הפרויקט נתמך על ידי קרן לוקמיה קאררס חוסה (DJCLS 14 R/2017) הגרמני.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ה השני ועדת האתיקה של מנהיים בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת היידלברג. נכתב מדעת הושג מאנשים כל.
 1. הכנה של חומרים <ol><li>פתרון מניות קרישה: להכין פתרון מניות קרישה של הפארין I.U. 200 לכל מ ב- 0.9% נתרן כלורי. למלא כל אחד הצינורות אוסף (לצייר כרך 9 מ ל) 2 מ של הפתרון מניות קרישה לפני נסיגה של דגימות דם או מח עצם.</li>
	<li>פתרון פירוק כדוריות אדומות: הכן 10 x פתרון פירוק כדוריות אדומות עם 82.91 g אמוניום כלוריד, 7.91 ג'י אמוניום ביקרבונט, 2 מ ל תמיסה חומצית ethylenediaminetetraacetic 0.5 M ל pH של 8.0 על ידי המסת הסוכנים ב מזוקק פעמיים מים עבור הנפח הכולל של 1 ל'</li>
	<li>קיבוע פתרון: 8.3 להוסיף µL של 1 מ' אשלגן הידרוקסידי פתרון 360 מ"ג paraformaldehyde (PFA) צינור microtiter. ממלאים את הצינור buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לסימון 1 מ"ל של הרכבת התחתית, חום הצינורית בתוך גוש חימום ב 95 ° C כדי לקבל 1 מ"ל של פתרון PFA 36%. להעביר את הפתרון מחברים של 36% 1 מ"ל צינור עם קיבולת של 15 מ"ל. הוסף 8 מ"ל PBS הפתרון PFA 36% 1 מ"ל, להשיג 9 מ של פתרון מניות של כדורגלן 4%. 4% PFA פתרון מלאי החנות ב-18 ° C עד ולהשתמש עבור קיבעון של תאי aliquot. 
	התראה: 1) אשלגן הידרוקסידי פתרון הוא מאכל. להיות מודע העין והגנה על העור. 2) כדורגלן הוא מסרטנים. להימנע במגע עם העור אינהלציה. להכין את הפתרון קיבוע ברדס.</li>
	<li>Permeabilization פתרון: להוסיף 50 µL Octoxinol 9-50 מ"ל PBS כדי לקבל פתרון כ- 0.1% Octoxinol 9-</li>
	<li>חוסם פתרון: להכין 5% 2% חסימת פתרונות על ידי ערבוב הסוכן חסימת חלבון עם PBS, חנות-6 &#8211; 8 ° C.</li>
</ol> 2. הכנת הדגימות <ol><li>Fibroblasts בתרבות תא: מטפחים fibroblasts האנושי של הקו תא NHDF ב 5% humidified האווירה 2 CO ב 37 מעלות צלזיוס בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% עגל עוברית סרום, 4 מ מ גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
	<ol><li>הכנת שקופית מיקרוסקופ עם חסיד fibroblasts <ol><li>הסר המדיום הבקבוק (אזור הצמיחה של 2 75 ס מ) עם שמתקדמות NHDF fibroblasts. להוסיף 10 מ"ל PBS הבקבוקון. לשטוף את fibroblasts חסיד בעדינות ע י ניעור באופן ידני את הבקבוקון עבור מינימלית 1</li>
			<li>להסיר את PBS ולהוסיף טריפסין 1 מ"ל לתוך הבקבוק. לנער את הבקבוק בעדינות כדי לוודא כי כל תאים חסיד מכוסים על ידי טריפסין. הסר את טריפסין הבקבוקון. לשים את הבקבוק לתוך החממה במשך 5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>לקחת את הבקבוק מתוך החממה ולהוסיף 10 מ"ל RPMI 1640 בינוני לתוך הבקבוק. Pipette של המדיום לאורך מספר פעמים כדי לפזר את fibroblasts.</li>
			<li>פיפטה 0.3 מיליליטר fibroblasts מפוזרת על גבי כל אחד מהשדות שני של השקופית מיקרוסקופ ולשים את השקופית לתוך החממה במשך 24 שעות ביממה כך fibroblasts לדבוק השקופית. עבור immunostaining של γH2AX ו 53BP1 ב הגרעינים של fibroblasts, נעבור לשלב 3.1.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>דגימות החולה <ol><li>ודגימות הדם: להשתמש הצינורות אוסף מילוי עם 2 מ"ל של הפתרון מניות קרישה ולהוסיף 7 מ ל דם לתוך הצינורות. אחסן את הדגימות ללילה בטמפרטורת החדר (קרי, 18-20 ° C). למחרת, לבודד את שלב G0/G1 קייזרכרכט תאי תאי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (שלב 2.2.3).</li>
		<li>דגימות מח עצם: להשתמש הצינורות אוסף מילוי עם 2 מ"ל של הפתרון מניות קרישה (שלב 1.1) ולהוסיף מח עצם 7 mL לתוך הצינורות. אחסן את הדגימות ללילה בטמפרטורת החדר (קרי, 18-20 ° C). למחרת, לבודד את שלב G0/G1 קייזרכרכט תאי תאי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (שלב 2.2.3). השתמש CD34 גרגרי וסלולרי ההפרדה עמודות עבור הבידוד של תאי CD34 +.</li>
		<li>בידוד תאי תאי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות 
		הערה: תאי תאים מבודדים דגימות מח עצם ודם על ידי צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות 17 , 18 , 19.
		<ol><li>Dilute את דגימת הדם heparinized על יחס של 1:1 עם PBS ולדגום את מח העצם heparinized על יחס של 1:3 עם PBS. להשעות את התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים.</li>
			<li>להוסיף נפח של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור טריים. בעדינות שכבת דם מדולל או מח עצם על המדיום הדרגתיות צפיפות. הקפידו לא לערבב שתי שכבות.</li>
			<li>Centrifuge הצינור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, 400 x ג להרחיק את השכבה העליונה פלזמה עם פיפטה. ואז בזהירות לקצור תאי תאי השכבה שמעל המדיום הדרגתיות צפיפות. העברת תאי תאי לתוך צינור טריים.</li>
			<li>להוסיף לפחות שלושה כרכים של PBS תאי תאי בצינור. להשעות את התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים. Centrifuge את הצינור 10 דקות-בטמפרטורת החדר ו- g x 400</li>
			<li>לאחר הספין להסיר את תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל של 4 ° C, 1 x פתרון פירוק כדוריות אדומות. Resuspend התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים, ולמקם את הצינורית על קרח למשך 5 דקות. ואז להוסיף 30 מ ל PBS ב 4 ° C, centrifuge את הצינור 10 דקות-בטמפרטורת החדר ו- g x 400</li>
		</ol></li> <li>הכנת cytospins <ol><li>להכין שני cytospins עם תאי תאי של הדגימות החולה (קרי, cytospin אחד עבור צביעת immunofluorescence γH2AX, cytospin אחד עבור γH2AX ו- 53BP1 משולב immunofluorescence מכתים) על ידי צנטריפוגה (x 300 גרם, 10 דקות) של 1.0 x 10 5 תאים עבור כל הכנה ( איור 3 ו-4)-</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. γH2AX, צביעת Immunofluorescence 53BP1 <ol><li>קיבעון, permeabilization: לתקן את התאים עם 200 µL של 4% PFA למשך 10 דקות. לאחר קיבוע, לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של PBS למשך 5 דקות כל על המעבדה מטרף. ואז permeabilize את התאים עם 200 µL של 0.1% Octoxinol 9 עבור 10 דקות לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של 5% פתרון חסימה למשך 5 דקות כל על המעבדה מטרף. לחסום את התאים 30 מ של טרי 5% חסימת פתרון עבור ה 1</li>
	<li>הדגירה עם נוגדנים <ol><li>דגירה בתכשיר אחד של התאים עם נוגדן monoclonal anti-γH2AX העכבר (שבערך) והכנות אחרות של התאים עם נוגדן monoclonal anti-γH2AX העכבר (שבערך) ו- a נוגדן anti-53BP1 ארנב polyclonal (שבערך) בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>לאחר דגירה לשטוף את התאים בעדינות 3 פעמים עם 30 מ של 2% חסימה פתרון עבור כל 5 דקות על מטרף המעבדה.</li>
		<li>להסיר הפתרון חסימה, דגירה ההכנה הראשונים של התאים עם עז Alexa488 מצומדת אנטי-העכבר המשני נוגדן (שבערך) והכנת השני את התאים עם (נוגדן אנטי עכבר משני עז מצומדת-Alexa488 שבערך) ואת החמור Alexa555 מצומדת ארנב אנטי משני נוגדן (שבערך) לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li> <li>הרכבה בינונית: לשים את השקופית הכוללת התאים בקערה ולשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של PBS עבור כל 5 דקות על המעבדה מטרף. הסר את PBS והר התאים הרכבה בינונית המכיל 4, 6-diamidino-2-phenylindole. בזהירות לשים את coverslip על המדיום הרכבה כך אין בועות אוויר משובץ. לחכות לפחות 3 h עבור התקשות של המדיום הרכבה לפני ניתוח בתאים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.</li>
</ol> 4. ניתוח של γH2AX ושל 53BP1 מוקדים <ol><li>קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה: לנתח את מוקדים γH2AX ו 53BP1 ב גרעינים תא עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד מסננים דאפי, 488 אלקסה של Cy3 במהלך דימות-מטרה X 100 ההגדלה. שיא תמונות עם מצלמה ולעבד את התמונות עם תוכנת הדמיה המתאימה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer.">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA.">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li><li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+replication+stress.">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li><li>. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture Available from: <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994)</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70.">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX.">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li><li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX.">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li><li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability.">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li><li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GammaH2AX+in+cancer+cells:+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics,+prediction+and+recurrence.">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response.">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li><li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias.">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li><li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice.">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+White+Blood+Cells.">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation,+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li><li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque.">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li><li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology.">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li><li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT:+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure.">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li><li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations.">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li><li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses.">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX, 53BP1 היא שיטה שימושית לניתוח היווצרות ותיקון של DSB, בקשת רחבה של תחומי מחקר. פרמטרים קריטיים המשפיעים על התוצאה של הניסויים הם השלב של מחזור התא, הסוכנים המשמש את הקיבעון ואת permeabilization של התאים, הבחירה של הנוגדנים, ורכיבי חומרה ותוכנה של המיקרוסקופ זריחה.
<p class="jove...

הדנ א פגום באופן רציף על ידי אנדוגני (למשל, השכפול מתחים, מינים חמצן תגובתי, חוסר יציבות פנימי של ה-DNA), אקסוגני (למשל, רדיקלים כימי, הקרנה) מקורות (איור 1)1,2 3, ,4. בין נזק לדנ א, מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) נגעים רציני במיוחד, עשוי לגרום מוות של תאים או carcinogenesis. כ-50 DSB שעלולים להתעורר לכל מחזור התא ותא.5. בתרבית של תאים, רקומבינציה הומולוגית (HR) והצטרפות nonhomologous סוף-(NHEJ) פיתח כמו מסלולים עיקריים עבור התיקון של DSB (איור 2). HR מתרחשת בשלב מאוחר S/G2 ומשתמש אחות שלם כרומטידה כתבנית לתיקון פוטנציאלי ללא שגיאות. לשם השוואה, NHEJ הוא פעיל במהלך מחזור התא, פוטנציאל מוטגניות כפי בסיסי זוגות ניתן להוסיף או resected לפני מצדו של הקצוות השבורים. בנוסף, סוף-הצטרפות אלטרנטיבית עשויים להיות עסוקים כמנגנון איטי מוטגניות גיבוי תיקון במקרה של NHEJ מחסור6,7.
DSB לגרום זירחון של היסטון H2AX-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase סביב כל DSB. מוקדים הגרעין ויוצרים נקראים γH2AX מוקדים, ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence8. ΓH2AX מקדמת את גיוס נוסף DSB מגיב חלבונים, ומעורב כרומטין שיפוץ, תיקון ה-DNA, ואת האות התמרה חושית9. כמו כל פוקוס γH2AX נחשב לייצוג של DSB יחיד, כימות של DSB על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence הוא אפשרי, אשר הוכח שורות תאים סרטן, דגימות מטופלים10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא חלבון מפתח אחר במתווכים DSB תיקון. . מעורב בלשכת הגיוס של DSB מגיב חלבונים, מחסום איתות את synapsis של DSB קצוות15. בנוסף, 53BP1 ממלאת תפקיד קריטי בבחירת מסלול תיקון DSB. זה מפעיל התיקון של DSB לכיוון NHEJ אמנם HR מנעו16. בהתחשב בפונקציות מקורית של γH2AX ו- 53BP1 תיקון DSB, ניתוח בו זמנית של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות שיטה שימושית עבור ניתוח מדויק של היווצרות והתיקון של DSB.
כתב יד זה מספק פרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע immunofluorescence מיקרוסקופיה של γH2AX ושל 53BP1 בתוך גרעין התא. באופן ספציפי, השיטה מיושמת fibroblasts נורמלי של קו תא NHDF, רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא, תאי CD34 + של חולה עם לוקמיה מיאלואידית חריפה. הפרטים של השיטה הם הצביע בהקשר של התוצאות שהוצגו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">R0883</td>
			<td style="width:200px;">Medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:119px;">ratiopharm</td>
			<td style="width:104px;">PZN 3029843</td>
			<td style="width:200px;">&#160;Heparin 5,000 I.U. / mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium chloride solution 0.9%</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:104px;">PZN 1957154</td>
			<td style="width:200px;">Component of the anticoagulant stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:104px;">17-5442-02</td>
			<td style="width:200px;">Medium for isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Trypsin solution 10X</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">59427C</td>
			<td style="width:200px;">Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">CD34 MicroBead Kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-046-702</td>
			<td style="width:200px;">Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Diagnostic microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER-203B-CE24</td>
			<td style="width:200px;">Microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Megafuge 1.0 R</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003060</td>
			<td style="width:200px;">&#160;Tabletop centrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cytospin device</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Lid</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td>76003422</td>
			<td style="width:200px;">Lid for working without micro-tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyto container</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003416</td>
			<td style="width:200px;">Cyto container with 2 conical bores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Clip carrier</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003414</td>
			<td style="width:200px;">Carrier for holding a cyto container and a slide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Support insert</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003417</td>
			<td style="width:200px;">Support insert for holding a clip carrier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Triton X-100 (Octoxinol 9)</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">85112</td>
			<td style="width:200px;">Detergent for permeabilization of cell membranes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium hydroxide solution 1M</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">109107</td>
			<td style="width:200px;">Necessary for preparing the paraformaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:200px;">Fixation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D8537</td>
			<td style="width:200px;">Balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Chemiblocker</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">2170</td>
			<td style="width:200px;">Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Mouse monoclonal anti-&#947;H2AX antibody (JBW301)</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">05-636</td>
			<td style="width:200px;">Primary antibody for detection of &#947;H2AX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)</td>
			<td style="width:119px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">NB100-304</td>
			<td style="width:200px;">Primary antibody for detection of 53BP1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">A-11001</td>
			<td style="width:200px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:119px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">A-21428</td>
			<td style="width:200px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:119px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">H-1200</td>
			<td style="width:200px;">Contains DAPI for staining of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Axio Scope.A1</td>
			<td style="width:119px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">490035</td>
			<td style="width:200px;">Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Cool Cube 1 CCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Metasystems</td>
			<td style="width:104px;">H-0310-010-MS</td>
			<td style="width:200px;">Camera system for digital recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Isis software</td>
			<td style="width:119px;">Metasystems</td>
			<td style="width:104px;">Not applicable</td>
			<td style="width:200px;">Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence microscopy of &#947;h2ax and 53bp1 for analyzing the formation and repair of dna double-strand breaks

מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) הם נגעים DNA רציני. ניתוח היווצרות ותיקון של DSB רלוונטי, בקשת רחבה של תחומי מחקר כולל גנום שלמות, genotoxicity, קרינה ביולוגיה, הזדקנות, סרטן של פיתוח תרופות. בתגובה DSB, היסטון H2AX הוא phosphorylated-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase ויוצרים foci גרעיני דיסקרטית לזיהוי על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. בנוסף, 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא עוד חלבון מגיב DSB חשוב בקידום תיקון של DSB ומצטרף nonhomologous סוף-תוך מניעת רקומבינציה הומולוגית. על פי הפונקציות ספציפית של γH2AX, 53BP1, ניתוח משולב של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות גישה סבירה עבור ניתוח מפורט של DSB. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורטות בתוספת הערות שיטתי על ביצוע הטכניקה. באופן ספציפי, ההשפעה של מחזור התא על דפוסי מוקדים γH2AX הוא הפגינו fibroblasts נורמלי של הקו תא NHDF. יתר על כן, הערך של מוקדים γH2AX כמו סמן מתואר רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא. לבסוף, אי-יציבות גנטית ייחקר בתאים CD34 + של מטופל עם לוקמיה מיאלואידית חריפה על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים הוא המדויק ביותר בין שלב G0/G1 לשלב G2 כאשר מוקדים γH2AX מופיעים כנקודות פלורסנט ברורים (איור 5A). לעומת זאת, ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים במהלך שלב S הינו מסובך γH2AX פאן-גרעיני התפזרו ספאקלס הנגרמת על ידי תהליך השכפול (איור 5B)...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Microscopy of Î³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks at JoVE.com

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.1K Views.  Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University. כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

Video: Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a better understanding of tumor heterogeneity and thus facilitate the selection of patients for personalized treatment. However, this is hampered because of the rarity of CTCs. We present an innovative approach for sampling a high volume of the patient blood and obtaining information about presence, phenotype, and gene translocation of CTCs. The method combines immunofluorescence staining and DNA fluorescent-in-situ-hybridization (DNA FISH) and is based on a functionalized medical wire. This wire is an innovative device that permits the in vivo isolation of CTCs from a large volume of peripheral blood. The blood volume screened by a 30-min administration of the wire is approximately 1.5-3 L. To demonstrate the feasibility of this approach, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) expression and the chromosomal translocation of the ALK gene were determined in non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines captured by the functionalized wire and stained with an immuno-DNA FISH approach. Our main challenge was to perform the assay on a 3D structure, the functionalized wire, and to determine immuno-phenotype and FISH signals on this support using a conventional fluorescence microscope. The results obtained indicate that catching CTCs and analyzing their phenotype and chromosomal rearrangement could potentially represent a new companion diagnostic approach and provide an innovative strategy for improving personalized cancer treatments.

We present a new approach to characterize tumor cells. We combined immunofluorescence with DNA fluorescent-in-situ-hybridization to evaluate cells captured by a functionalized medical wire capable of in vivo enriching CTCs directly from patient blood.

איפיון תאים סרטניים באמצעות חוט רפואי עבור לכידת מחזורי תאים סרטניים: בגישה 3D בהתבסס על Immunofluorescence ודגים דנ א

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in tumorigenesis, can be directed to cancer biomarkers enabling tumor detection and characterization, and can be used for cancer therapy as mAbs or antibody-drug conjugates to activate immune effector cells, to inhibit signaling pathways, or directly kill cells carrying the specific antigen. Despite clinical advancements in the development and production of novel and highly specific mAbs, diagnostic and therapeutic applications can be impaired by the complexity and heterogeneity of the tumor microenvironment. Thus, for the development of efficient antibody-based therapies and diagnostics, it is crucial to assess the biodistribution and interaction of the antibody-based conjugate with the living tumor microenvironment. Here, we describe In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) as a new approach to study interactions of antibody-based therapeutics and diagnostics in the in vivo physiological and pathological conditions. In this technique, a therapeutic or diagnostic antigen-specific antibody is intravenously injected in&#160;vivo and localized ex vivo with a secondary antibody in isolated tumors. IVIL, therefore, reflects the in vivo biodistribution of antibody-based drugs and targeting agents. Two IVIL applications are described assessing the biodistribution and accessibility of antibody-based contrast agents for molecular imaging of breast cancer. This protocol will allow future users to adapt the IVIL method for their own antibody-based research applications.

The in vivo immunofluorescence localization (IVIL) method can be used to examine in vivo biodistribution of antibodies and antibody conjugates for oncological purposes in living organisms using a combination of in vivo tumor targeting and ex vivo immunostaining methods.

ב Vivo אימונוofor, לוקליזציה להערכת הטיפול הרפואי והאבחון ביופצת התרופות בחקר הסרטן

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

איתור דנ"א ללא תאים בדגימות פלזמה בדם של חולי סרטן

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several animal models have been generated, including the widely used orthotopic mouse models, where cancer cells are injected into the mammary fat pad. However, these models cannot help monitor tumor growth kinetics and metastatic colonization. Cutting-edge tools to monitor cancer cells in real time in mice will significantly advance the understanding of tumor biology. 
Here, breast cancer cell lines stably expressing luciferase and green fluorescent protein (GFP) were established. Specifically, this technique contains two sequential steps initiated by measuring the luciferase activity in vitro and followed by the implantation of the cancer cells into mammary fat pads of nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency (NOD-SCID) mice. After the injection, both the tumor growth and metastatic colonization are monitored in real time by the noninvasive bioluminescence imaging system. Then, the quantification of GFP-expressing metastases in the lungs will be examined by fluorescence microscopy to validate the observed bioluminescence results. This sophisticated system combining luciferase and fluorescence-based detection tools evaluates cancer metastasis in vivo, which has great potential for use in breast cancer therapeutics and disease management.

Here, we describe a noninvasive monitoring method involving luciferase and green fluorescent protein expression in various breast cancer cell lines. This protocol provides a technique to monitor tumor formation and metastatic colonization in real time in mice.

ניטור צמיחת סרטן השד והיווצרות מושבה גרורתית בעכברים באמצעות Bioluminescence

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, transcription-replication conflicts, or amplified oncogenes, inevitably resulting in the generation of single-stranded DNA (ssDNA). Quantifying ssDNA, therefore, presents an opportunity to assess the level of replication stress in different cell types and under various DNA-damaging conditions or treatments. Emerging evidence also suggests that ssDNA can be a predictor of responses to chemotherapeutic drugs that target DNA repair. Here, we describe a detailed immunofluorescence-based methodology to quantify ssDNA. This methodology involves labeling the genome with a thymidine analog, followed by the antibody-based detection of the analog at the chromatin under non-denaturing conditions. Stretches of ssDNA can be visualized as foci under a fluorescence microscope. The number and intensity of the foci directly co-relate with the level of ssDNA present in the nucleus. We also describe an automated pipeline to quantify the ssDNA signal. The method is rapid and reproducible. Furthermore, the simplicity of this methodology makes it amenable to high-throughput applications such as drug and genetic screens.

Here, we describe an immunofluorescence-based method to quantify the levels of single-stranded DNA in cells. This efficient and reproducible method can be utilized to examine replication stress, a common feature in several ovarian cancers. Additionally, this assay is compatible with an automated analysis pipeline, which further increases its efficiency.