وأيد المشروع "الألماني خوسيه كاريراس اللوكيميا المؤسسة" (14 دجكلس R/2017).

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا من "الثاني لجنة الأخلاقيات" في "مانهايم كلية الطب" في جامعة هايدلبرغ. كتب تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الأفراد-
 1. "إعداد مواد" <ol><li>حل الأسهم تخثر الدم: تعد حلاً أسهم التخثر 200 وحدة دولية الهيبارين كل مل في كلوريد الصوديوم 0.9%. ملء كل من أنابيب جمع (رسم حجم مل 9) مع 2 مل الحل الأسهم التخثر قبل سحب عينات الدم أو نخاع العظم.</li>
	<li>حل تحلل للخلايا الحمراء: تحضير 10 × حل تحلل للخلايا الحمراء مع ز 82.91 كلوريد الأمونيوم وبيكربونات الأمونيوم 7.91 ز 2 مل من 0.5 م الإيثيلين حل حمض pH 8.0 بتذويب الوكلاء في الماء المقطر مزدوجة لإجمالي حجم 1 ل.</li>
	<li>حل التثبيت: ميليلتر 8.3 إضافة حل هيدروكسيد البوتاسيوم 1 متر إلى 360 ملغ بارافورمالدهيد (PFA) في أنبوب ميكروتيتير. ملء الأنبوب مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للعلامة 1 مل من الأنبوب والحرارة الأنبوب في كتلة تدفئة في 95 درجة مئوية للحصول على 1 مل حل منهاج العمل 36%. نقل الحل منهاج العمل 36% 1 مل إلى أنبوب بسعة 15 مل. إضافة 8 مل برنامج تلفزيوني في حل منهاج العمل 36% 1 مل، للحصول على 9 مل حل الأسهم منهاج العمل 4%. قاسمة 4% PFA الحل المخزون والمخزن عند-18 درجة مئوية حتى تستخدم لتثبيت الخلايا. 
	تنبيه: 1) هيدروكسيد البوتاسيوم والحل التآكل. كن على علم من حماية العين والجلد. 2) منهاج عمل بيجين المسببة للسرطان. تجنب تماس الجلد والاستنشاق. إعداد الحل التثبيت تحت غطاء محرك السيارة-</li>
	<li>الحل بيرميبيليزيشن: إضافة 50 ميليلتر أوكتوكسينول 9 إلى 50 مل برنامج تلفزيوني الحصول على حل حوالي 0.1% 9 أوكتوكسينول-</li>
	<li>عرقلة الحل: إعداد 5% و % 2 عرقلة الحلول بخلط البروتين عامل حجب مع برنامج تلفزيوني ومخزن في 6 &#8211; 8 ° C.</li>
</ol> 2. إعداد العينات <ol><li>الليفية في ثقافة الخلية: زراعة الخلايا الليفية البشرية خط الخلية نهدف في هوميديفيد 5% CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% مصل العجل الجنين، 4 مم الجلوتامين، و 1% البنسلين/ستربتوميسين.
	إزالة الليفية <ol><li>إعداد شريحة مجهر مع تمسكا <ol><li>المتوسطة من قارورة (منطقة النمو 2 75 سم) مع تزايد الليفية نهدف أضعافاً مضاعفة. إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني قارورة. أغسل الليفية ملتصقة بلطف بالهز يدوياً قارورة للحد الأدنى 1</li>
			إزالة برنامج تلفزيوني <li>وإضافة التربسين 1 مل إلى قارورة. هز قارورة بلطف لضمان شمول جميع الخلايا ملتصقة التربسين. إزالة التربسين من قارورة. وضع في قارورة في الحاضنة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.</li>
			تأخذ قارورة خارج الحاضنة <li>وإضافة 10 مل RPMI 1640 المتوسطة إلى قارورة. "الماصة؛" المتوسط صعودا وهبوطاً عدة مرات لتفريق الخلايا الليفية.</li>
			<li>"الماصة؛" 0.3 مل الليفية متناثرة على كل من هذين المجالين من الشريحة المجهر ووضع الشريحة في الحاضنة ل 24 ساعة حيث أن الخلايا الليفية الانضمام إلى الشريحة. ل immunostaining γH2AX و 53BP1 في نويات الخلايا الليفية، انتقل إلى الخطوة 3، 1-</li>
		</ol></li></ol></li> <li>عينات المرضى <ol><li>عينات الدم: استخدام أنابيب جمع يتم ملؤها مع 2 مل الحل الأسهم التخثر وإضافة 7 مل الدم في الأنابيب. تخزين العينات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (أي، 18-20 درجة مئوية). وفي اليوم التالي عزل مرحلة G0/G1 يستريح الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي (الخطوة 2.2.3)-</li>
		<li>عينات نخاع العظام: استخدام أنابيب جمع يتم ملؤها مع 2 مل من محلول الأسهم التخثر (الخطوة 1، 1) وإضافة 7 مل نخاع العظام في الأنابيب. تخزين العينات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (أي، 18-20 درجة مئوية). وفي اليوم التالي عزل مرحلة G0/G1 يستريح الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي (الخطوة 2.2.3). استخدام CD34 ميكروبيدس والخلية أعمدة الفصل لعزل الخلايا CD34 +-</li>
		<li>عزل الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي 
		ملاحظة: الخلايا وحيدات النوى معزولة من عينات نخاع العظم والدم بكثافة الطرد المركزي التدرج 17 ، ، من 18 19.
		<ol><li>ديلوتى عينة الدم هيبارينيزيد بنسبة 1:1 مع برنامج تلفزيوني وعينه نخاع العظم هيبارينيزيد بنسبة 1:3 مع برنامج تلفزيوني. تعليق الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين.</li>
			إضافة <li>حجم متوسط الكثافة المتدرجة إلى أنبوب جديد. بلطف طبقة الدم المخفف أو نخاع العظام فوق المتوسطة الكثافة المتدرجة. الحرص على عدم خلط الطبقتين.</li>
			<li>الطرد المركزي في أنبوب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س رسم طبقة البلازما العليا قبالة مع الماصة. ثم بعناية حصاد الخلايا وحيدات النوى في الطبقة فوق المتوسطة الكثافة المتدرجة. نقل الخلايا وحيدات النوى في أنبوب جديد.</li>
			إضافة <li>على الأقل ثلاثة مجلدات من برنامج تلفزيوني للخلايا وحيدات النوى في الأنبوب. تعليق الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين. الطرد المركزي في أنبوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س</li>
			<li>بعد تدور إزالة المادة طافية وإضافة 10 مل من 4 درجة مئوية، 1 x حل تحلل للخلايا الحمراء. ريسوسبيند الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين، ووضع الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم إضافة 30 مل برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية والطرد المركزي في أنبوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س</li>
		</ol></li> <li>إعداد سيتوسبينس <ol><li>إعداد سيتوسبينس اثنين مع الخلايا وحيدات النوى من عينات المرضى (أي، سيتوسبين واحد لتلطيخ الفلورة γH2AX وسيتوسبين واحد ل γH2AX و 53BP1 جنبا إلى جنب تلطيخ الفلورة) بالطرد المركزي (300 x ز، 10 دقيقة) 1.0 × 10 5 خلايا لكل إعداد ( الشكل 3 و 4)-</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3-γH2AX و "تلطيخ الفلورة" 53BP1 <ol><li>التثبيت وبيرميبيليزيشن: إصلاح الخلايا مع 200 ميليلتر من 4% منهاج العمل لمدة 10 دقائق. بعد التثبيت، غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من برنامج تلفزيوني لمدة كل 5 دقائق على شاكر معمل. ثم بيرميبيليزي الخلايا مع 200 ميليلتر من 0.1% 9 أوكتوكسينول للحد الأدنى 10 يغسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من محلول حظر 5% لمدة كل 5 دقائق على شاكر معمل. كتلة الخلايا في 30 مل الطازجة 5% إعاقة الحل حاء – 1</li>
	<li>الحضانة مع الأجسام المضادة <ol><li>احتضان إعداد واحدة من الخلايا بجسم [مونوكلونل] مكافحة--γH2AX ماوس (1: 500) وإعداد أخرى من الخلايا بجسم [مونوكلونل] مكافحة--γH2AX ماوس (1: 500) أرنب [بولكلونل] جسم المضادة-53BP1 (1: 500) بين عشية وضحاها في 4 ° C.</li>
		<li>بعد الاحتضان غسل الخلايا بلطف 3 مرات مع 30 مل محلول حظر 2% لكل 5 دقائق على شاكر مختبر.</li>
		<li>إزالة الحل حظر واحتضان إعداد الخلايا بجسم ماعز مترافق Alexa488 المضادة ماوس ثانوي (1: 500) الأولى والثانية إعداد الخلايا مع (المضادة ماوس ثانوي جسم ماعز مترافق Alexa488 1: 500) ودونكي Alexa555 مترافق أرنب المضادة ثانوية جسم (1: 500) ح 1 في درجة حرارة الغرفة-</li>
	</ol></li> <li>المتوسطة التركيب: وضع الشريحة مع الخلايا في وعاء وغسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من برنامج تلفزيوني لكل 5 دقائق على شاكر معمل. إزالة برنامج تلفزيوني وجبل الخلايا مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي. حذر وضع ساترة من فوق المتوسطة متصاعدة حيث تكون لا فقاعات الهواء المضمنة. الانتظار على الأقل 3 ح لتصلّب المتوسطة المتصاعدة قبل تحليل الخلايا بالميكروسكوب fluorescence.</li>
</ol> 4. تحليل γH2AX و 53BP1 البؤر <ol><li>المجهري Fluorescence: تحليل البؤر γH2AX و 53BP1 في نواة الخلية مجهر الأسفار مزودة بمرشحات DAPI و 488 أليكسا Cy3 أثناء التصوير إلى هدف X 100 التكبير. تسجيل الصور مع كاميرا ومعالجة الصور مع برامج التصوير المناسبة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer.">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA.">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li><li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+replication+stress.">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li><li>. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture Available from: <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994)</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70.">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX.">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li><li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX.">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li><li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability.">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li><li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GammaH2AX+in+cancer+cells:+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics,+prediction+and+recurrence.">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response.">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li><li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias.">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li><li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice.">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+White+Blood+Cells.">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation,+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li><li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque.">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li><li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology.">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li><li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT:+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure.">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li><li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations.">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li><li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses.">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 طريقة مفيدة لتحليل تكوين وإصلاح جهاز تسوية المنازعات في نطاق عريض من المجالات البحثية. معلمات الحرجة التي تؤثر على نتائج هذه التجارب هي مرحلة دورة الخلية، العوامل المستخدمة لتثبيت و permeabilization للخلايا، والاختيار من الأجسام المضادة، والأجهزة والبرمجيات من المجهر الأ?...

تلف الحمض النووي بشكل مستمر بالذاتية (مثلاً، الإجهاد النسخ المتماثل، الأنواع الأكسجين التفاعلية، وعدم استقرار جوهري للحمض النووي) وخارجية (مثلاً، الجذور الكيميائية، والتشعيع) مصادر (الشكل 1)1،2 ،،من34. بين الأضرار الحمض النووي، والحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل (جهاز تسوية المنازعات) آفات خطيرة بصفة خاصة وقد تؤدي إلى موت الخلايا أو التسرطن. وقد تنشأ حوالي 50 جهاز تسوية المنازعات كل خلية ودورة الخلية5. في خلايا الثدييات، وضع جزئ المتجانسة (الموارد البشرية) ونونهومولوجوس نهاية-الالتحاق بالعمل (نج) كمسارات رئيسية لإصلاح جهاز تسوية المنازعات (الشكل 2). الموارد البشرية يحدث في أواخر المرحلة S/G2 ويستخدم أخت سليمة تشروماتيد كقالب لإصلاح يحتمل أن تكون خالية من الأخطاء. وبالمقارنة، نج نشطة في جميع أنحاء دورة الخلية، ويحتمل أن تكون مطفرة كما يمكن إضافة زوج قاعدي أو مستأصل قبل ربط نهايات مكسورة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تمارس من الانضمام إلى نهاية بديلة كآلية بطيئة مطفرة إصلاح احتياطية في حالة عوز نهيج6،7.
حمل جهاز تسوية المنازعات الفسفرة هيستون H2AX 139 سيرين في منطقة من مناطق عدة أزواج مجباس حول كل جهاز تسوية المنازعات. البؤر النووية تشكل تسمى البؤر γH2AX ويمكن كشفها ب الفحص المجهري الفلورة8. ΓH2AX تشجع توظيف المزيد من البروتينات المراعية لجهاز تسوية المنازعات، وهو يشارك في الكروماتين يعيد البناء وإصلاح الحمض النووي، والإشارات تنبيغ9. كما يعتبر كل بؤرة γH2AX لتمثيل هيئة تسوية المنازعات واحد، التحديد الكمي لجهاز تسوية المنازعات مجهر الفلورة من الممكن، الذي أثبت في خطوط خلايا السرطان وعينات المرضى10،11، 12 , 13 , 14-53BP1 (البروتين p53 1) بروتين رئيسي آخر في التوسط لإصلاح جهاز تسوية المنازعات. أنها تشارك في تجنيد المراعية لجهاز تسوية المنازعات البروتينات، مما يشير إلى نقطة تفتيش، وتشابك جهاز تسوية المنازعات تنتهي15. وبالإضافة إلى ذلك، 53BP1 يلعب دوراً حاسما في اختيار مسار إصلاح جهاز تسوية المنازعات. فإنه بتشغيل إصلاح جهاز تسوية المنازعات نحو نج بينما منعت16ساعة. قد يكون التحليل المتزامن ل γH2AX و 53BP1 بالفحص المجهري الفلورة نظراً لمهام حقيقية γH2AX و 53BP1 في إصلاح جهاز تسوية المنازعات، وسيلة مفيدة لتحليل دقيق لتشكيل وإصلاح جهاز تسوية المنازعات.
هذه المخطوطة يوفر بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء الفحص المجهري الفلورة γH2AX و 53BP1 في نواة الخلية. على وجه التحديد، يتم تطبيق التقنية في الخلايا الليفية العادي الخط الخلية نهدف، في الأشعة السينية المشع لمفاوية فرد صحية وفي CD34 + خلايا المريض بسرطان الدم النقوي الحاد. تفاصيل الأسلوب هي أشارت في سياق النتائج المعروضة.

<table><tbody><tr><td>RPMI medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>Medium for cell culture</td></tr><tr><td>Heparin sodium</td><td>ratiopharm</td><td>PZN 3029843</td><td>&amp;nbsp;Heparin 5,000 I.U. / mL</td></tr><tr><td>Sodium chloride solution 0.9%</td><td>B. Braun</td><td>PZN 1957154</td><td>Component of the anticoagulant stock solution</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>Medium for isolation of mononuclear cells</td></tr><tr><td>Trypsin solution 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells</td></tr><tr><td>Diagnostic microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>Microscope slides</td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&amp;nbsp;Tabletop centrifuge&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cytospin device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lid</td><td>Heraeus</td><td>76003422</td><td>Lid for working without micro-tubes</td></tr><tr><td>Cyto container</td><td>Heraeus</td><td>75003416</td><td>Cyto container with 2 conical bores</td></tr><tr><td>Clip carrier</td><td>Heraeus</td><td>75003414</td><td>Carrier for holding a cyto container and a slide</td></tr><tr><td>Support insert</td><td>Heraeus</td><td>75003417</td><td>Support insert for holding a clip carrier</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>Detergent for permeabilization of cell membranes</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide solution 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>Necessary for preparing the paraformaldehyde solution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Fixation agent</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Balanced salt solution</td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>Blocking agent</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;gamma;H2AX antibody (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>Primary antibody for detection of &amp;gamma;H2AX</td></tr><tr><td>Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>Primary antibody for detection of 53BP1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Contains DAPI for staining of DNA</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Zeiss</td><td>490035</td><td>Fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Cool Cube 1 CCD camera</td><td>Metasystems</td><td>H-0310-010-MS</td><td>Camera system for digital recording</td></tr><tr><td>Isis software</td><td>Metasystems</td><td>Not applicable</td><td>Microscope software</td></tr></tbody></table>

immunofluorescence microscopy of &#947;h2ax and 53bp1 for analyzing the formation and repair of dna double-strand breaks

فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي (جهاز تسوية المنازعات) خطيرة الحمض النووي آفات. تحليل لتشكيل وإصلاح جهاز تسوية المنازعات ذات الصلة بطائفة واسعة من مجالات البحوث بما في ذلك سلامة الجينوم وسمية جينية وبيولوجيا الإشعاع، والشيخوخة، والسرطان وتطوير العقاقير. ردا على جهاز تسوية المنازعات، هو فوسفوريلاتيد هيستون H2AX 139 سيرين في منطقة من مناطق عدة أزواج ميجاباسي تشكيل بؤر النووية منفصلة يمكن كشفها بالفحص المجهري الفلورة. وبالإضافة إلى ذلك، 53BP1 (البروتين p53 1) آخر بروتين المراعية لجهاز تسوية المنازعات الهامة تعزيز إصلاح جهاز تسوية المنازعات قبل نونهومولوجوس الانضمام إلى نهاية بينما تمنع جزئ مثلى. وفقا للمهام المحددة في γH2AX و 53BP1، قد يكون الجمع بين تحليل γH2AX و 53BP1 بالفحص المجهري الفلورة نهجاً معقولاً لإجراء تحليل مفصل لجهاز تسوية المنازعات. وتوفر هذه المخطوطة بروتوكول خطوة بخطوة وتستكمل مع ملاحظات منهجية لأداء التقنية. على وجه التحديد، يتضح تأثير دورة الخلية في أنماط البؤر γH2AX الليفية العادي الخط الخلية نهدف. علاوة على ذلك، يبين قيمة البؤر γH2AX كالعلامات البيولوجية لمفاوية المشع بالأشعة السينية لشخص سليم. وأخيراً، عدم الاستقرار الوراثي هو التحقيق في CD34 + خلايا المريض بسرطان الدم النقوي الحاد مجهرية الفلورة γH2AX و 53BP1.

تحليل للبؤر γH2AX في الخلايا الأكثر دقة في مرحلة G0/G1 و G2 عند ظهور بؤر γH2AX كنقاط مضيئة مميزة (الشكل 5A). على النقيض من ذلك، تحليل للبؤر γH2AX في الخلايا أثناء مرحلة ثانية يعقدها تلامس مشتتة γH2AX عموم النووية الناجمة عن عملية النسخ المتماثل (الشكل 5 (ب)</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Microscopy of Î³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks at JoVE.com

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

هذه المخطوطة يوفر بروتوكول لتحليل الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1.

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.2K Views.  Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University. هذه المخطوطة يوفر بروتوكول لتحليل الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1.

Video: Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer treatments as used in clinical oncology. It enables a quantitative and longitudinal analysis of the DNA damage response after genotoxic stress, as induced by radiotherapy and a multitude of anti-cancer drugs. The method covers all stages of the DNA damage response, providing endpoints for induction and repair of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle arrest and cell death by apoptosis in case of repair failure. Combining these measurements provides information about cell cycle-dependent treatment effects and thus allows an in-depth study of the interplay between cellular proliferation and coping mechanisms against DNA damage. As the effect of many cancer therapeutics including chemotherapeutic agents and ionizing radiation is limited to or strongly varies according to specific cell cycle phases, correlative analyses rely on a robust and feasible method to assess the treatment effects on the DNA in a cell cycle-specific manner. This is not possible with single-endpoint assays and an important advantage of the presented method. The method is not restricted to any particular cell line and has been thoroughly tested in a multitude of tumor and normal tissue cell lines. It can be widely applied as a comprehensive genotoxicity assay in many fields of oncology besides radio-oncology, including environmental risk factor assessment, drug screening and evaluation of genetic instability in tumor cells.

The presented method combines the quantitative analysis of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle distribution and apoptosis to enable cell cycle-specific evaluation of DSB induction and repair as well as the consequences of repair failure.

قياس دورة الخلية محددة من γH2AX والمبرمج بعد الإجهاد السامة الجينية عن طريق قياس التدفق الخلوي

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, including cancer. The cell is, therefore, provided with complex mechanisms to repair DSBs, and these pathways involve histone H2AX in its phosphorylated form at Ser-139 (namely &#947;H2AX) and p53 binding protein 1 (53BP1). As both proteins can form foci at the sites of DSBs, identification of these markers is considered a suitable method to study both DSBs and their kinetics of repair. According to the molecular processes that lead to the formation of &#947;H2AX and 53BP1 foci, it could be more useful to investigate their co-localization near the DSBs in order to set up an alternative approach that allows quantifying DSBs by the simultaneous detection of two DNA damage markers. Thus, this protocol aims to assess the genomic damage induced in human lymphocytes by the radiomimetic agent bleomycin through the presence of &#947;H2AX and 53BP1 foci in a dual immunofluorescence. Using this methodology, we also delineated the variation in the number of &#947;H2AX and 53BP1 foci over time, as a preliminary attempt to study the repair kinetics of bleomycin-induced DSBs.

This protocol presents a method to assess the formation and repair of DNA double-strand breaks through the simultaneous detection of &#947;H2AX and 53BP1 foci in interphase nuclei of bleomycin-treated human peripheral lymphocytes.

التألق المناعي المزدوج ل γH2AX و 53BP1 في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

Genetics

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

التصور من الحمض النووي إصلاح البروتينات التفاعل من قبل immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

<meta charset="utf8"></head><body>تقييم تفاعل البروتين وتوطينه في تلف الحمض النووي

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: الجمع بين مقايسة الترابط القرب وتلوين Gamma-H2AX لتوصيف تفاعلات البروتين في استجابة تلف الحمض النووي

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

مقايسة ترابط القرب لتوطين البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة

قياس دورة الخلية محددة من γH2AX والمبرمج بعد الإجهاد السامة الجينية عن طريق قياس التدفق الخلوي

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

التألق المناعي المزدوج ل γH2AX و 53BP1 في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة

تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

التصور من الحمض النووي إصلاح البروتينات التفاعل من قبل immunofluorescence

مقايسة ترابط القرب لتوطين البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي

مقايسة ترابط القرب لتوطين البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي