עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (NIMHD-G12MD007581) דרך RCMI-המרכז לבריאות הסביבה ג'קסון סטייט, ארה ב. משרד הביטחון, בפרס Idea 11-1-0205.

הערה: פרוטוקול זה המתואר מקארדל. et al. 11. ציר זמן מסופק באיור1.
1. הכנת לוח תרבות
<ol><li>לשטוף את המנה 35 מ מ תרבות המכילה זכוכית 10 מ מתחתון עם 1 מ"ל של 1 מ' חומצת מימן כלורי (HCl) למשך 15 דקות להוריד את hydrophobicity של הזכוכית-התחתון.</li>
	<li>לשטוף את הצלחת תרבות פעמיים עם 1 מ ל תמיסת מאגר פוספט (PBS) כדי להיפטר כל HCl.</li>
	<li>לשטוף את הצלחת תרבות פעמיים עם 1 מ"ל אתנול 70%.</li>
	<li>לשטוף לצלחת תרבות עם 1 מ"ל של המדיום התרבות תאים ספציפיים (כאן, α שימוש-בתוספת 10% חום MEM להשבית FBS וחומצות אמינו שאינן הכרחיות 1%). הערה: ניתן לאחסן את הצלחת תרבות שטופלו המכיל המדיום תרבות בחממה2 CO עם מכשיר לחות ב 37 ° C עד למחרת.</li>
	<li>לגדול התאים (MSCs ו- MCF-7 תרבות משותפת) בתחתית הכוס שטופלו טוב של המנה תרבות 35 מ מ 100% confluency. שיתוף התרבות תאים MSC 35,000, 75,000 MCF7 תאים עבור 24 שעות.</li>
</ol>2. הכנה של הג'ל קולגן
<ol><li>אחסן את העצות micropipette משמש pipetting את הג'ל קולגן במקפיא כדי למנוע את פלמור של הקולגן לאחר יצירת קשר. הערה: זהו השלב הקריטי ביותר.</li>
	<li>לקבוע אמצעי אחסון של קולגן זנב עכבר כדי לשמש מבוסס על הריכוז של המניה קולגן. היכונו µL 100 של קולגן ג'ל זה וזמינותו. הערה: ריכוז גבוה של קולגן זנב העכברוש אני מדמין עובד יותר טוב... קבע את עוצמת הקול של 10 x בינוני ששינה הנשר של Dulbecco כדי לשמש כדי לדלל את הקולגן בהתאם.</li>
	<li>לשלב על הקרח עכברוש הזנב קולגן אני (3.8 µg/mL במלאי), ששינה הנשר של Dulbecco x 10 בינוני 1 x תא תרבות בינוני בתוספת 2% סרום שור עוברית, את chemoattractant המתאים כדי ריכוז סופי של קולגן של 2.4 mg/mL.</li>
	<li>להוסיף התערובת 4.5% של סודיום ביקרבונט פתרון כדי לנטרל את הג'ל קולגן. הערה: הנפח של הפתרון סודיום ביקרבונט הוסיף עשויות להשתנות בהתבסס על רמת ה-pH המדויק של ריאגנטים אחרים. מומלץ לבחון את התערובת עם חומציות להבטיח פתרון נייטרלי, או להשתמש מחוון ה-pH בטווח הבינוני תרבות.</li>
	<li>שכבה µL 80 של תערובת קולגן מעל התאים בתוך הזכוכית-התחתון טוב של המנה תרבות.</li>
	<li>לאפשר את הג'ל קולגן פולימריזציה למשך 30 דקות ב- חממה2 CO עם מכשיר לחות ב 37 º C.</li>
	<li>מכסה את הג'ל קולגן עם 2 מיליליטר תא בינוני עם מופחת סרום (2%), דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO עם מכשיר אדים 24, 48 או 72 h. התראה: הצלחת שצריך לנהוג בזהירות כדי למנוע את הג'ל קולגן מתנתקת מהחלק התחתון זכוכית.</li>
</ol>3. דוגמה הכנה של קולגן ג'ל באמצעות קולגן זנב העכברוש מלאי של 3.8 µg /mL
<ol><li>על קרח, לשלב 114.5 µL של קולגן זנב החולדה, 16.6 µL של 10 x DMEM, µL 33.1 של תרבות בינוני המכיל את chemoattractant.</li>
	<li>לנטרל את התערובת קולגן עם µL 14.0 של סודיום ביקרבונט.</li>
	<li>המשך כמו שלב 2.5.</li>
</ol>4. הדמיה של תאים
<ol><li>הסר בעדינות את המדיה מתוך קערה.</li>
	<li>יש לשטוף בעדינות את הג'ל עם 1 מ"ל ל- PBS.</li>
	<li>לתקן את התאים עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde למשך 15 דקות.</li>
	<li>לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל ל- PBS.</li>
	<li>כתם התאים עם פתרון דאפי (100 ng/mL) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>תמונה התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי במקומות שונים ולקחת 400 תמונות z-מחסנית מיקרומטר של כל מיקום 16 שלבים מיקרומטר. המיקרוסקופ משמש יש דיסק סריקה יחידה המאפשרת הדמיה קונאפוקלית באמצעות של אור לבן, מקור עירור קשת. השתמש עדשה X 20 מנוצל עם מספרי הצמצם של 0.75.</li>
	<li>לשקם תמונות.<ol>
<li>לפתוח תמונות עבור ג'ל נתון (כ 25 תמונות) וליצור אוסף תמונות על ידי לחיצה על תמונה ← ערימות ← תמונות לערום. התמונה הראשונה התכתב לתחתית של הג'ל (z = 0 מיקרומטר), התמונה השניה תאמו הצעד הראשון בכיוון z (z = 16 מיקרומטר), בתמונה השלישית התכתב לשלב השני בכיוון z (z = מיקרומטר 32). להעריך כל גרעין בעומק התמונה כל ולייעד את העומק שבו הגרעין היה בפוקוס החדה כמו עומק חדירה לתא מסוים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedl, P., Brocker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+cell+locomotion+within+three-dimensional+extracellular+matric.">The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).</li><li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+architecture:+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function.">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li><li>Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing,+a+comparison+of+image-based+readout+methods.">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration:+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis.">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).</li><li>Sahai, E., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differing+modes+of+tumour+cell+invasion+have+distinct+requirements+for+Rho/ROCK+signalling+and+extracellular+proteolysis.">Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis.</a> Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).</li><li>Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+circular+invasion+assay+mimics+in+vivo+invasive+behavior+of+cancer+cell+lines+and+distinguishes+single-cell+motility+in+vitro.">A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro.</a> BMC Cancer. 8, 198 (2008).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).</li><li>Poujade, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound.">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).</li><li>Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+cancer+cell+fusion:+a+mechanism+of+breast+cancer+metastasis.">Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis.</a> FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).</li><li>McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vitro+Inverted+Vertical+Invasion+Assay+to+Avoid+Manipulation+of+Rare+or+Sensitive+Cell+Types.">An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types.</a> J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).</li><li>Noubissi, F. K., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Cell+Fusion:+Mechanisms+Slowly+Unravel.">Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li><li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+in+microfluidic+systems.">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).</li><li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+migration+in+three+dimensions.">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li><li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate.">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat Materials. 13, 645-652 (2014).</li></ol>

המחברים הכריזו כי אין עניין מתחרים קיימים.

כאן, אנו מתארים וזמינותו פשוט הפוך הפלישה אנכי אשר נוח עבור מגוון רחב של סוגי תאים כולל תאים שהם נדירים ו/או תלויים microenvironment שלהם. זה assay הפלישה תלת-ממד, תאים נשארים microenvironment המקורי שלהם, מכוסים על ידי הג'ל קולגן המכיל של chemoattractant. לאחר מכן, התאים נודדים, לפלוש ב הקולגן. זה assay, התאים יכולים להי?...

תא תנועתיות הוא תהליך התפתחותי פיזיולוגי נורמלי של תאים. עם זאת, שינויים התבנית ואת היכולת של תאים נודדים ולאחר לפלוש הקשורים עם מצבים פתולוגיים כולל מחלות דלקתיות, סרטן גרורות1,2,3. גרורות שדפדפן הוא ההיבט ביותר ממעטים להבין סרטן. כדי גרורות, תאים סרטניים חייבים לבזות את המטריצה סלולרית נוספת (ECM), לפלוש את הרקמה המקומית ואת intravasate. פעם אחת בכל מחזור הדם, התאים הסרטניים להפיץ לאתר מרוחק, בורחת ויוצרים גידולים משניים. לכן, היכולת של תאים כדי לבזות את ECM, כדי להעביר, לפלוש קשורה הפוטנציאל גרורתי שלהם. גישות שונות פותחו כדי לנתח ולכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים. הגישות הנפוצה ביותר כוללים את הפצע ריפוי assay, מיקרוסקופיה זמן לשגות ואת וזמינותו קאמרית בוידן. הפצע הריפוי assay4 וזמן לשגות מיקרוסקופ הם מבחני פשוט ונוח שיכול לתת תובנה נדידת תאים ראשוניים. עם זאת, שניהם נמצאים מבחני 2D אשר אינן משקפות את סביבת 3D שבו קיימים תאים ויוו. מחקרים הראו כי התאים מגיבים באופן שונה סביבת 3D לעומת5,אחד62D. יתר על כן, מבחני ריפוי הפצע קשים כדי להתרבות, להניב תוצאות כמותיות-7,-8,-9. וזמינותו תא הדרה, המהווה שינוי תלת-ממדית של הפצע ריפוי assay, וזמינותו רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית אבל זה לא מתאים התאים נמוך במספר כגון תאים היברידית הנובע תא פיוז'ן אירועים10,11 .
וזמינותו קאמרית בוידן הוא assay תלת-ממדי המספק microenvironments הרלוונטי ללימודי הסלולר. עם זאת, זה דורש תאים כדי להסיר את microenvironment המקורי שלהם וכדי לאוגרים התא העליון של מערכת assay בוידן נודדים, לפלוש כלפי מטה לכיוון המדיום המכיל chemoattractant. גישה זו 3D אינו מתאים ולנתח את יכולת העברה ופלישה של תאים לפגיע שלהם microenvironment ו/או מוגבל מספר10,11,12. גישת כדי לנתח נדידת תאים ואת הפלישה הוא microfluidic קאמרית הדרגתיות assay13. למרות מתאים ואמין בלימודי הגירה ופלישה, וזמינותו זה יקר יותר, יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית עבור מעבדה טיפוסי. נתאר כאן וזמינותו פשוטה הפלישה אנכי הפוך זה תואם עם סוגי תאים רבים, כולל תאים רגישים microenvironment שלהם ו/או מוגבלים במספר. Assay הזה היה ממאמרו של הפרוטוקול המוצע על ידי הופר. et al. 14. זה assay, התאים נשארים microenvironment המקורי שלהם, ההגירה שלהם ואת הפלישה מנוטר כפי שהם לנוע כלפי מעלה הג'ל קולגן המכיל של chemoattractant11. זה וזמינותו היא לשחזור, אופטימיזציה, מאומת בצלחת תרבות 35 מ מ. זה יכול להיות מותאם תנאים assay שונים לרבות גדלים התרבות תאים שונים, מטריצות שונות או חוזק הדבקה, chemoattractants שונים. Assay הזה יכול לשמש פלטפורמה במבחנה להקרנה הראשוני בתהליך הגילוי סמים.

<table><tbody><tr><td>MatTek P35G-1.5-10C</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>mattek glass bottom dishes</td></tr><tr><td>Rat tail collagen I</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>354236</td><td>Collagen gel</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>H1758</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>10X Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>D2429</td><td>10X DMEM</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Confocal Fluorescent microscope</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>Olympus IX81</td><td>Confocal&amp;nbsp; microscope</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA</td><td>SH30070.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope</td><td>Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA</td><td>40x NA 0.8 objective</td><td>MPLSM</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane Inc. Zurich, CH</td><td>Imaris 7.5.2</td><td>Imaris software</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>50980487</td><td>PFA</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-minimum essential medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC; Manassas, VA, USA</td><td>HBT-22</td><td></td></tr><tr><td>MSC</td><td>Trivedi and Hematti, 2007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X lens UPLAPO</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>36-064</td><td>Olympus UPLSAPO 20X Objective</td></tr></tbody></table>

moving upwards: a simple and flexible in vitro three-dimensional invasion assay protocol

למרות הפלישה 3D מבחני פותחו, האתגר נשאר ללמוד תאים מבלי להשפיע על microenvironment שלהם התקינות. מבחני 3D מסורתיים כגון תא בוידן דורשים כי תאים שנעקרו מהמיקום תרבות המקורי ועבר למעבר לסביבה חדשה. לא רק זה לשבש תהליכים הסלולר הם מהותי microenvironment, אבל לעתים קרובות התוצאה היא איבוד תאים. הבעיות הללו הן מאתגר במיוחד בהתמודדות עם תאים שהם נדירים או רגישים ביותר שלהם microenvironment. כאן, אנו מתארים את התפתחות assay הפלישה תלת-ממד זה מונע שני חששות. זה assay, התאים הם מצופים במרחק קטן. ובכן, מטריקס ECM המכיל chemoattractant מונחת על גבי התאים. זה דורש אין הזחה תא, וזה מאפשר לתאים לפלוש כלפי מעלה לתוך המטריקס. ב הזה assay, הפלישה תא, כמו גם תא מורפולוגיה יכול להידרש בתוך הג'ל קולגן. שימוש assay הזה, נוכל לאפיין את הקיבולת פולשנית של תאים נדיר ורגיש; התאים היברידית הנובע היתוך בין תאים סרטניים בשד MCF7 mesenchymal/multipotent תאי גזע/משתית (MSCs).

השתמשנו לצלחת תרבות 35 מ מ עם קולגן הזנב הזכוכית התחתונה ועכבר כדי לפתח, לייעל את פלישה במבחנה 3D assay פרוטוקול. שימוש assay הזאת, הראנו את השד תאים סרטניים MCF7, MSC תאים יכול לפלוש לתוך הג'ל קולגן מרחק ממוצע של 0.04 ± 1.8 מיקרומטר ו 41.3 ± 76.0 מיקרומטר בהתאמה לאחר 48 שעות כאשר IGF1 (18.6 ng/mL)...

Watch this Scientific Journal Video about Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol at JoVE.com

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

moving-upwards-simple-flexible-vitro-three-dimensional-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

6.0K Views.  University of Minnesota - Twin Cities. פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.

Video: Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Medicine

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

במבחנה Invasion FluoroBlok גידול Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Biology

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Developmental Biology

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

מודלים תלת-ממדיים בביולוגיה של סרטן: דינמיקת פלישה בהטרוספרואידים

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

מחבר זרקור: פענוח ההצלבה בין סרטן לתאי מערכת החיסון במהלך התקדמות סרטן הראש והצוואר

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

במבחנה Invasion FluoroBlok גידול Assay

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

השתנה

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות