원 특정 실험적인 접근 다르지만. 감각 상피에 유전자 발현의 조작 및 몸 밖에 서 분화 하는 줄기 세포의 주입은 필드에서 지배적인 접근 인공 organoids로 줄기 세포를 분화 하는 유도 방법 있다 지만 시도11,,1213. 이 방법의 각각은 줄기 세포 나 줄기 세포; 사용 발달 큐에 직접 의존 그러나, 두 번째 공유 하 고 잠재적으로 중요 한 요소는 달팽이 관 자체의 ECM14,15.
ECM 뿐만 아니라 세포와 조직, 세포 접착, 확산, 생존, 및 마이그레이션에 대 한 서피스를 포함 하지만 또한 HCs와 나선형 ganglion15,16의 개발에 중요 한 역할에 대 한 물리적 지원 제공 ,17. 자연스럽 게 발생 ECM는 세포 표현 형 결정 및 세포 접착, 확산, 그리고 생존18가이드 수 유도 신호를 제공 합니다. 따라서, 교양된 hWJCs와 함께에서 decellularized 달팽이 관의 사용 ECM HC 재생의 역할을 탐구 하는 독특한 기회를 제공 합니다. HWJCs는 중간 엽 줄기 세포19처럼 인간의 탯에서 고립 된 쉽게 사용할 수, 비 논란이 셀 유형입니다. HWJCs는 neurosensory 세포 계보20,21아래로 차별 하는 능력을 보여주었다. 따라서, 현재 프로토콜 절연, decellularization, 및 cochleae 내가 조직 공학에 대 한 hWJCs와 C57BL 마우스 시체에서의 관류 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Allegra X-14R Centrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Semi-Rigid Tubing</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>50-mL Conical Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>U-100 Insulin Syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation Vial</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Mesenchymal Stem Cell Growth Medium</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 Culture Flask</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-150 Culture Flask</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-300 Culture Flask</td><td>MidSci</td><td>TP90301</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>1% SDS Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for decellularizing mouse cochleae for inner ear tissue engineering

포유류에서 청각 부족을 재생성 하는 기능을 촉진 하는 mechanosensory 세포는 청력 손실에 대 한 치료를 제한 했다. 현재 재생 의학 전략 이식 줄기 세포 또는 주변 청각 상실을 해결 하기 위해 손상 된 줄기 세포의 교체를 장려 하는 내가 지원 세포의 유전자 조작에 집중 했다. 그러나, 기질 (ECM) 유도 하 고 세포의 기능 유지에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 그리고 잘 조사 하지. 인공 와우를 사용 하 여 성체 줄기 세포를 성장 하는 발판으로 ECM 어떻게 구성 및 extracellular 환경 아키텍처 셀에 에이즈 청력 기능을 유지 하는 독특한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 우리는 분리 하 고 건설 기계 성인 줄기 세포 끼얹는다 수락으로 사용 하는 마우스에서 cochleae를 decellularizing 하는 방법을 제시. 현재 프로토콜에서 cochleae 안락사 쥐, decellularized, 그리고 석 으로부터 격리 됩니다. 그 후, 탯 줄에서 고립 된 인간의 튼 젤리 셀 (hWJCs) 각 달팽이 관에 끼얹는다 신중 하 게 했다. cochleae 생물 반응 기, 사용 하 고 셀 분석에 대 한 처리를 진행 하기 전에 30 일 동안 배양 되었다. Decellularized cochleae 식별 extracellular 구조를 유지 하지만 DNA의 현저한 조각 또는 셀의 존재를 공개 하지 않았다. 셀 달팽이 관에 끼얹는다 인테리어와 달팽이 관의 외관의 대부분을 침공 하 고 30 일의 기간 동안 사고 없이 성장 했다. 따라서, 현재 방법 어떻게 인공 ECM에 영향을 미치는 세포 발달 및 행동 연구를 사용할 수 있습니다.

여기에 제시 하는 방법을 사용 하 여, cochleae의 성공적인 decellularization 4'를 통해 DNA의 유무를 검사 하 여 평가 했다 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩. Cochleae는 DNA 이었다 decellularized 달팽이 관 내에서 확인 되지 않는 경우 완전히 decellularized로 간주 됐다. Decellularization 또는 decalcification을 받을 하지 않았다 이전 실험에서 네이티브 달팽이 관 구조와 전통적으로 C57BL 마우스 달팽...

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A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

내가 조직 공학에 대 한 마우스 Cochleae Decellularizing에 대 한 프로토콜

이 프로토콜의 목표 decellularize 알려줍니다 마우스 cochleae 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 공중 발판으로 이용 하는 효과적인 방법 설명 하는 것입니다.

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K 조회수.  University of Kansas Medical Center. 이 프로토콜의 목표 decellularize 알려줍니다 마우스 cochleae 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 공중 발판으로 이용 하는 효과적인 방법 설명 하는 것입니다.

비디오: A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

연구

발생학

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

신경과학

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

의학

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

냉동 절제 및 면역 염색 마우스 내이 조직: 배아에서 성체 단계까지

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET remain unknown. Electrophysiological studies of hair cells revealed that the MET channel has a large conductance and is permeable to relatively large fluorescent cationic molecules, including some styryl dyes and Texas Red-labeled aminoglycoside antibiotics. In this protocol, we describe a method to visualize and evaluate the uptake of fluorescent dextrans in hair cells of the organ of Corti explants that can be used to assay for functional MET channels. We found that 3 kDa Texas Red-labeled dextran specifically labels functional auditory hair cells after 1&#8211;2 h incubation. In particular, 3 kDa dextran labels the two shorter stereocilia rows and accumulates in the cell body in a diffuse pattern when functional MET channels are present. An additional vesicle-like pattern of labeling was observed in the cell body of hair cells and surrounding supporting cells. Our data suggest that 3 kDa Texas-Red dextran can be used to visualize and study two pathways for cellular dye uptake; a hair cell-specific entry route through functional MET channels and endocytosis, a pattern also available to larger dextran.

Here, we present a method for visualizing the uptake of 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditory hair cells with functional mechanotransduction channels. In addition, dextrans of 3&#8211;10 kDa can be used to study endocytosis in hair and supporting cells of the organ of Corti.

라이브 및 기능성 뮤린 달팽이관 모발 세포의 덱젠 라벨링 및 섭취량

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

생체공학

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

마우스 내부 귀를 대상으로 약물 전달 방법의 비교 연구 : Bullostomy<em&gt; 대</em&gt; Transtympanic 주입

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

생물학

Extracting the Cochlea from a Human Temporal Bone: A Cadaveric Protocol

The extraction of the cochlea from a cadaver human temporal bone may be required for different studies of the inner ear. For histological evaluations, the inner ear must be extracted from the temporal bone to facilitate histologic processing; likewise, some micro-computed tomography devices are too small to accommodate the complete temporal bones; additionally, the image quality can be enhanced when the cochlea is isolated.
The inner ear is located within the petrous part of the temporal bone. The inner ear can be divided into the osseous labyrinth or otic capsule and the membranous labyrinth inside the otic capsule. Furthermore, the inner ear can be divided into the vestibular system (the semicircular canals and the vestibule) and the cochlea. The appreciation of the location and orientation of the cochlea within the temporal bone is difficult, as it is embedded within bony structures and thus cannot be directly visualized. Nevertheless, there are distinct anatomical structures that can help guide the process to allow a reliable drill-out of the cochlea. The landmarks in the posterior parts of the cochlea are the facial nerve, semicircular canals, and the vestibule. In the middle, the inferior borders of the cochlea are identified by the round window and the basal turn of the cochlea. In the anterior border, one encounters the carotid artery; the landmark for the superior border is the genicular ganglion (GG) of the facial nerve. The medial structures are determined by the locations of the internal auditory canal, the superior semicircular canal, and the canal of the internal carotid artery.
In this article, we present a method for extracting the cochlea reliably out of the temporal bone by drill-out while following several anatomical landmarks.

<meta charset="utf8"></head><body>인간의 측두골에서 달팽이관 추출: 시체 프로토콜

This article presents a reliable method for extracting the human cochlea from the cadaver temporal bone by drill-out while following distinct anatomical landmarks.

인간의 측두골에서 달팽이관 추출: 시체 프로토콜

The extraction of the cochlea from a cadaver human temporal bone may be required for different studies of the inner ear. For histological evaluations, the ...