Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto numero premio R35GM124868 e dalla Duke University.

1. impostare il Layout e l'allineamento
<ol>
	<li>Installazione e collimazione dell'eccitazione rilevamento laser<ol>
		<li>Apporre il laser alla tabella ottico usando un montaggio autocostruite. Il Monte è un piatto semplice in alluminio con fori per la testa del laser e la tabella ottica di montaggio. Il laser deve essere ben fissato a un supporto di metallo per stabilità e dissipazione del calore. Per questo lavoro, è necessario utilizzare un laser a stato solido 488 nm per l'illuminazione (Figura 1), anche se la lunghezza d'onda può essere selezionata per soddisfare un fluoroforo particolare o sperimentare. Un fattore critico è che la lunghezza d'onda laser corrispondono all'intervallo di lavoro 2D-EOD, che è determinata principalmente dalla piastra di onda tra i due deflettori (Figura 1: W2). Il laser di 488 nm efficacemente può eccitare il verde o gialla fluorescente proteine (GFP/YFP), che sono comuni tag fluorescente in esperimenti di cellule vive.</li>
		<li>Regolare l'altezza del fascio laser e la direzione utilizzando una coppia di specchi dielettrici (Figura 1: M). Assicurarsi che il raggio laser è parallelo alla tabella ottica e regolare a un'altezza adeguata. Nota: L'altezza dovrebbe essere scelto sulla base della piattaforma di microscopio. Questa altezza deve essere mantenuta per tutte le successivi specchi utilizzati nel presente protocollo, anche se non sarà esplicitamente indicato.</li>
		<li>Collimare il fascio con un paio di lenti (Figura 1: L1 e L2). Le lunghezze focali delle lenti dovrebbe essere scelta con attenzione per evitare il punto laser ritagliato dal diaframma di 2D-EOD. Ritaglio è evidente da un cambiamento della forma del fascio laser dopo aver attraversato il 2D-EOD. La qualità di collimazione qui è molto importante perché aberrazioni saranno amplificate mediante successivi lenti e qualsiasi divergenza si deteriora le prestazioni della deflessione 2D-EOD. Idealmente, collimare il fascio mettendo a fuoco il fascio a un punto di almeno 20 m di distanza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posizionare un foro stenopeico (Figura 1: PH) di dimensioni adeguate al fuoco del primo obiettivo di collimazione (Figura 1: L1).<ol>
		<li>Scegliere un foro stenopeico di dimensione appropriate. La dimensione del foro stenopeico può essere scelto in base al seguente calcolo: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Dove λ è la lunghezza d'onda del laser, f è la lunghezza focale della lente prima, e D è il diametro del fascio di input.</li>
		<li>Montare il foro stenopeico su un palco di traslazione 3D in modo che può essere collocato proprio al centro della prima lente di collimazione.</li>
		<li>Regolare la posizione del foro stenopeico. Inserire un misuratore di potenza laser dopo il foro stenopeico e regolare la posizione del foro stenopeico in XYZ per massimizzare la lettura del misuratore di potenza. Se si osserva un anello di diffrazione, bloccarlo con un iride inserito prima il 2D-EOD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installazione di polarizzatore Glan-Thompson<ol>
		<li>Mettere il polarizzatore Glan-Thompson (Figura 1: GP) dopo la seconda lente di collimazione (Figura 1: L2) per pulire la polarizzazione del fascio laser. Ruotare il polarizzatore per trovare la massima trasmissione con il misuratore di potenza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installazione di EODs<ol>
		<li>Utilizzare 2 EODs (Figura 1: EOD1 &#38; EOD2) per deviare il laser nelle direzioni X e Y. Massimizzare la trasmissione laser regolando l'imbardata, beccheggio e altezza di ogni EOD.</li>
		<li>Allineare le due EODs rispetto a altro utilizzando il marcatore di allineamento fornito dal produttore sul lato di ogni deflettore.</li>
		<li>Applicare un modello di test al controller di 2D-EOD per esaminare l'output del EOD. Questo può essere tour il cavaliere del (Figura 2) tramite FPGA descritto di seguito o una semplice sinusoide fornita da un generatore di funzioni. Per prestazioni ottimali, la deflessione da ogni deflettore deve essere parallela alla direzione X o Y della nanopositioner piezo. Questa direzione è dettata dalla direzione angolare i deflettori attorno all'asse di trasmissione. Per ruotare la direzione di deflessione senza spostare il 2D-EOD, posizionare un prisma colomba dopo il 2D-EOD per allineare gli assi di flessione per gli assi di nanopositioner piezo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installazione della piastra di mezza onda<ol>
		<li>Posizionare un piatto semionda (Figura 1: W1) tra il polarizzatore Glan-Thompson (Figura 1: GP) ed il 2D-EOD per allineare il laser in arrivo polarizzazione del fascio con gli assi di deflessione del 2D-EOD. Posto una lunga focale (300mm) dopo il 2D-EOD e posto una fotocamera sCMOS presso il fuoco del laser. Successivamente, accendere l'EOD 2D per generare tour il cavaliere del descritto di seguito (Figura 2). Ruotare la piastra di mezza onda fino a quando si osserva una distribuzione di laser del quadrato in modo uniforme sulla fotocamera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installazione di un fascio spendendo lente coppia e coppia di lente di relè<ol>
		<li>Posto un paio di lenti (Figura 1: L3 e L4) dopo il 2D-EOD per espandere il raggio per riempire l'apertura posteriore dell'obiettivo (Figura 1: OL) e un altro paio di lenti (Figura 1: L5 e L6) per inoltro il piano focale dell'obiettivo del microscopio. Assicuratevi di lasciare abbastanza spazio tra queste due coppie di lenti come la lente di TAG verrà installata tra di loro in un passaggio successivo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installare il filtro dicroico, divisore di fascio 10/90, messa a fuoco lente, APD, obiettivo e filtro di emissione di fluorescenza per completare il percorso di rilevamento.<ol>
		<li>Installare il filtro dicroico (Figura 1: DC) per riflettere il laser verso la lente dell'obiettivo. Allineare il laser per andare dritto attraverso il centro della lente dell'obiettivo utilizzando due iridi sulla parte superiore e inferiore di un tubo di obiettivo a lungo.</li>
		<li>Installare un divisore di fascio 10/90 (Figura 1: BS) da cui il 10% della luce è riflessa per l'imaging da un sCMOS fotocamera (descritta sotto) e il 90% di passa attraverso per l'APD per l'inseguimento.</li>
		<li>Allineare l'APD. Mettere a fuoco il laser su un vetrino coprioggetti la lente dell'obiettivo. Utilizzare la riflessione dal coprioggetto per allineare gli elementi tutti a valle mettendo un vetrino coprioggetto al fuoco oggettivo e controllando l'intensità della lettura APD. Dopo il divisore di fascio, installare l'APD lente di messa a fuoco (Figura 1: L7) seguita da APD su un palco di traslazione 3D. Posizionare la lente in modo tale che la riflessione laser dall'obiettivo passa attraverso il centro della lente.</li></ol></li></ol>La posizione di APD può essere ottimizzata regolando la posizione 3D per massimizzare l'intensità dalla riflessione laser sul vetrino coprioggetti. La posizione di APD è nella posizione ottimale quando una mossa della posizione rivelatore in qualsiasi direzione diminuisce l'intensità.
		<li>Installare un filtro di emissione di fluorescenza longpass (Figura 1: F) prima il divisore di fascio per rimuovere la luce riflessa e sparsa.</li>
	
	
	<li>Installazione della lente TAG<ol>
		<li>Posizionare la lente a TAG tra le due coppie di lenti (tra Figura 1: L4 e L5) come accennato prima ed è mostrata nella Figura 1. Regolare l'imbardata, beccheggio, altezza e posizione laterale in modo che il fascio passa perpendicolarmente attraverso la lente del centro di TAG.</li>
	</ol>
	</li>

2. preparazione del campione.
<ol>
	<li>Preparazione delle particelle fisse<ol>
		<li>Diluire 190 perline fluorescenti nm a ~ 5 × 108 perline/mL in PBS. Aggiungere 400 µ l di soluzione di perline su di un vetrino coprioggetto e montare il supporto del campione della fase piezoelettrica (il volume di perline dipenderà molto il portacampioni; il diametro della camera di supporto del campione utilizzato qui è di 18 mm). Per le perline usate qui, PBS fa sì che le particelle a depositare il coprivetrino.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione delle particelle movimento libero<ol>
		<li>Diluire 110 perline fluorescenti nm a ~ 5 × 108 perline/mL con acqua deionizzata. Aggiungere 400 µ l di soluzione di perline su un vetrino coprioggetto e montare sul supporto del campione della fase piezoelettrica.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. ottimizzare i parametri di verifica dei
<ol>
	<li>Scansione raster fissata particelle<ol>
		<li>Mettere un campione di particelle fisse sul microscopio.</li>
		<li>Accendere il laser, micropositioner controller, controller di nanopositioner di piezo, controllo lenti TAG e controller di EOD. Si noti che l'ordine non è critico. Eseguire il nanopositioner piezo in circuito chiuso.</li>
		<li>Raster esplorare il campione in XYZ utilizzando un programma personalizzato di software scansione (Figura S3, il software disponibile su richiesta da parte degli autori), che spinge il 2D-EOD in tour di un cavaliere (Figura 2), raccoglie i conteggi da APD, spinge il piezo nanopositioner ed esegue il calcolo della posizione (Figura S2). La dimensione del passo è di 40 nm e l'intervallo di scansione è di 2 µm.<ol>
			<li>Per posizionare il vetrino coprioggetto al fuoco dell'obiettivo, rimuovere il filtro di emissione di fluorescenza e utilizzare la riflessione del laser dal coprioggetto per massimizzare l'intensità del segnale in funzione della posizione Z della micropositioner. Dopo aver posizionato il campione al piano focale, riposizionare il filtro di emissione di fluorescenza.</li>
			<li>Aprire il programma di scansione. Impostare l'intervallo di scansione e dimensione del passaggio digitando il numero in 'start', 'fine' e 'passo'. Prima di impostare un grande intervallo di scansione e le dimensioni di passo per individuare una particella (ad esempio, 10 x 10 µm gamma con dimensioni di passaggio 200 nm). Dopo aver trovato la particella, ridurre l'intervallo di scansione e diminuire la dimensione di passaggio (ad esempio, 2 x 2 µm gamma con dimensioni di passo 100 nm). Fare clic sul pulsante 'scansione' per eseguire una scansione 3D raster per trovare la messa a fuoco fluorescente.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Impostazioni di lente di TAG (Vedi anche Figura 3)<ol>
		<li>Scegliere il software di controllo di TAG lente. In sequenza, fare clic su 'connect', 'accendere'.</li>
		<li>Per modificare la fase di uscita dei segnali trigger, è necessario modificare la modalità di trigger di uscita. Prima di cambiare la modalità da 'RGB' a 'Multiplane' e poi cambiare di nuovo. Ora la fase può essere cambiato (Figura 3b).</li>
		<li>Impostare la fase di uscita da 0 °, 90 ° e 270 °. Mentre possono essere utilizzate qualsiasi tre fasi che coprono lo spazio delle fasi, questi tre sono trovati a lavorare bene empiricamente (Figura 3C).</li>
		<li>Selezionare l'impostazione di frequenza Hz 68.500.</li>
		<li>Per trovare la frequenza ottima è spesso necessario cambiare la frequenza di ricerca. Fare clic su 'avanzate', 'impostazioni'. Cambiamento del ' Max. Freq (hertz) ' della colonna 0 da 70.000 Hz a 71.500 Hz. Questo può essere regolato a qualsiasi gamma di frequenza è appropriato. Fare clic su 'Salva calibrazione', 'uscita calibrazione' (figura 3d).</li>
		<li>Per rendere effettiva la nuova taratura, passare la risonanza su un'altra frequenza (ad esempio, 189.150 Hz) e quindi passa l'impostazione di frequenza Hz 68.500 (Figura 3e).</li>
		<li>Modificare l'ampiezza gradualmente al 35%. Fare clic su 'Blocca risonanza'. Dopo la frequenza è bloccata, fare clic su 'Sbloccare risonanza' (Figura 3e). La lente di TAG è pronta per l'uso in questo momento.</li>
		<li>Per calibrare, modificare i parametri che vengono utilizzati nella stima per rendere la posizione stimata uguale alla posizione reale, come mostrato nella Figura 4e, f. Input la scansione intervallo di x, y e z e quindi fare clic su 'scansione' pulsante per esplorare il campione in XYZ per spostare il delle particelle attraverso il movimento spot laser. La posizione della particella come questa viene analizzata attraverso il fuoco del laser deve concordare con la posizione stimata della particella determinata dal ciclo di stima di posizione (Figura S1). Il rapporto tra la posizione stimata e la reale posizione (Figura 4D) possa essere estratti dalle immagini posizione stimata (Figura 4f). Se non si accettano le posizioni, regolare i valori di posizione del laser (ck) utilizzato nel ciclo di stima di posizione (Figura S1).</li>
		<li>Allineare la lente TAG<ol>
			<li>Quando il controllo di lenti di TAG è disattivata, il raster scannerizzate delle particelle (descritta sotto) prelevati prima di installare la lente di TAG e dopo l'installazione prodotto TAG lente dovrebbe essere identico. Successivamente, eseguire dello stack fluorescente particella Z scansione spostando l'obiettivo con il nanopositioner di z per ottimizzare la posizione e l'angolazione dell'obiettivo di TAG (Figura 4). Regolare la posizione della lente TAG finché non ci sarà nessuna deriva nelle immagini delle particelle nel piano XY lungo la direzione Z, che è raggiunta quando non c'è alcun cambiamento nella posizione XY della particella in funzione della posizione Z (Figura 4D). Il sistema di tracciamento è pronto all'uso dopo l'allineamento dell'obiettivo TAG.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installazione della macchina fotografica di sCMOS per il monitoraggio delle particelle<ol>
		<li>Installare una telecamera sCMOS per visualizzare le particelle mentre che vengono monitorati. Installare il sCMOS solo dopo che tutti i componenti del sistema di rilevamento sono stati installati e ottimizzati.</li></ol></li></ol>Caricare un campione fisso delle particelle fluorescenti sul microscopio ed eseguire il programma di monitoraggio per bloccare una particella nel volume focale obiettivo. Quindi, installare la lente di lunghezza focale 100 mm (Figura 1: L8) e sCMOS. Regolare la posizione di sCMOS in modo che l'immagine della particella è focalizzata sul posto più piccolo e più brillanti.
	
	

4. Real-Time Tracking 3D liberamente diffondere le nanoparticelle
<ol>
	<li>Mettere il 110 nm libero movimento campione di particelle sul microscopio.</li>
	<li>Accendere il laser, micro-posizionatore controller, controller di nanopositioner di piezo, controllo lenti TAG e controller di EOD. Eseguire il nanopositioner piezo in anello aperto. Impostare il software di lente di TAG secondo punto 3.2.</li>
	<li>Aprire ed eseguire il software di monitoraggio (disponibile su richiesta da parte degli autori). Impostare la posizione di parametri di stima i valori ottimizzati, che trovate nella sezione 3.</li>
	<li>Per posizionare il vetrino coprioggetto al fuoco dell'obiettivo, rimuovere il filtro di emissione di fluorescenza e utilizzare la riflessione del laser dal coprioggetto per massimizzare l'intensità del segnale in funzione della posizione Z della micropositioner. Dopo aver trovato il vetrino coprioggetto, aumentare la messa a fuoco posizione 15 µm per mettere a fuoco il laser lontano il vetrino coprioggetto e nella soluzione. Riposizionare il filtro di emissione di fluorescenza.</li>
	<li>Impostare le costanti di controllo integrale. Le costanti di controllo integrale possono essere impostate a partire da un valore basso e aumentando lentamente fino a quando le oscillazioni possono essere visto in letture di posizione della particella. Una volta si osservano oscillazioni, è possibile impostare le costanti di controllo integrale all'80% del valore causando le oscillazioni. Valori tipici sarà di circa 0,012 per il 'guadagno integrale' XY e 0,004 per Z 'guadagno integrale'.</li>
	<li>Impostare le soglie di rilevamento in «Soglia di pista» e «Track minimo» e iniziare l'esperimento di rilevamento facendo clic su 'Cerca' e 'Auto Track'. La soglia per il rilevamento di terminazione è impostata leggermente superiore al livello di sfondo e la soglia per l'innesco di rilevamento è circa due volte superiore rispetto allo sfondo. Qui, la soglia per l'innesco di rilevamento è 3kHz e la soglia per terminare la traiettoria è 1,5 kHz.</li>
</ol>

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<li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li>
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<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Anche se molte varietà di 3D singola particella metodi di monitoraggio sono emerse negli ultimi anni, robusto tracking in tempo reale di diffusione 3D ad alta velocità al prezzo di conteggio basso del fotone con un semplice programma di installazione è ancora una sfida, che limita la sua applicazione al biologico importante problemi. Il metodo 3D-DyPLoT descritto in questo protocollo indirizzi queste sfide in vari modi. In primo luogo, le vie di eccitazione e di rilevamento vengono semplificate notevolmente rispetto a...

L'emergere di tecniche avanzate di imaging ha aperto una finestra per vedere la struttura sempre più dettagliata dei fenomeni cellulari, tutta la strada fino al livello molecolare. Metodi quali stocastici ricostruzione ottica microscopia (tempesta)1,2,3, foto-attivata localizzazione microscopia (PALM)4,5,6,7 , strutturato illuminazione microscopia (SIM)8,9,10,11e stimolato emissione svuotamento microscopia (STED)12,13, 14 vanno ben oltre il limite di diffrazione per consegnare un dettaglio senza precedenti nella struttura e nella funzione delle cellule vive. Tuttavia, la comprensione completa di come questi sistemi si comportano richiede informazioni dinamiche, nonché informazioni strutturali. I metodi di Super-risoluzione sopra elencati implicano un compromesso tra la risoluzione spaziale e temporale ad alta risoluzione, limitando la precisione temporale con cui possono essere sondati processi dinamici. Un metodo che fornisce sia alta precisione spaziale e temporale ad alta risoluzione è RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Qui, abbiamo una distinzione tra tradizionale 3D-SPT30 e RT-3D-TSS. tradizionale 3D-SPT richiede semplicemente una serie temporale di dati di immagine tridimensionale (che possono essere acquistati o utilizzando un microscopio confocale o un microscopio a epifluorescenza Data la configurazione giusta). In tradizionale 3D-SPT, le coordinate della particella sono determinate dopo la raccolta dei dati di individuazione della particella in ogni serie di immagini e concatenando le posizioni in volumi successivi a creare una traiettoria. Per questi metodi, l'ultima risoluzione temporale è determinata dal tasso di imaging volumetrico. Per microscopi confocali, questo è facilmente sulla scala dei secondi per decine di secondi. Per i metodi epifluorescenza, in cui il percorso ottico viene manipolato in modo che le informazioni di posizione assiale possono essere estratte, la risoluzione temporale è limitata con il tempo di esposizione o della lettura di fotocamera. Questi metodi di epifluorescente sono limitati nella gamma sopra cui assiale informazioni possono essere raccolte, anche se recenti progressi nella fase di Fourier aereo maschere design e ottica adattiva è allungabile questi intervalli di 10 µm o più31,32 , 33 , 34.
Al contrario, RT-3D-SPT non si basa su l'acquisizione di una serie di immagini 3D e trovare particelle dopo il fatto. Invece, informazioni sulla posizione in tempo reale viene estratta tramite rivelatori di singolo punto e feedback viene applicato in modo efficace "bloccare" la particella nel volume focale della lente dell'obiettivo attraverso l'uso di una fase piezoelettrico highspeed. Questo consente la misura continua della posizione della particella limitata solo da quanti fotoni possono essere raccolti. Inoltre, questo metodo consente spettrale interrogatorio della particella che si muove su lunghi tragitti. RT-3D-SPT in effetti funziona simile a una forza-libero ottica trappola per oggetti su scala nanometrica, in cui la particella è continuamente sondata e misurata in tempo reale senza la necessità di alimentazioni grandi laser o ottico le forze. Dato che RT-3D-SPT fornisce un mezzo per l'interrogatorio continuo di oggetti veloce diffusivo (fino a 20 µm2/s)25,29 in tre dimensioni a basso fotone conteggio tariffe20,29, 35, dovrebbe fornire una finestra in processi biologici veloci o transitori come trasporto cargo intracellulare, legame ligando-recettore e la dinamica extracellulare dei virions singolo. Tuttavia, a questo punto, l'applicazione di RT-3D-SPT è stato limitato per la manciata di gruppi di lavoro per far progredire questa tecnologia.
Una barriera è la complessità del layout ottico richieste dai metodi RT-3D-SPT, che sono di vario tipo. Per la maggior parte dei metodi, il feedback ottico è fornito da una fase piezoelettrica. Come il particella fa piccoli movimenti in X, Y, o Z, letture da singolo punto rilevatori vengono convertite in funzioni di errore e alimentato a ad alta velocità per un nanopositioner piezoelettrico, che a sua volta muove il campione per contrastare efficacemente il movimento della particella, bloccandola rispetto alla lente dell'obiettivo. Per misurare piccoli movimenti posizionali in X, Y e Z, o più rivelatori (4 o 5 a seconda dell'implementazione)15,18,21 o punti multipli dell'eccitazione (2-4, il più basso dei quali può essere applicato se una amplificatore di lock-in è utilizzato per estrarre X e posizione Y utilizzando un rotante laser spot)25,28 vengono applicate. La sovrapposizione di questi punti di rilevamento ed emissione multipli rendono difficile allineare e mantenere i sistemi.
Qui, presentiamo un metodo ad alta velocità 3D destinazione-bloccato-SPT con un design ottico semplificato denominato 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT utilizza un 2D-EOD e un TAG lente36,37,38 per spostare dinamicamente un punto laser focalizzato attraverso il volume focale obiettivo ad un ritmo elevato (50 kHz XY, 70 kHz Z). La posizione di messa a fuoco del laser e l'orario di arrivo del fotone la combinazione consente la posizione della particella 3D di ottenere rapidamente anche a tassi di conteggio basso del fotone. 2D-EOD spinge il fuoco del laser di un cavaliere tour modello39 con un quadrato di 1 x 1 µm nel piano X-Y e la lente di TAG si sposta il fuoco del laser in direzione assiale con una gamma di 2-4 µm. La posizione di particelle 3D si ottiene con una posizione ottimizzata stima algoritmo29,40 in 3D. Il controllo del 3D in modo dinamico movimento laser spot, fotone contando dal fotodiodo a valanga (APD), calcolo della posizione in tempo reale delle particelle, fase piezoelettrico feedback e registrazione dei dati vengono eseguite su un allineamento di cancello programmabile del campo (FPGA).In questo protocollo, descriviamo come costruire un microscopio 3D-DyPLoT passo dopo passo, compreso l'allineamento ottico, calibrazione con particelle fisse e finalmente libero il rilevamento di particelle. Come dimostrazione, perline fluorescenti di 110 nm sono stati monitorati continuamente in acqua per minuti alla volta.
Il metodo qui descritto è la scelta ideale per qualsiasi applicazione dove si desidera monitorare continuamente una sonda fluorescente veloci a bassi livelli di luce, tra cui virus, nanoparticelle e vescicole come gli endosomi. Contrariamente ai metodi precedenti, c'è solo una singola eccitazione e via sola rilevazione, rendendo semplice l'allineamento e la manutenzione. Inoltre, l'area di rilevamento grande consente questo microscopio raccogliere facilmente diffondere rapidamente le particelle, mentre la possibilità di monitorare a livello di segnale basso (fino a 10 kHz) rende questo metodo ideale per applicazioni di basso-luce29.

<table><tbody><tr><td>2D Electro-optic Deflector&amp;nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 required</td></tr><tr><td>Power supply for EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td></tr><tr><td>TAG&amp;nbsp; Lens</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Used to deflect laser along axial direction</td></tr><tr><td>XY piezoelectric nanopositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Z piezoelectric nanoposiitoner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td></tr><tr><td>Micropositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Used to coarsely position sample and evaluate</td></tr><tr><td>Objective Lens</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Used to monitor the particle&#039;s position</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Lower dark counts beneficial</td></tr><tr><td>Field programmable gate array</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Tracking excitation laser</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarizer</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Half-wave plate</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Dichroic Mirror</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>DC</td></tr><tr><td>Fluorescence Emission Filter</td><td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

Particelle singole tridimensionale in tempo reale (RT-3D-SPT) di rilevamento ha il potenziale per far luce sui processi veloci, 3D in sistemi cellulari. Anche se vari metodi di RT-3D-SPT sono state presentate negli ultimi anni, alta velocità inseguimento 3D diffondente particelle al prezzo di conteggio basso fotone rimane una sfida. Inoltre, configurazioni di RT-3D-SPT sono generalmente complessi e difficili da implementare, limitando la loro diffusa applicazione a problemi biologici. Questo protocollo presenta un sistema di RT-3D-SPT denominato 3D dinamico del fotone localizzazione Tracking (3D-DyPLoT), che permette di monitorare le particelle con diffusiva ad alta velocità (fino a 20 µm2/s) al prezzo di conteggio basso fotone (fino a 10 kHz). 3D-DyPLoT si avvale di un deflettore di elettro-ottica 2D (2D-EOD) e una lente sintonizzabile sfumatura acustica (TAG) all'unità un singolo focalizzato punto dinamicamente in 3D laser. In combinazione con un algoritmo di stima della posizione ottimizzata, 3D-DyPLoT può agganciare di singole particelle con inseguimento ad alta velocità e precisione di localizzazione alta. Grazie alla singola eccitazione e la struttura dei percorsi sola rilevazione, 3D-DyPLoT è robusto e facile da configurare. Questo protocollo viene descritto come costruire 3D-DyPLoT passo per passo. In primo luogo, è descritto il layout ottico. Successivamente, il sistema è calibrato e ottimizzato da raster di scansione una perlina fluorescente di 190 nm con la nanopositioner piezoelettrico. Infine, per dimostrare la capacità di tracciatura in tempo reale 3D, perline fluorescenti di 110 nm sono tracciati in acqua.

Particella fissa scansione (Figura 4) e liberamente diffondente 110 nm fluorescente particella di rilevamento (Figura 5) sono stati effettuati seguendo il protocollo di cui sopra. La particella di scansione è stata eseguita spostando i fotoni piezoelettrici nanopositioner e bin mentre simultaneamente calcolo della particella stimato posizione ad ogni punto nella scansione. L'immagine di scansione mostra un quadrato di intensità...

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A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Questo dettagli del protocollo la costruzione e il funzionamento di un microscopio di rilevamento in tempo reale 3D singola particella capace di rilevamento su scala nanometrica fluorescente sonde ad alta velocità diffusiva e tassi di conteggio basso del fotone.

Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

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Bioengineering

14.8K Views.  Duke University. Questo dettagli del protocollo la costruzione e il funzionamento di un microscopio di rilevamento in tempo reale 3D singola particella capace di rilevamento su scala nanometrica fluorescente sonde ad alta velocità diffusiva e tassi di conteggio basso del fotone.

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Three-dimensional Particle Tracking Velocimetry for Turbulence Applications: Case of a Jet Flow

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic recording of image sequences. The basic components, features, constraints and optimization tips of a 3D-PTV topology consisting of a high-speed camera with a four-view splitter are described and discussed in this article. The technique is applied to the intermediate flow field (5 &#60;x/d &#60;25) of a circular jet at Re &#8776; 7,000. Lagrangian flow features and turbulence quantities in an Eulerian frame are estimated around ten diameters downstream of the jet origin and at various radial distances from the jet core. Lagrangian properties include trajectory, velocity and acceleration of selected particles as well as curvature of the flow path, which are obtained from the Frenet-Serret equation. Estimation of the 3D velocity and turbulence fields around the jet core axis at a cross-plane located at ten diameters downstream of the jet is compared with literature, and the power spectrum of the large-scale streamwise velocity motions is obtained at various radial distances from the jet core.

A three-dimensional particle tracking velocimetry (3D-PTV) system based on a high-speed camera with a four-view splitter is described here. The technique is applied to a jet flow from a circular pipe in the vicinity of ten diameters downstream at Reynolds number Re &#8776; 7,000.

Tridimensionale Velocimetry monitoraggio di particelle per applicazioni Turbulence: caso di flusso Jet

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic ...

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Ingegneria

Preparation and 3D Tracking of Catalytic Swimming Devices

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence microscopy. One commonly deployed method for catalytically active colloids to produce enhanced motion is via an asymmetrical distribution of catalyst. Here this is achieved by spin coating a dispersed layer of fluorescent polymeric colloids onto a flat planar substrate, and then using directional platinum vapor deposition to half coat the exposed colloid surface, making a two faced "Janus" structure. The Janus colloids are then re-suspended from the planar substrate into an aqueous solution containing hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide serves as a fuel for the platinum catalyst, which is decomposed into water and oxygen, but only on one side of the colloid. The asymmetry results in gradients that produce enhanced motion, or "swimming". A fluorescence microscope, together with a video camera is used to record the motion of individual colloids. The center of the fluorescent emission is found using image analysis to provide an x and y coordinate for each frame of the video. While keeping the microscope focal position fixed, the fluorescence emission from the colloid produces a characteristic concentric ring pattern which is subject to image analysis to determine the particles relative z position. In this way 3D trajectories for the swimming colloid are obtained, allowing swimming velocity to be accurately measured, and physical phenomena such as gravitaxis, which may bias the colloids motion to be detected.

A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

Preparazione e 3D tracking di catalitici nuoto Devices

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Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

Microscopia di tracciamento a singola molecola - Uno strumento per determinare gli stati diffusivi delle molecole citosoliche

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Biochimica

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

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Bioingegneria

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method allows for tuning the speeds in situ without the need to manufacture new samples to reach different desired speeds. Moreover, this method enables the dynamic control of speed. Cycling the temperature leads the fluids to flow fast and slow, periodically. This controllability is based on the Arrhenius characteristic of the kinesin-microtubule reaction, demonstrating a controlled mean flow speed range of 4&#8211;8 &#181;m/s. The presented method will open the door to the design of microfluidic devices where the flow rates in the channel are locally tunable without the need for a valve.

The goal of this protocol is to use temperature to control the flow speeds of three-dimensional active fluids. The advantage of this method not only allows for regulating flow speeds in situ but also enables dynamic control, such as periodically tuning flow speeds up and down.

Controllo delle velocità di flusso dei fluidi attivi 3D basati su microtubuli utilizzando la temperatura

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Tracciamento delle particelle sensibili alla massa per caratterizzare la dinamica delle macromolecole associate alla membrana

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Elaborazione di protocollo per l'analisi della diffusione e dimensione dei Cluster di recettori di membrana mediante microscopia a fluorescenza

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Immunologia e infezioni

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

<meta charset="utf8"></head><body>Tracciamento di particelle 3D per l'analisi non invasiva in vivo della dinamica dei microtubuli sinaptici nei dendriti e nelle giunzioni neuromuscolari di Drosophi

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Tracciamento di particelle 3D per l'analisi non invasiva in vivo della dinamica dei microtubuli sinaptici nei dendriti e nelle giunzioni neuromuscolari di Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella

Riepilogo

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Tracciamento delle particelle sensibili alla massa per caratterizzare la dinamica delle macromolecole associate alla membrana

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Tracciamento di particelle 3D per l'analisi non invasiva in vivo della dinamica dei microtubuli sinaptici nei dendriti e nelle giunzioni neuromuscolari di Drosophila

Tracciamento di particelle 3D per l'analisi non invasiva in vivo della dinamica dei microtubuli sinaptici nei dendriti e nelle giunzioni neuromuscolari di Drosophila